МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Методика. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 18.11.05 МУК 4.2.2029-05

7. Идентификация цитопатических агентов,
                  выделенных в реакции нейтрализации

     В основе  идентификации выделенных цитопатических агентов (ЦПА) в
реакции  нейтрализации  лежит  взаимодействие  исследуемого  вируса  с
гомологичной   антисывороткой   (или  смесью  антисывороток),  которая
нейтрализует вирус,  что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на культуре
клеток.  Обычно  в опыте нейтрализации вирусную суспензию,  содержащую
100 ТЦД  , смешивают с диагностическими сыворотками. После инкубации в
       50
течение 1 - 2 ч при 37 град.С эту смесь соединяют с культурой  клеток.
Опыт  ежедневно  просматривают  под  микроскопом  в течение не менее 3
дней.  Иммунная  сыворотка,  которая   предотвращает   развитие   ЦПЭ,
указывает тип вируса.
     При постановке   реакции   нейтрализации   необходимо   соблюдать
несколько важнейших положений.
     Для идентификации ЦПА всегда используют ту  культуру  клеток,  на
которой они были выделены. Если ЦПА был выделен в нескольких культурах
клеток,  то следует провести идентификацию каждого штамма. Это связано
с  тем,  что  в  пробах воды могут содержаться смеси энтеровирусов,  а
чувствительность клеточных культур к различным энтеровирусам различна.
     В опыте  необходимо  использовать разведение испытуемого изолята,
содержащее 100 ТЦД . Для того чтобы определить необходимое разведение,
                  50
проводят   предварительное   титрование   выделенного   ЦПА.   Опытные
лаборатории,    использующие    культуры    клеток    со    стабильной
чувствительностью,   могут  избежать  этой  процедуры.  Известно,  что
суспензия вируса, полученная на культуре, где цитопатогенные изменения
                                                            6
поражают 75 - 100% клеточного монослоя, содержит примерно 10    ТЦД  .
                                           -3    -4               50
Поэтому в  опыте  используют  разведения 10  и 10 . Это экономит время
исследования и материалы, необходимые для предварительного титрования.
Однако   контрольное  титрование  исследуемого  изолята  рекомендуется
включать в каждый опыт по идентификации. Это позволяет рассчитать титр
вируса в условиях данного опыта.
     Реакцию  нейтрализации  проводят  в панелях для культуры клеток с
плоским   дном   (микрометод).   Микрометод  позволяет  экономить  все
компоненты, необходимые для постановки опыта, однако при недостаточном
опыте возникает опасность перекрестной лабораторной контаминации.
     Титрование  вирусов,  а  также  постановку  реакции нейтрализации
выполняют в соответствии с документом "Руководство по вирусологическим
исследованиям полиомиелита".