Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".
5. Методы концентрирования вирусов из воды
различного назначения
В данном разделе представлены современные методы концентрирования
вирусов из воды, предназначенные для качественной или количественной
оценки вирусного загрязнения. Перечень методов и область применения
представлены в табл. 1.
Таблица 1
ОБЪЕМ ПРОБ, УСЛОВИЯ И ПЕРИОДИЧНОСТЬ ОТБОРА ПРОБ ВОДЫ ВОДНЫХ
ОБЪЕКТОВ НА ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
| N | Вид водного | Объем исследуемой воды, показания к | Методы |
|п/п| объекта | проведению и кратность анализа при | концентрирования |
| | | контроле: | |
| | |-------------------------------------------------------------------------------| |
| | | плановом | внеплановом | внеплановом - по | производственном - | |
| | | | - по | санитарно - | в соответствии с | |
| | | | экстренным | эпидемическим | рабочей программой | |
| | | | показаниям | показаниям, по | | |
| | | | | согласованию с ТУ | | |
| | | | | Роспотребнадзора | | |
|---|------------------|--------------------|----------------|--------------------|--------------------|---------------------|
|1 | Чистая вода: | | | | | |
|---|------------------|--------------------|----------------|--------------------|--------------------|---------------------|
| | а) питьевая | 10 л - | 10 - 50 л | 10 и | 10 - | Ионообменная смола. |
| | | 1 раз в | | 1000 л | 50 л | Мембранная |
| | | квартал | | | | фильтрация. |
| |------------------|--------------------|----------------|--------------------|--------------------| Двухэтапный метод. |
| | б) подземных | 10 л - 1 раз в | 10 - 50 л | 10 и | 10 - | Ловушечное |
| | источников | квартал | | 1000 л | 50 л | устройство |
| |------------------|--------------------|----------------|--------------------|--------------------| |
| | в) плавательных | по согласованию с | 10 - 50 л | 10 и | 10 - | |
| | бассейнов | ТУ | | 1000 л | 50 л | |
| | | Роспотребнадзора | | | | |
|---|------------------|--------------------|----------------|--------------------|--------------------|---------------------|
|2 | Вода | | | | | Адсорбционный метод |
| | поверхностных | | | | | (МПС). Ионообменная |
| | водоемов: | | | | | смола. Мембранная |
|---|------------------|--------------------|----------------|--------------------|--------------------|---------------------|
| | а) источник | 10 л - 1 раз в | 10 л | 10 л | 10 л | фильтрация. |
| | водоснабжения | квартал | | | | Двухэтапный метод |
| |------------------|--------------------|----------------|--------------------|--------------------| |
| | б) рекреационные | 1 раз в месяц с | | | | |
| | воды | мая по сентябрь | | | | |
|---|------------------|--------------------|----------------|--------------------|--------------------|---------------------|
|3 | Сточные воды | 1 л - 1 раз в | 1 - 5 л | 1 - 5 л | 1 - 5 л | Двухфазный метод. |
| | после очистки и | месяц в | | | | Адсорбционный метод |
| | обеззараживания | контрольном створе | | | | (МПС). Ионообменная |
| | | | | | | смола |
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Выбор того или иного метода в практике контроля вирусного
загрязнения определяют эпидемической ситуацией в регионе, задачами
региональных планов по снижению заболеваемости кишечными вирусными
инфекциями, уровнем оснащенности лабораторий.
Все работы, связанные с концентрированием и выделением вирусов,
проводят с соблюдением правил эпидемиологической безопасности, в
соответствии с нормативными документами: санитарно-эпидемиологическими
правилами СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I -
II групп патогенности (опасности)", санитарными правилами СП
1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп
патогенности и гельминтами".
5.1. Метод концентрирования вирусов с использованием фильтрующих
мембран
5.1.1. Область применения.
Метод используют для концентрирования вирусов из питьевой воды
различных видов (водопроводной, бутылированной, из родников и др.),
воды подземных водоисточников, воды из бассейнов и других чистых вод.
Объем исследуемой воды составляет 10 л. При необходимости объем воды
может быть увеличен. Время концентрирования данным методом из 10 л
составляет в среднем 1,5 - 2,5 ч. Для концентрирования используют
фильтрующие мембраны из нитроцеллюлозы типа ФМНЦ, ФМПА и мембраны
микропористые капроновые (ММК) или другие, равные по эффективности.
5.1.2. Подготовка мембранных фильтров.
Фильтрующие мембраны должны быть подготовлены к анализу в
соответствии с указаниями организации-изготовителя
(листовка-аннотация, сопровождающая фильтры). Перед исследованием
фильтрующие мембраны смачивают стерильной водопроводной водой в
стерильной емкости.
5.1.3. Подготовка фильтровального аппарата.
Для фильтрования исследуемой воды используют установку, например,
типа АФ-142 "К" или другую с аналогичными характеристиками, которая
состоит из фильтродержателя, емкости на 10 и более литров для
исследуемой воды и ее последующей фильтрации и устройства,
нагнетающего жидкость.
Перед фильтрацией фильтродержатель протирают ватным тампоном,
смоченным спиртом ректификованным 70%, и обжигают. После охлаждения на
нижнюю часть фильтродержателя кладут стерильным пинцетом влажный
мембранный фильтр, предварительно смоченный в стерильной водопроводной
воде. Затем фильтр прижимают верхней частью фильтродержателя и
закрепляют зажимами, равномерно завинчивая последние со всех сторон.
5.1.4. Фильтрование воды.
Исследуемый объем воды наливают в напорную емкость, крышку
тщательно закрепляют зажимами, включают подачу давления (1,5 - 2,0
бара), после чего воду направляют в фильтродержатель со скоростью
около 100 мл/мин. и фильтруют через мембрану. При использовании для
концентрирования мембран, например, типа ФМНЦ, в исследуемую воду
добавляют хлористый магний до конечной концентрации 0,05 М или
хлористый алюминий до конечной концентрации 0,0005 М для увеличения
сорбционной способности мембраны. При использовании фильтров ММК
хлористый магний не добавляют.
5.1.5. Элюция сконцентрированных вирусных частиц.
Элюцию вирусов с мембран проводят 20 мл элюента с соблюдением
всех правил эпидемической безопасности (перчатки, маска, спецодежда и
т.д.) в ламинарном боксе. После окончания фильтрования откручивают
зажимы и снимают верхнюю часть фильтродержателя. Мембрану осторожно
приподнимают за край пинцетом, стерилизованным путем обжигания и
переносят в стерильную емкость, соответствующую диаметру мембраны
(может быть использована тарелка, чашка Петри диаметром не менее 142
мм и др.). Затем на поверхность мембраны наносят 10 мл элюента (3%
бифэкстракт на трисбуфере с рН 9,1 - 9,5) и стерильной пипеткой с
целым концом проводят механический смыв (соскабливанием и струей)
вируса с поверхности мембраны в течение нескольких минут. К концу
манипуляции мембрана должна приобрести первоначальный вид. Полученный
элюат переносят в стерильный флакон. Затем на эту же мембрану наносят
второй объем (10 мл) того же элюента и проводят вторичное смывание
вирусов струей с обеих сторон мембраны, и вторую часть элюата помещают
в тот же флакон, что и первую. Затем рН полученного элюата доводят до
7,0 - 7,5 1 N раствором соляной кислоты.
5.1.6. Обработка проб.
Для удаления бактериальной микрофлоры элюат подвергают обработке
одним из двух методов: обработкой хлороформом или фильтрацией через
стерилизующие мембраны.
5.1.6.1. При использовании хлороформа его добавляют в элюат (1 мл
на 10 мл элюата), интенсивно встряхивают 10 мин. и центрифугируют 10
мин. при 2000 об./мин. для разделения фаз. Водную фазу (верхнюю)
аккуратно отбирают пипеткой в стерильный флакон, добавляют 100 МЕ/мл
пенициллина и 10,0 мг/мл стрептомицина.
5.1.6.2. При использовании стерилизующих насадок с фильтрами 0,22
мкм элюат пробы переносят в стерильный шприц объемом 5 - 20 мл с
установленной фильтрующей насадкой и поршнем шприца продавливают в
стерильный флакон. Этот способ позволяет избежать использования
антибиотиков, токсичного хлороформа и связанных с этим мер
безопасности, не требует длительного встряхивания и центрифугирования.
5.1.7. Хранение проб.
Стерильные элюаты хранят до испытания при 4 град.С не более 24 ч.
При температуре -20 град.С их можно хранить в течение 1 года. При
необходимости многократного исследования элюат делят на несколько
порций, чтобы избежать повторного замораживания.
5.2. Метод концентрирования вирусов с использованием ионообменных
смол
5.2.1. Область применения.
Метод рекомендуется для концентрирования вирусов из чистых вод,
воды поверхностных водоемов и сточных вод. Объем проб для исследования
определенного вида воды представлен в табл. 1.
5.2.2. Подготовка ионообменной смолы.
Подготовку ионообменных смол (аниониты АВ-17-8, АВ-17-8-чс)
осуществляют следующим образом: сухую смолу замачивают в течение 2 -
3-х суток в дистиллированной воде. Затем воду сливают и смолу
обрабатывают смесью равных объемов свежеприготовленных растворов 2%
соляной кислоты и 10% хлорида натрия из расчета 1 л смеси на 100 г
смолы. Продолжительность контакта 24 ч. После этого смолу отмывают
дистиллированной водой до нейтрального рН 7,0.
5.2.3. Концентрирования вирусов из проб воды.
Перед концентрированием рН исследуемой пробы воды доводят до
значений 5,5 - 6,0 путем добавления концентрированной соляной кислоты.
Для осуществления концентрирования стеклянную бюретку (колонку)
диаметром 1,2 - 1,5 см, к нижнему концу которой присоединен резиновый
шланг с завинчивающимся зажимом, устанавливают в штативе строго
вертикально. На дно колонки помещают небольшой слой стекловаты для
удержания смолы. В колонку вносят суспензию смолы, удаляя через нижний
резиновый шланг избыток воды. Заполнение колонки следует проводить
тщательно, избегая образования пузырьков воздуха в столбике смолы.
Высота столбика смолы должна быть 10 - 12 см.
Емкость с пробой воды располагают выше колонок, в нее опускают
стерильный резиновый шланг с битой пипеткой на конце. С другой стороны
шланга должна быть резиновая пробка с отверстием для прохождения воды.
Через резиновый шланг с пробкой на конце воду подают в колонку,
закрывая ее пробкой. Винтовым зажимом на нижнем шланге регулируют
подачу воды через смолу, создавая скорость 10 - 12 мл в минуту.
5.2.4. Элюция вирусов с ионообменной смолы
После окончания концентрирования (примерно через 16 - 18 ч, при
исследовании 10 л) осуществляют элюцию вирусов со смолы 0,5 М
раствором фосфатного буфера с рН 8,2. Для этого в колонку вносят 10 мл
фосфатного буфера, интенсивно встряхивают и оставляют в горизонтальном
положении в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем элюат
переносят в стерильный флакон и доводят до рН 7,2 1 М раствором
соляной кислоты.
Приготовление 0,5 М фосфатного буфера с рН 8,2.
Готовят навески солей: Na HPО 2Н О - 89,0 г (раствор А) и
2 4 2
КН РО - 68,06 г (раствор В). Каждую навеску вносят в отдельную мерную
2 4
колбу, добавляют дистиллированную воду до объема 1 л и растворяют
соли. Для получения буфера с рН 8,2 смешивают 96,9 мл раствора А и 3,1
мл раствора В и одним из этих растворов доводят рН буфера до 8,2.
5.2.5. Обработка проб (см. п. 5.1.6).
5.2.6. Хранение проб (см. п. 5.1.7).
5.3. Двухэтапный метод концентрирования вирусов (сорбция на
ионообменной смоле и осаждение с помощью сульфата аммония)
5.3.1. Область применения.
Метод рекомендуется для концентрирования вируса гепатита А и
энтеровирусов из проб питьевой воды и воды водоисточников. Объем проб
может колебаться от 10 до 50 л.
5.3.2. I этап. Концентрирование и элюция вируса гепатита А и
энтеровирусов из проб воды при помощи сорбции на ионообменной смоле.
В качестве сорбента используют смесь, состоящую из ионообменной
смолы АВ-17-8 (подготовленной в соответствии с п. 5.2.2) и гидроксида
алюминия, которой заполняют стеклянную бюретку (колонку) диаметром 36
- 38 мм и длиной 250 - 300 мм. Колонка должна иметь в нижней части
впаянную перегородку из пористого стекла (стеклянный фильтр Шотта N 2)
и резиновый шланг, присоединенный к нижнему концу колонки. После
установки колонки в штативе в нее вносят ионообменную смолу (высота
столбика смолы должна составлять не менее 30 - 40 мм) и навеску
гидроксида алюминия (8 - 10 г).
Исследуемую пробу воды в бутылях или канистре подкисляют с
помощью соляной кислоты до рН 3,0 - 4,5, располагают выше колонки и
через резиновую трубку с пробкой для колонки подают воду в колонку,
регулируя скорость прохождения с помощью винта на резиновой трубке,
присоединенной к нижнему концу колонки. Скорость прохождения воды
через колонку должна составлять 10 - 15 мл/мин.
После прохождения исследуемой воды через колонку нижний резиновый
шланг перекрывают и осуществляют элюцию вируса с адсорбента при помощи
0,05 М глицинового буфера с рН 11,5, который вносят в колонку в объеме
100 мл. Адсорбент в колонке и элюент тщательно перемешивают и
выдерживают в течение 10 - 15 мин. Затем элюат удаляют из колонки
через нижний резиновый шланг и с помощью глицинового буфера с рН 1,5
устанавливают рН элюата на уровне 7,0 - 8,0.
Приготовление глицинового буфера с рН 11,5.
Навеску 0,385 г аминоуксусной кислоты растворяют в 100 мл
дистиллированной воды и получают глицин. К 50 мл глицина добавляют 50
мл 0,1 N раствора гидроксида натрия и получают глициновый буфер с рН
11,5.
Для приготовления глицинового буфера (рН 1,5 - 1,6) к 38 мл
глицина добавляют 62 мл 0,1 N раствора соляной кислоты.
5.3.3. II этап. Вторичное концентрирование антигена и
энтеровирусов - осаждение с помощью сульфата аммония.
Вторичное концентрирование (осаждение) вирусов проводят на
холоде. Для этого к элюату дробно (в течение 20 - 30 мин.) добавляют
1/2 объема насыщенного раствора сульфата аммония ((NH ) SO ),
4 2 4
тщательно перемешивают и оставляют на ночь. Утром смесь центрифугируют
в течение 1 ч при 5 - 6 тыс. об./мин. Супернатант сливают, а осадок
растворяют в 1 - 2 мл физиологического раствора с рН 7,2 - 7,4.
При необходимости концентрат делят на 2 части, одну из которых
исследуют на наличие антигена ВГА, другую подвергают антибактериальной
обработке в соответствии с п. 5.1.6 и используют для заражения
тканевых культур с целью выделения энтеровирусов.
Приготовление насыщенного раствора сульфата аммония.
В 1 л теплой стерильной дистиллированной воды (30 - 35 ёС)
растворяют 800 г сульфата аммония ((NH ) SO ). Полученный раствор
4 2 4
фильтруют, доводят до рН 7,2 и охлаждают в холодильнике.
5.3.4. Хранение проб (см. п. 5.1.7).
5.4. Метод концентрирования вирусов с использованием двухфазного
разделения
Метод рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ)
"Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде",
ВОЗ, 2003.
5.4.1. Область применения.
Метод концентрирования двухфазным разделением используют для
индикации вирусов из 1 л очищенных и неочищенных сточных вод.
5.4.2. Подготовка реактивов (для 2-х проб по 1 л).
5.4.2.1. 22% декстран (по весу) - 40 г декстрана Т 40, 142 мл
стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную
мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при 4 град.С.
5.4.2.2. 29% ПЭГ 6000 (по весу) - 363 г ПЭГ 6000 и 888 мл
стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную
мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при 4 град.С. Раствор
можно автоклавировать (15 мин. при 45 град.С).
5.4.2.3. 150 мл (примерно) 5 М NaCl.
5.4.2.4. 1 N NaOH и 1 N HCL для установки рН.
5.4.3. Концентрирование пробы по 0,5 л.
5.4.3.1. Пробу центрифугируют в течение 10 мин. при 1000 g.
Надосадочную жидкость переносят из пробирок в колбу Эрленмейра
емкостью 1 л, осадок хранят при 4 град.С.
5.4.3.2. Доводят рН надосадочной жидкости до нейтрального уровня
(7,0 - 7,5) 1 N раствором NaOH и измеряют конечный объем надосадочной
жидкости.
5.4.3.3. К 500 мл надосадочной жидкости добавляют 39,5 мл 22%
раствора декстрана, 287 мл 29% раствора ПЭГ 6000 и 35 мл 5 N раствора
NaCl. Тщательно перемешивают и выдерживают 1 ч при температуре 4 ёС
при непрерывном встряхивании или перемешивании, используя прибор
горизонтального встряхивания или магнитную мешалку.
5.4.3.4. Для каждой пробы подготавливают стерильную коническую
делительную воронку и закрепляют ее в штативе. Смазывают скользящие
поверхности кранов, но так, чтобы не закрыть в них отверстие.
Проверяют плотность кранов небольшим количеством воды. Смесь,
приготовленную по п. 5.4.3.3, переливают в воронку и оставляют на ночь
при 4 ёС.
5.4.3.5. Утром осторожно открывают кран воронки, медленно
выпускают жидкость и собирают нижний ее слой и промежуточную фазу в
стерильную пробирку (обычно 5 - 10 мл от каждой пробы объемом 0,5 л.).
5.4.3.6. В полученную жидкость (п. 5.4.3.5) вносят осадок (п.
5.4.3.1), добавляют хлороформ (20% от объема образовавшейся взвеси) и
встряхивают в течение 1 мин. Центрифугируют, отбирают верхнюю водную
фазу в стерильную пробирку и добавляют антибиотики (пенициллин G или
отечественный аналог и стрептомицин до конечной концентрации 100 МЕ/мл
и 100 мг/мл соответственно).
5.4.3.7. Помещают 1 мл полученного концентрата в холодильник с
температурой -20 или -70 град.С для сохранения (при необходимости
дальнейшего исследования). Остаток концентрата исследуют на наличие
вирусов на культурах тканей, РНК-методом ОТ-ПЦР и антигена - методом
ИФА.
5.5. Метод концентрирования вирусов с помощью флизелиновых
пакетов с макропористым стеклом
5.5.1. Область применения.
Метод (качественный) используют для концентрирования вирусов из
воды поверхностных водоемов, сточной воды. Время концентрирования
вирусов должно составлять 3 - 7 суток.
5.5.2. Подготовка макропористого стекла (МПС) <*>.
--------------------------------
<*> Можно использовать готовые стандартные наборы, разрешенные к
применению в Российской Федерации в установленном законодательством
порядке.
Для повышения сорбционных свойств макропористого стекла,
представляющего собой белый порошок, его обрабатывают следующим
образом: один объем стекла заливают в колбе одним объемом смеси (1:1)
3% раствора Н О и 6 М раствора HCl и кипятят в вытяжном шкафу в
2 2
течение 1 ч без пробки, соблюдая меры предосторожности. Отмывают
большим количеством дистиллированной воды до нейтрального значения рН
и высушивают при 100 град.С.
В пакет из флизелина размером 5 х 7 см помещают 3,0 см
подготовленного сорбента.
5.5.3. Концентрирование вирусов.
Пакет с сорбентом закрепляют с помощью лески за неподвижный
предмет так, чтобы он оказался в токе воды. После экспозиции в течение
3 - 7 суток пакет вынимают, помещают в отдельный новый полиэтиленовый
мешочек или стерильный флакон и доставляют в лабораторию в
сумке-холодильнике в максимально короткий срок (не более 6 ч). Каждую
пробу маркируют с указанием точки отбора, датой установки и времени
экспозиции пакета. До обработки пробы можно хранить не более суток при
4 град.С.
5.5.4. Элюция вирусов с МПС.
Пакет с сорбентом извлекают из транспортировочной емкости и
помещают в стерильную чашку Петри. Обрезают край пакета, вымывают
стекло дистиллированной водой (5 мл) с помощью пипетки в эту же чашку
Петри и переносят пипеткой или через воронку в колонку объемом 5 - 10
мл. Вирусы элюируют ступенчато тремя растворами по 3 мл каждый,
собирая фракции в отдельные пенициллиновые флаконы. Исследованию
подвергают каждую фракцию в отдельности (всего 3 фракции). В качестве
элюирующих растворов используют: 1) 0,05 М трис-НС1 рН 9,1; 2) 0,05 М
трис-HCl рН 9,1 и 0,5 М NaCl; 3) 3% мясной экстракт на 0,05 М трис-HCl
рН 9,1.
5.5.5. Обработка проб (см. п. 5.1.6).
5.5.6. Хранение проб (см. п. 5.1.7).
5.6. Метод концентрирования вирусов с использованием набора для
сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды с помощью
ловушечного устройства.
Ловушечное устройство состоит из насадки на водопроводный кран, к
которой с помощью синтетической трубки прикреплен держатель. В
держатель, состоящий из двух свинчивающихся частей с резьбой,
вставляется специальная ловушка, внутри которой находится адсорбент,
сорбирующий вирусы из воды. Применяемая ловушка является одноразовой,
а само устройство может использоваться после стерилизации многократно
в соответствии с прилагаемой инструкцией.
5.6.1. Область применения.
Метод используют для концентрирования вирусов из водопроводной
воды.
5.6.2. Подготовка ловушечного устройства и фильтрование воды.
Перед использованием в ловушечное устройство вставляют ловушку,
после чего его заворачивают в бумагу для стерилизации и стерилизуют
сухим жаром при температуре 80 град.С 45 мин. Ловушечное устройство с
вставленной ловушкой доставляют на место отбора в стерильной упаковке.
После трехкратного обжигания водопроводного крана и спуска воды в
течение 15 мин. устанавливают необходимую скорость ее протекания - 1 л
за ~ 1,5 мин., что составляет 40 - 45 л/ч. Ловушечное устройство
извлекают из стерильной упаковки и устанавливают его на кран. Объем
пропускаемой воды должен составить 1000 л, что достигается при
скорости тока воды 40 - 45 л/ч в течение 24 ч. Спустя 24 ч ловушечное
устройство снимают с крана и помещают в стерильный пакет, который
доставляют в вирусологическую лабораторию. После извлечения ловушки
использованное ловушечное устройство подвергают обеззараживанию в 3%
растворе перекиси водорода в течение 12 ч, затем многократно (не менее
10 раз) промывают в проточной воде и высушивают для последующей
стерилизации и повторного использования.
5.6.3. Элюция сконцентрированных вирусных частиц.
Ловушку с адсорбентом в стерильных условиях извлекают из
ловушечного устройства и помещают в чашку Петри. С помощью ножниц
ловушку вскрывают, содержащийся внутри адсорбент вымывают в чашку
Петри стерильной дистиллированной водой в объеме 5 - 10 мл. Полученную
взвесь адсорбента в дистиллированной воде переносят с помощью пипетки
с отпиленным концом в стеклянную колонку. Вытекающую из колонки воду
собирают в стерильный пенициллиновый флакон. Элюцию вирусов
осуществляют с помощью специального элюента, содержащегося в наборе.
Для получения рабочего раствора концентрат разводят стерильной
дистиллированной водой в соотношении 1:10 (объем элюента/объем воды).
Вирус элюируют путем пропускания 3 мл элюента через адсорбент в
колонке. Полученную фракцию (элюат) собирают в стерильный
пенициллиновый флакон.
Использованный адсорбент заливают 3% раствором перекиси водорода
для обеззараживания на 12 ч.
С целью увеличения эффективности обнаружения вирусов в элюатах
проб воды при исследовании методом ПЦР (обнаружение РНК энтеровирусов)
и ИФА (обнаружение антигенов энтеровирусов) проводят дополнительное
концентрирование элюатов с помощью ультрацентрифугирования либо
обрабатывают элюаты полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000).
5.6.3.1. Ультрацентрифугирование элюата.
Ультрацентрифугирование проводят при 40000 - 50000 g в течение 2
ч с использованием угловых или бакет-роторов. В стерильную
центрифужную пробирку наливают вируссодержащий элюат, а затем с
помощью шприца на дно пробирки наслаивают 10 - 20% раствор сахарозы
так, чтобы она занимала 5 - 10% от объема пробирки. После
центрифугирования супернатант удаляют. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл
стерильной дистиллированной воды для ПЦР-исследований или в
фосфатно-солевом твинсодержащем буфере (рН 7,2) для ИФА.
5.6.3.2. Обработка элюата полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000).
В элюат добавляют ПЭГ 6000 и хлористый натрий, находящийся
непосредственно в пробирках для центрифугирования, до конечных
концентраций 10% и 0,5 М соответственно. Смесь тщательно перемешивают
до растворения ПЭГ и затем выдерживают в течение 10 - 12 ч при 4 ёС.
Образовавшуюся суспензию центрифугируют при 10000 g в течение 1 ч или
при 6000 g в течение 2 ч. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют
в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды для ПЦР-исследований или в
фосфатно-солевом твинсодержащем буфере (рН 7) - для ИФА.
5.6.4. Обработка проб (п. 5.1.6).
5.6.5. Хранение проб (п. 5.1.7).
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".