Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".
6. Методы выделения энтеровирусов в культурах клеток
Исследование полученных элюатов на энтеровирусы проводят в
культуре ткани в соответствии с документом "Руководство по
вирусологическим исследованиям полиомиелита", рекомендованным
Всемирной организацией здравоохранения (1998). При этом следует
отметить, что для выделения вирусов используют максимально возможный
полученный элюат (кроме 1 мл, заложенного на хранение, и объема,
используемого для исследования в ИФА и ПЦР). Для выделения вирусов
используют следующие культуры тканей: RD, Hep-2, BGM и другие
чувствительные к энтеровирусам линии клеток.
Перевиваемые культуры клеток RD, Hep-2 (Cincinnatti), BGM
наиболее пригодны для проведения лабораторных исследований и позволяют
выделять достаточно широкий спектр энтеровирусов, которые могут
присутствовать в водных объектах окружающей среды.
Культура клеток RD, происходящая из человеческой рабдомиосаркомы,
обладает высокой чувствительностью к вирусам полиомиелита, многим
типам вируса ECHO, некоторым вирусам Коксаки А. Вирусы полиомиелита и
вирусы Коксаки В хорошо размножаются в культуре клеток Нер-2,
полученной из эпидермоидной карциномы человека. Культура клеток BGM -
перевиваемая культура клеток почек африканской зеленой мартышки -
чувствительна к вирусам полиомиелита и вирусам Коксаки В.
Использование, по крайней мере, двух культур позволяет выявлять,
возможно, больший спектр вирусов, а комбинация клеток, обладающих
различной чувствительностью к различным энтеровирусам, может помочь
при идентификации выделенного цитопатогенного агента. Чрезвычайно
полезным является поддержание и использование в лабораторных
исследованиях культуры клеток L20B. Эта культура клеток создана на
основе мышиной линии L-клеток, в которую экспрессированы человеческие
рецепторы к полиовирусу. Она позволяет селективно выделять только
полиовирусы, что делает ее незаменимой культурой при идентификации
выделенных цитопатогенных агентов для разделения смесей вирусов.
Чувствительность культур клеток к различным энтеровирусам представлена
в табл. 2.
Таблица 2
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК К РАЗЛИЧНЫМ
ЭНТЕРОВИРУСАМ
------------------------------------------------------------------
|Вирусы | Проявление цитопатогенного эффекта |
| | на культуре клеток |
|-------------------|--------------------------------------------|
| | RD | Нер-2| BGM | L20B |
|-------------------|------------|------|------|-----------------|
|Полиомиелита 1 - 3 | + | + | + | + |
|-------------------|------------|------|------|-----------------|
|ECHO | + | - | +/- | - |
| | | | + | |
|-------------------|------------|------|------|-----------------|
|Коксаки А | +/-, за | - | - | +/- (Коксаки А |
| | исключением| | | 2 - 6, 8, 10, |
| | А1, А19, | | | 14) |
| | А22 | | | |
|-------------------|------------|------|------|-----------------|
|Коксаки В | - | + | + | - |
|-------------------|------------|------|------|-----------------|
|Энтеровирусы 68 - | +/- | - | - | - |
|71 | | | | |
------------------------------------------------------------------
+ - наличие цитопатогенного эффекта;
- - отсутствие его;
+/- - может быть.
Культуры клеток для лабораторного исследования следует получать
из аттестованного источника, например, из лаборатории, обладающей
банком клеток. Необходимо периодически контролировать чувствительность
используемых в лаборатории клеток. Для этого после каждых 8 - 10
пассажей клеток на них проводят титрование референс-штаммов вакцинного
вируса полиомиелита. После 15 - 20 последовательных пассажей следует
перейти на свежую линию из банка клеточных культур или получить ее в
референс-лаборатории. Эта процедура позволяет сохранять высокую
чувствительность клеток и снижает риск контаминации клеток
микоплазмами.
Для исследования одной пробы используют не менее двух культур
клеток площадью не менее 75 кв. см. Это соответствует трем флаконам
емкостью 50,0 мл (поверхность каждого флакона составляет 25 кв. см).
Два из этих флаконов должны быть с культурой клеток RD, один - с любой
другой из рекомендованных культур. Флаконы со свежеобразованным
монослоем клеток микроскопируют для того, чтобы убедиться в здоровом
состоянии клеток. Монослой клеток, подходящий для заражения, обычно
формируется в течение 2 - 3 дней после "посадки" клеток на флаконы при
6
концентрации клеток 1 х 10 мл ростовой среды. После замены ростовой
среды на 4,5 мл поддерживающей среды (без сыворотки) флаконы маркируют
(указывают номер пробы, дату заражения, номер пассажа). В каждый
флакон вносят по 0,5 мл обработанной исследуемой пробы воды. Все
используемые клеточные линии следует инокулировать одновременно.
Обязательно оставляют по 1 незараженному контрольному флакону каждой
культуры. Флаконы инкубируют в термостате при температуре 36 град.С.
Ежедневно, обычно в течение 5 - 7 дней, проверяют культуры на наличие
цитопатогенного эффекта (ЦПЭ). Все признаки ЦПЭ, токсичности,
контаминации посторонними микроорганизмами регистрируют в лабораторном
журнале. При появлении ЦПЭ (при охвате изменениями 75% клеточного
монослоя) прекращают инкубацию флаконов и сохраняют культуральную
жидкость при 20 град.С для следующего пассажа на той же культуре
клеток. Содержимое каждого флакона с культурой клеток пассируют
индивидуально, флаконы никогда не объединяют. Для пассажа могут быть
использованы культуры, выращенные в пробирках. Если при первичном
заражении не наблюдали ЦПЭ, то делают так называемый "слепой" пассаж.
Культуры, в которых не проявлялся ЦПЭ, инкубируют и наблюдают в
течение не менее 14 дней. При отсутствии ЦПЭ в течение этого срока
культуры отбрасывают как негативные.
При хорошем состоянии культуры клеток первичное заражение и один
пассаж вместе составляют период наблюдения 14 дней. В ряде случаев
(например, при выделении агента с низкой цитопатогенной активностью,
или при наличии в пробе вируса в небольшом количестве) необходимо
сделать последующие пассажи. При этом следует помнить, что каждый
последующий пассаж увеличивает риск перекрестной контаминации.
При выделении вирусов из проб воды различного происхождения в
культуре клеток можно столкнуться с рядом нежелательных явлений. Если
при первичном заражении в культуре клеток развивается быстрая (в
течение 1 - 2 дней после внесения исследуемого субстрата) дегенерация
клеток, то, скорее всего, это связано с неспецифической токсичностью
пробы. Такие культуры нужно заморозить при -20 град.С, оттаять и
выполнить пассаж. Если признаки токсичности обнаружатся вновь, то
следует вернуться к исходной пробе, развести ее ФСБ 1:10 и повторить
заражение. Бактериальная контаминация, которая проявляется в виде
помутнения среды, приводит к гибели клеток и делает выявление
вирусного ЦПЭ затруднительным или невозможным. В этом случае следует
вернуться к исходной пробе, обработать ее хлороформом и повторить
процедуры заражения.
Особое внимание следует уделять предупреждению перекрестной
вирусной контаминации во время процедур заражения и пассирования.
Нельзя сливать среду через край флакона или пробирки, в которые
вносилась исследуемая проба, даже если ЦПЭ отсутствует. Удаление среды
производят пипеткой, которую меняют после каждой процедуры. При
заражении с помощью автоматических микропипеток используют только
наконечники с фильтрами. Следует избегать процедур, при которых
образуются аэрозоли (например, энергичное пипетирование); по
возможности не рекомендуется использование посуды с резиновыми
пробками, которые помещаются внутрь горлышка флакона или пробирки,
целесообразно использовать посуду с внешней резьбой на горлышке,
которая закрывается завинчивающимися крышками.
Известно, что в пробах воды присутствуют смеси вирусов, с чем
могут быть связаны затруднения при идентификации выделенных изолятов.
Для разделения смесей и правильной идентификации выделенных вирусов, а
также для того, чтобы избежать потери вирусов полиомиелита, все
изоляты, "положительные" на культуре клеток RD, следует пассировать на
клетки L20B. Наличие выраженного ЦПЭ указывает на присутствие в пробе
вируса полиомиелита. Некоторые реовирусы, аденовирусы, а также
неполио-энтеровирусы могут проявлять ЦПЭ на клетках L20B и затруднять
идентификацию выделенных изолятов и интерпретацию результатов
исследования. Такие изоляты следует направить в соответствующую
референс-лабораторию для заключительного исследования.
В лабораторной практике часто используют метод адсорбции
исследуемого материала на клеточном монослое. При использовании этого
метода из флакона/пробирки удаляют ростовую среду, ополаскивают
монослой стерильным ФСБ, вносят исследуемую пробу и инкубируют флакон
при температуре 36 град.С в течение 1 ч. Таким образом, создают лучшие
условия для адсорбции вируса клетками, если он присутствует в пробе.
После истечения срока инкубации в каждый флакон/пробирку вносят
необходимое количество поддерживающей среды. Применение этого метода
может способствовать выявлению вируса при его незначительных
количествах в исследуемом материале, а также ускорить проявление ЦПЭ,
по крайней мере, на 1 сутки. Следует иметь ввиду, что при
использовании этого метода, в результате дополнительных открываний
крышек, во много раз возрастает вероятность контаминации (перекрестной
вирусной или бактериальной). Его рекомендуется проводить в ламинарном
шкафу. Ввиду высокого риска контаминации этот метод не следует
использовать для пассирования или инокуляции изолятов вирусов.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".