3.3.1. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА. ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИННЫМ ШТАММАМ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Не задано. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 12.02.07 МУ 3.3.1.2161-07

5.9. Определение фагоцитарной активности макрофагов

     Фагоцитарная активность     (ФА)      определяется      процентом
фагоцитирующих клеток и количеством захваченных частиц на один фагоцит
(фагоцитарное число - ФЧ).
     Клетки перитонеального  экссудата  (КПЭ)  выделяют асептически от
морских свинок опытной и контрольной групп. Делают разрез по срединной
линии  передней  брюшной  стенки  и  осторожно  отсепаровывают  кожный
лоскут,  не  нарушая  целостности   брюшины.   Через   прокол   иглой,
соединенной  со  шприцом,  в  брюшную  полость вводят 20 мл среды 199,
содержащей 5 МЕ гепарина в 1 мл.  Осторожно массируют переднюю брюшную
стенку. Через 3 - 5 мин. через надрез в брюшине пастеровской пипеткой,
соединенной с резиновой грушей,  собирают содержимое и  сливают  через
нейлоновый   фильтр   в  пробирки,  стоящие  на  льду.  Не  используют
экссудаты,  содержащие  примесь  эритроцитов.  Затем  клетки  осаждают
центрифугированием (280 +/- 20) g при температуре (4 +/- 0,5) град.С в
течение (10 +/- 1) мин.,  ресуспендируют в среде 199 с 10%  сывороткой
крупного  рогатого  скота  и  антибиотиками  (100  ед./мл) до конечной
                   6
концентрации 2 х 10 кл./мл. Полученную суспензию клеток разливают по 2
мл  в чашки Петри диаметром 40 мм,  которые инкубируют при температуре
(37 +/- 0,5) град.С в атмосфере с  5%  CO  .  Через  60  мин.  смывают
                                         2
неприлипшие клетки раствором Хенкса, добавляют 2 мл свежей среды 199 и
инкубируют  в  течение  следующих  18  ч  при температуре (37 +/- 0,5)
град.С в атмосфере с 5% CO .
                          2
     Клетки для   исследования  фагоцитоза  можно  получить  также  на
половинках покровных стекол, помещенных в пробирки с 1,5 - 2 мл КПЭ.
     Объектом фагоцитоза     могут    служить    эритроциты    барана,
дрожжеподобные  грибы  Candida   albicans   или   лабораторный   штамм
Staphilococcus  (9198)  или  любые  другие микробные клетки.  Суточные
культуры живых или  убитых  прогреванием  при  температуре  90  град.С
микроорганизмов  отмывают  не  менее  3  раз  0,9%-м  раствором натрия
хлорида,  ресуспендируют в нем и определяют концентрацию суспензии  по
стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85П 10 единиц. Взвесь разводят
средой 199 до концентрации, соответствующей соотношению 1,0  -  2,0  х
  9
10  м.к./мл.
     Эритроциты барана  (ЭБ)  трижды  отмывают 0,9%-м раствором натрия
хлорида рН 7,2,  осаждая центрифугированием  при  (400  +/-  20)  g  в
течение 5 мин. Готовят 0,5%-ю взвесь ЭБ на среде 199.
     В чашки Петри,  содержащие КПЭ,  наливают 1 мл свежей среды 199 и
вносят  по 1 мл 0,5%-й взвеси ЭБ или соответствующих микроорганизмов и
инкубируют при температуре (37 +/- 0,5) град.С в атмосфере с 5%  СО  .
                                                                   2
Через 30 - 60  мин.  чашки  споласкивают  холодным  раствором  Хенкса,
высушивают  при  комнатной  температуре,  фиксируют  в метаноле (или в
смеси Никифорова) или парами 10%-го раствора формалина (5 - 10  мин.),
окрашивают по Романовскому-Гимзе.
     При микроскопии  препаратов  учитывают  не  менее   200   клеток,
подсчитывая  фагоцитирующие  клетки и количество содержащихся в них ЭБ
или микробов.
     Результаты выражают   процентом   фагоцитирующих  клеток  (ФА)  и
фагоцитарным  числом  (ФЧ),  которое   определяется   средним   числом
поглощенных ЭБ или микробов на один фагоцит.
     Процент фагоцитирующих клеток (ФА) рассчитывается по формуле:

     ФА = В х 100 / А,

     где:
     А - общее количество клеток;
     В -  количество  фагоцитирующих  клеток  с  поглощенными  ЭБ  или
микробами.
     Результаты исследований представляют для каждой дозы в таблице:

------------------------------------------------------------------
|   Сутки    |    ФА    |р с контролем|     ФЧ     |р с контролем|
|исследования|          |             |            |             |
|------------|----------|-------------|------------|-------------|
|Контроль    |          |             |            |             |
|------------|----------|-------------|------------|-------------|
|1           |          |             |            |             |
|------------|----------|-------------|------------|-------------|
|3           |          |             |            |             |
|------------|----------|-------------|------------|-------------|
|7           |          |             |            |             |
|------------|----------|-------------|------------|-------------|
|14          |          |             |            |             |
|------------|----------|-------------|------------|-------------|
|28          |          |             |            |             |
------------------------------------------------------------------