Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".
8. Выявление РНК кишечных вирусов (вируса гепатита А,
ротавирусов, энтеровирусов) методом полимеразной цепной
реакции с этапом обратной транскрипции
Организация и постановка полимеразной цепной реакции с этапом
обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) для выявления РНК энтеровирусов,
ротавирусов и вируса гепатита А из концентратов проб воды
поверхностных, подземных источников, питьевой и сточных вод может быть
осуществлена в лабораториях, оснащенных необходимым оборудованием.
8.1. Меры предосторожности и правила работы при постановке
полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции
Организацию работы в ПЦР-лаборатории осуществляют в соответствии
с документом "Методические рекомендации по проведению работ в
диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной
реакции", утв. Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического
надзора Российской Федерации 22 июня 1995 года.
8.1.1. Лабораторию разделяют на зоны (комнаты) для каждой из
стадий ПЦР-диагностики.
Следует иметь не менее двух комнат:
- пре-ПЦР-помещение, где проводят обработку образцов из объектов
окружающей среды (элюаты), выделение нуклеиновых кислот, приготовление
реакционной смеси для ПЦР и постановку ПЦР (при наличии условий два
последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном
отдельном помещении). В этих помещениях не допускается проводить все
другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ,
ИФА, другие диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностику которых
проводят в данной лаборатории;
- пост-ПЦР-помещение, где проводят детекцию продуктов
амплицификации. В пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие
методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной
лаборатории.
8.1.2. Помещение для детекции продуктов амплификации
(пост-ПЦР-помещение) располагают как можно дальше от
пре-ПЦР-помещений,
8.1.3. Работу в лаборатории организовывают в одном направлении:
от пре-ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению.
8.1.4. При исследовании материала, зараженного или
подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний
I - IV групп, работу проводят в соответствии с
нормативно-методическими документами.
8.1.5. Используют одноразовую пластиковую посуду.
8.1.6. Работают в одноразовых перчатках.
8.1.7. Перчатки и халаты меняют при переходе из одной зоны в
другую.
8.1.8. Поверхности столов, а также помещения, в которых проводят
постановку ПЦР, до начала и после окончания работ обеззараживают
ультрафиолетовым излучением.
8.1.9. Для работы в ПЦР-лаборатории допускается персонал,
прошедший специальную подготовку.
8.2. Меры предосторожности и правила работы при постановке
электрофореза
Реагент бромистый этидий является сильным мутагеном, поэтому все
манипуляции проводят с использованием перчаток. Все реагенты,
содержащие бромистый этидий, перед утилизацией подвергают специальной
обработке.
Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую
емкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5
М раствора калия перманганата и один объем 2,5 М соляной кислоты.
Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4 - 6
ч. Добавляют один объем 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно
перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию.
8.3. Контроль полимеразной цепной реакции
Положительный (ПКО) и отрицательный (ОКО) контрольные образцы
используют для контроля специфичности ПЦР. В качестве ПКО используют
любой штамм энтеровирусов, ротавирусов и вируса гепатита А для
выявления соответствующих возбудителей. В качестве ОКО используют
стерильную воду, не содержащую вирусной РНК.
8.4. Выявление РНК ротавирусов и вируса гепатита А
Метод ОТ-ПЦР используют для выявления РНК вирусных агентов в
исследуемых пробах воды. Исследованию подлежат элюаты проб питьевой
воды, воды подземных водоисточников, речной и сточных вод. Для
выделения РНК из концентратов проб питьевой воды и воды подземных
водоисточников применяют метод афинной сорбции РНК на частицах
силикагеля в соответствии с документом "Методические рекомендации по
проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод
полимеразной цепной реакции", утв. Госкомсанэпиднадзором 22 июня 1995
года (для выделения РНК рекомендуется использовать готовые комплекты,
например, типа "Амплисенс" и др.).
Для выделения РНК из концентратов проб воды поверхностных
водоисточников и сточных вод необходимо применять метод двустадийного
выделения <*>:
- фенол-хлороформная экстракция;
- сорбция РНК на частицы силикагеля.
--------------------------------
<*> Проводят в соответствии с методическими указаниями МУ
1.3.1888-04 "Организация работы при исследовании методом ПЦР
материала, инфицированного патогенными биологическими агентами 3 - 4
группы патогенности".
8.5. Постановка реакции обратной транскрипции, проведение
полимеразной цепной реакции и электрофоретический анализ продуктов
полимеразной цепной реакции с этапом обратной
транскрипции-амплификации (ОТ-ПЦР-амплификации)
Рекомендуется использовать ПЦР-тест-системы на вирус гепатита А и
ротавирусы с электрофорезом в агарозном геле (кат. N V4-50-R0,5;
V4-50-R0,2; V15-50-R0,5; 15-50-R0,2), разрешенные к применению для
этих целей в Российской Федерации в установленном законодательством
порядке.
8.6. Обнаружение энтеровирусов методом полимеразной цепной
реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) с использованием
культуры ткани для выявления репликативной "минус" нити РНК
энтеровирусов
Для подтверждения инфекционности выделенных энтеровирусов
проводят первичное заражение элюатом культуры клеток, через двое суток
после культивирования зараженных клеток проводят ОТ-ПЦР с
культуральной жидкостью при наличии ЦПД или с лизатом клеток культур
тканей при отсутствии ЦПД. Суть методики состоит в выявлении с помощью
ПЦР негативной минус цепи ("-" цепи) РНК энтеровирусов после их
культивирования в культуре ткани. Негативная цепь является
промежуточным продуктом репликации вируса, и ее обнаружение служит
косвенным доказательством потенциальной инфекционности вируса.
Для проведения ОТ-ПЦР следует использовать не менее двух культур
клеток, учитывая их чувствительность к различным типам энтеровирусов.
Рекомендуется использовать следующие сочетания клеточных культур: BGM
и Нер-2 или Нер-2 и RD. В пробирках (пенициллиновых флаконах) с хорошо
сформированным клеточным монослоем заменяют ростовую среду на
поддерживающую с 1 - 2% сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого
скота и добавлением антибиотиков: пенициллина в дозе до 1000 МЕ/мл и
стрептомицина в дозе до 200 мкг/мл. При культивировании клеток в
2
инкубаторе без содержания СО , рекомендуется для стабилизации рН в
синтетические среды добавлять Hepes (25 мМ).
Маркируют пробирки (по 2 на каждую исследуемую пробу), вносят в
каждую по 0,1 мл элюата и помещают в термостат (36,5 - 37,0 ёС). Для
контроля оставляют по несколько пробирок с незараженной культурой (со
сменой и без смены среды).
Инкубируют зараженные клетки в течение 5 суток, микроскопируя их
ежедневно для контроля начала цитопатического действия. При первых
признаках деградации культуры (но не позднее 5-х суток) пробирки
извлекают из термостата, удаляют из них культуральную среду и
промывают физраствором (или раствором Хенкса). После промывки
тщательно (пипеткой) удаляют из пробирок остатки промывной жидкости.
Перед началом процедуры выделения РНК пробирки с культурой ткани,
освобожденной от промывной жидкости, трижды подвергают замораживанию
при -20 град.С и размораживанию при 37 град.С, что обеспечивает выход
энтеровирусов из клеток культуры, после чего переходят к выделению
РНК.
8.6.2. Выделение РНК.
Выделение РНК можно осуществлять с использованием стандартных
наборов в соответствии с инструкцией производителя, например, типа
"Рибозоль", "Рибосорб" и др. РНК можно хранить в течение 1 месяца в
изопропаноле при -20 град.С. Для длительного хранения к раствору РНК
добавляют два объема 70% этанола и помещают для хранения в морозильную
камеру (при -70 град.С).
8.6.3. Обратная транскрипция.
8.6.3.1. Праймерные последовательности.
Праймерные последовательности можно синтезировать под заказ в
организациях-производителях. Для постановки ИКК-ПЦР необходимо
специально синтезировать 1 энтеровирусспецифический праймер,
используемый на стадии обратной транскрипции (последовательность
указана в табл. 3).
Таблица 3
--------------------------------------------------------------------------
|На каком этапе | Название | Последовательность |
|используется | | |
|----------------------|---------------|---------------------------------|
|Обратная транскрипция | НП1 (прямой) | 5`-CGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAA-3`|
--------------------------------------------------------------------------
Праймеры, необходимые для проведения ПЦР, входят в состав готовой
стандартной тест-системы.
8.6.3.2. Расчет рабочих концентраций праймеров.
Поставку праймеров производителем осуществляют в количествах,
измеряющихся в оптических единицах (ОЕ) на мл. Для расчета рабочих
концентраций праймеров необходимо перевести ОЕ в мкМ. Для праймера
длиной А пар нуклеотидов (п.н.), поставляемом в количестве В ОЕ,
пересчет осуществляют следующим образом:
- определяют молекулярную массу (ММ) одноцепочечной ДНК (оцДНК)
по формуле:
ММ = 330 дальтон (ММ 1 п.н.) х А;
- определяют концентрацию праймера, исходя из того, что 1 ОЕ
оцДНК соответствует концентрации 37 мкг/мл, соответственно В ОЕ
соответствуют концентрации 37 х В мкг/мл;
- определяют концентрацию праймера С в мкМ:
С = (37 х В х 1000) / (330 х А) (мкМ).
Ряд организаций - производителей обратной транскриптазы в
инструкциях по постановке реакции обратной транскрипции указывают не
концентрацию праймеров в мкМ, а количество праймера, добавляемое в
реакцию (в pmol). В этом случае пересчет ОЕ в pmol следует производить
по формуле:
D = B / (0,01 х А),
где D - количество праймера (в pmol), содержащееся в 1 мкл
раствора.
8.6.3.3. Постановка реакции обратной транскрипции.
Для обратной транскрипции можно использовать готовые стандартные
наборы реагентов, разрешенные к применению для этих целей в Российской
Федерации в установленном порядке. В состав наборов входят буферный
раствор и фермент - обратная транскриптаза (ревертаза) различного
происхождения. Ингибитор РНКаз и смесь ДНТФ некоторые производители
поставляют отдельно. Все компоненты реакционной смеси для обратной
транскрипции можно приобретать по отдельности.
Постановка:
- в 0,2 мл (или 0,5 мл) пробирки вносят: 10,0 - 14,5 мкл РНК
пробы, 10 - 20 pmol прямого праймера НП1;
- смесь аккуратно перемешивают, осаждают центрифугированием (5 с
при 5000 об./мин. или с использованием вортекса) и помещают в
термоциклер на 70 ёС 10 мин.;
- по истечении времени нагревания пробирки достают и помещают на
лед;
- в пробы добавляют: 5х или 10х буфер для обратной транскрипции
(конечная концентрация - 1х), 1 мкл ДНТФ (100 - 200 мкМ), обратную
транскриптазу (100 - 200 ед.), ингибитор РНКаз (20 ед.). Общий объем
реакционной смеси составляет 20 мкл. Объем реакционной смеси при
необходимости доводят с помощью свободной от РНКаз воды;
- смесь перемешивают, осаждают центрифугированием и выдерживают
при комнатной температуре 10 - 15 мин.;
- пробирки помещают в термоциклер и выдерживают 50 мин. при 37 -
42 ёС (время и температуру, необходимые для работы фермента, указывают
в инструкции производителя).
После синтеза кДНК на РНК матрице пробы используют для
ПЦР-амплификации.
8.6.3.4. Полимеразная цепная реакция.
Амплификацию полученной в реакции обратной транскрипции кДНК
осуществляют с использованием тест-системы для амплификации участка
кДНК энтеровирусов длиной 207 п.н. (кат. N V-16-100-R0,5 или кат. N
V-16-100-R0,2) в соответствии с прилагаемой инструкцией.
8.6.4. Анализ амплифицированной ДНК, учет результатов.
Для анализа амплифицированной ДНК используют разные методы,
наиболее простым из которых является гель-электрофорез. Для постановки
электрофореза можно использовать комплект стандартных реагентов для
электрофореза в агарозном геле (кат. N К5-200) в соответствии с
инструкцией производителя.
Учет результатов проводят визуально с помощью трансиллюминатора.
При этом агарозный гель либо достают из кюветы и помещают на стекло
трансиллюминатора, либо используют емкости из УФ-проницаемых
материалов.
При постановке ОТ-ПЦР для выявления в пробе "минус" цепи РНК
энтеровирусов, положительные образцы должны содержать полосу ДНК
размером 207 п.н. Размер полосы определяют по соотношению с
положительным контролем и ДНК-маркером. Результаты можно
документировать посредством фотографирования или видеосъемки геля с
использованием ультрафиолетовых фильтров.
8.6.5. Интерпретация результатов, полученных с использованием
культур тканей методом ОТ-ПЦР.
Выявление негативной РНК ("минус" цепи РНК) энтеровирусов в пробе
исследуемой воды с помощью ОТ-ПЦР зараженных культур клеток
свидетельствует о присутствии в ней инфекционных энтеровирусов и
интерпретируется как положительный результат молекулярного теста на
инфекционность энтеровирусов.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".