3.3.1. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА. ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИННЫМ ШТАММАМ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Не задано. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 12.02.07 МУ 3.3.1.2161-07

5.6. Определение количества Т-лимфоцитов
                        цитотоксическим тестом

     Цитотоксический тест - это иммунологическая реакция,  позволяющая
выявить  антигены,   расположенные   на   поверхности   жизнеспособных
лимфоцитов.  Основной принцип метода заключается в том,  что антитела,
направленные против  различных  лимфоцитарных  антигенов,  фиксируются
специфически  на  клетках,  содержащих  эти антигены,  и в присутствии
комплемента  нарушают  целостность  клеточной  мембраны.   Образование
"отверстия"  в  мембране  лимфоцитов  позволяет прибавленному к взвеси
красителю (трипановый синий) проникать внутрь клетки и окрашивать  ее.
Жизнеспособные   с  интактной  мембраной  клетки  этим  красителем  не
окрашиваются.
     Коммерческую поликлональную    сыворотку    против   Т-лимфоцитов
разводят средой 199 до рабочей концентрации,  указанной на этикетке. В
центрифужной пробирке или в лунке панели смешать 60 мкл сыворотки,  20
                                                  7
мкл исследуемой  взвеси  лимфоцитов  (концентрация 10 кл./мл) и 20 мкл
комплемента морской свинки в разведении 1:3.  В  контрольные  пробирки
                                                          7
или лунки вносят 20 мкл взвеси лимфоцитов (концентрация 10 кл./мл), 20
мкл взвеси комплемента и  60  мкл  среды  199.  Смеси  перемешивают  и
инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 2) град.С в течение 25
- 30 мин.  В каждую пробирку или лунку  добавляют  по  1200  мкл  0,5%
раствора  трипанового  синего  (500  мг  красителя растворяют в 100 мл
горячего 80 - 90 град.С 0,9%-го раствора хлорида натрия;  перемешивают
10 мин. на магнитной мешалке и фильтруют через фильтровальную бумагу).
Через 30 - 60 с взвесь из лунки помещают в счетную камеру.  Определяют
число  погибших  клеток,  вычисляют  их  процент  от общего количества
клеток в  препарате,  подсчитывают  цитотоксический  индекс  (ЦТИ)  по
формуле:

            % убитых клеток в опыте - % убитых клеток в контроле
ЦТИ = 100 х ----------------------------------------------------.
                     100 - % убитых клеток в контроле

     ЦТИ указывает,  какой процент  клеток  среди  исследуемой  взвеси
несет соответствующий антигенный маркер и,  следовательно, принадлежит
к данной популяции.