Фрагмент документа "3.3.1. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА. ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИННЫМ ШТАММАМ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".
9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЗВРЕДНОСТИ И ОСТАТОЧНОЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ
ИСПЫТУЕМОГО ВАКЦИННОГО ШТАММА НА МОРСКИХ СВИНКАХ
ПО МОРФОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ
Безвредность испытуемых штаммов туляремийного микроба по
морфологическим показателям определяется в экспериментах на морских
свинках при подкожном способе введения.
Степень остаточной вирулентности испытуемого штамма характеризуют
специфические для вакцинального процесса морфологические
(макроскопические и гистологические) изменения, возникающие у морских
свинок в тканях места введения культуры, в регионарных,
контрлатеральных и отдаленных лимфатических узлах, а также во
внутренних органах (печень, селезенка, легкие, почки с надпочечниками,
сердце). Методика вскрытия и исследования морских свинок приведена в
Прилож. 3.
9.1. Испытуемый штамм туляремийного микроба не может быть признан
вакцинным, если он в соответствующих дозах при всех равных условиях
чаще вызывает у морских свинок более выраженные изменения (см. ниже),
чем контрольный вакцинный штамм 15 НИИЭГ.
9.1.1. Испытуемый штамм, введенный морским свинкам в дозах 5 х
7 9
10 и 5 х 10 м.к., вызывает максимальное развитие островоспалительных
изменений примерно к 7-м сут., их стихание с преобладанием
продуктивного компонента - к 14-м сут. и полную резорбцию или
заживление без грубых рубцовых изменений - к концу 30-х сут.
3
9.1.2. При введении культуры в дозе 5 х 10 м.к. сроки нарастания
островоспалительных изменений могут затягиваться до 14 сут., а их
стихание - до 21 - 28 сут.
9.2. При введении морским свинкам культуры безвредного вакцинного
штамма допустимы перечисленные ниже изменения.
9.2.1. Место введения
Макроскопическая картина. При введении культуры вакцинного
3 5 7
штамма в дозах 5 х 10 , 5 х 10 и 5 х 10 м. к. допустимо:
незначительное или умеренное диффузное или очаговое полнокровие
сосудов тканей в остром периоде процесса. При введении культуры в
9
дозе 5 х 10 м.к. преимущественно в остром периоде (5 - 10-е сут.) не
более чем в половине случаев допустимы: участки воспалительного
уплотнения (инфильтраты) размерами до 1,0 х 1,5 см, в единичных
случаях - более крупные; серозный отек мягких тканей бедра и паховой
области в месте введения культуры, но без его распространения на
прилежащие участки (брюшная и грудная стенка, контрлатеральная паховая
область), гнойные очаги и кровоизлияния диаметром до 0,5 см в
диаметре. В единичных случаях (не более 3 животных) допустимы: крупные
кровоизлияния до 1,5 см в диаметре; очаги некроза до 0,5 - 0,7 см в
диаметре; инкапсулированные абсцессы с гнойной полостью до 0,5 см в
диаметре; язвы и свищи с гнойным отделяемым. К 14 - 21-м сут.
воспалительные изменения стихают. К 30-м сут. у отдельных животных
допустимы: незначительные остаточные явления в виде небольших рубцовых
изменений.
5 7
При введении испытуемой культуры в дозах 5 х 10 и 5 х 10 м.к. не
более чем у 1 - 3 свинок допустимы: участки воспалительного уплотнения
(инфильтраты) размерами не более 0,5 - 0,7 см; умеренный серозный отек
тканей бедра и паховой области со стороны введения испытуемого штамма;
мелкие (менее 0,3 см в диаметре) очаги гнойного воспаления;
кровоизлияния до 0,5 см в диаметре.
3
При введении испытуемой культуры в дозе 5 х 10 м.к. допустимы
изменения по частоте, которые наблюдаются при введении контрольного
вакцинного штамма 15 НИИЭГ (п. 8.1).
Следует обращать внимание на возможность возникновения
инкапсулированных абсцессов в тканях места введения в поздние сроки
(до 45 сут.). Такие изменения характерны для недостаточно
аттенуированных штаммов.
Гистологические изменения. Наблюдается воспаление собственно
кожи, подкожной клетчатки с явлениями некробиоза, небольшими участками
кровоизлияний и серозным пропитыванием прилежащих структур. При
введении культуры исследуемого штамма во всех указанных дозах
допустимы: в ранние сроки (3 - 5-е сут.) гнойное воспаление -
инфильтраты из полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМН-лейкоцитов); с 7-х
по 10-е сут. по периферии очага гнойного расплавления развивается
продуктивная реакция - участки грануляционной ткани, которые к 14 -
21-м сут. постепенно замещают очаг воспаления соединительной тканью. В
этот период возможно обнаружение преимущественно
эпителиоидно-клеточных гранулем с наличием многоядерных гигантских
клеток. В некоторых гранулемах могут быть небольшие очаги некроза в
центре; к 28 - 45-м сут. происходит полное замещение очага воспаления
соединительной тканью.
При введении культуры исследуемого штамма в меньших дозах
указанные изменения могут наблюдаться не более чем у 2 - 3 свинок.
9.2.2. Регионарные лимфатические узлы (паховые и подвздошные)
Макроскопическая картина. При введении культуры испытуемого
9
штамма в максимальной дозе (5 х 10 м.к.) допустимо: умеренное
увеличение регионарных лимфатических узлов к 3 сут. в 1,5 - 2,0 раза;
отек окружающей клетчатки с единичными мелкопятнистыми
кровоизлияниями. На 5-е сут. лимфатические узлы полнокровны, иногда с
мелкими кровоизлияниями в капсулу и окружающую клетчатку. К 7 - 14-м
сут. лимфатические узлы увеличиваются значительно (в 2,5 раза),
окружающая их клетчатка полнокровна, отечна, с наличием кровоизлияний
(0,3 - 0,5 см в диаметре). Увеличение лимфатических узлов продолжается
до 28-х сут.
При введении культуры испытуемого штамма в меньших дозах
допустимо: с 3-х по 14-е сут. незначительное или умеренное (до 0,5 см
в диаметре) увеличение узлов с гиперемией и уплотнением, без
геморрагий, очагов нагноения и некрозов. Выраженность качественных и
количественных изменений прямо пропорциональна величине дозы вводимого
испытуемого штамма.
Гистологические изменения. При введении культуры исследуемого
9
штамма в дозе 5 х 10 м.к. уже на 3-е сут. в корковом слое под капсулой
образуются специфические гранулемы различной величины и формы. Они
состоят из полиморфно расположенных эпителиоидных клеток, среди
которых обнаруживаются и гигантские многоядерные клетки. Обычно в
центре гранулем имеются скопления полиморфно-ядерных лейкоцитов, часть
из которых с распадающимися ядрами. В мозговом слое отмечается
выраженное полнокровие и катар синусов. В последующие сроки
формирование гранулем продолжается. К этим изменениям на 7-е сут.
присоединяются явления продуктивного периаденита; начинается
постепенное замещение гранулем соединительной тканью, некоторые
гранулемы в центре подвергаются некрозу. В последующие сроки (10 -
14-е сут.) воспалительные изменения могут распространяться и вызывать
образование довольно обширных периаденитов. К 21-м сут. отмечается
формирование свежих гранулематозных образований; выявляются
склеротические процессы, особенно в мозговом веществе; сохраняется
продуктивный периаденит. Склеротические изменения наблюдаются и в
более поздние сроки (до 45-х сут.). Введение испытуемого штамма в
меньших дозах сопровождается, соответственно дозе, менее выраженными
изменениями. При введении всех указанных доз у животных допустимы:
острый серозный (негнойный) лимфаденит со слабо выраженным
периаденитом без некротических изменений; подострый лимфаденит с
участками грануляционной ткани, с продуктивными изменениями, частичным
фиброзом, изредка с небольшими рассасывающимися гранулемами без очагов
некроза и нагноения в половине случаев при введении культуры в дозе 5
7
х 10 м.к. и у отдельных животных при введении испытуемого штамма в
3
дозе 5 х 10 м.к.
9.2.3. Контрлатеральные и отдаленные лимфатические узлы
Макроскопическая картина. При введении культуры испытуемого
штамма во всех указанных дозах допустимо: умеренное или незначительное
(до 0,5 см) увеличение лимфатических узлов без признаков острых
воспалительных изменений. Кроме того, при введении культуры в дозе 5 х
9
10 м.к. возможно в отдельных случаях уплотнение лимфатических узлов с
проявлением умеренной гиперемии кожных покровов.
Гистологические изменения. При введении культуры во всех
указанных дозах допустимы: гиперпластические изменения в лимфоидной
ткани разной степени выраженности; умеренно или незначительно
выраженный очаговый серозный лимфаденит, небольшие участки
продуктивных изменений и фиброза стромы узлов.
9.2.4. Селезенка
Макроскопическая картина. При введении исследуемых культур в
9
дозе 5 х 10 м.к. уже на 3-и сут. селезенка бывает увеличена,
умеренно полнокровна; в последующие сроки могут наблюдаться очень
мелкие очажки серовато-белого цвета, бесследно исчезающие к
7 5
10 - 14-м сут. Испытуемый штамм, вводимый в дозах 5 х 10 и 5 х 10
м.к., вызывает значительно меньшие макроскопические изменения.
Во всех указанных дозах допустимы: небольшое или умеренное (в 1,5
- 2 раза) увеличение размеров селезенки с умеренным полнокровием при
отсутствии значительного соскоба на разрезе (чрезмерно сочные
отпечатки при посевах). В половине случаев при введении культуры в
9
дозе 5 х 10 м.к., у 30% животных при введении культуры в дозе 5 х
7
10 м.к. могут быть признаки гиперплазии фолликулов (выбухание под
9
капсулой). При введении культуры в дозе 5 х 10 м.к. допустимы: у
отдельных морских свинок (не более 6) развитие единичных или
немногочисленных (не более 10 в органе), преимущественно субмиллиарных
или отдельных миллиарных узелков серовато-белого, иногда розоватого
цвета без признаков некротизации, без абсцедирования, без слияния в
более крупные очаги, без инкапсуляции и грубого рубцевания, полностью
разрешающихся к 45-м сут.; при введении исследуемой культуры в дозах 5
7 5
х 10 и 5 х 10 м.к. возможно у отдельных животных (1 - 2) развитие
единичных узелков (1 - 3) без признаков некротизации, без
абсцедирования, без слияния в более крупные очаги, без инкапсуляции и
грубого рубцевания, полностью разрешающиеся к 45-м сут. При введении
меньшей дозы таких изменений не должно быть.
Гистологические изменения. При введении испытуемого штамма во
всех указанных дозах допустимы: гиперплазия клеток белой пульпы
(фолликулов и периартериальных муфт), плазмоклеточная реакция разной
степени выраженности; полнокровие синусов селезенки; острый серозный
очаговый или диффузный спленит, стихающий в поздние сроки, наличие
лимфогистиоцитарных инфильтратов в строме, небольших участков
грануляционной ткани, небольших очагов фиброза в строме и капсуле
9 7
органа при введении испытуемых культур в дозах 5 х 10 и 5 х 10 м.к. -
5 3
у 50% животных, а в дозах 5 х 10 и 5 х 10 м.к. - у отдельных (3 - 5)
животных. Кроме того, при введении исследуемой культуры в дозе 5 х
9
10 м.к. допустимы: гранулемы единичные (1 - 2 в срезе),
эпителиоидно-клеточные, без очагов некроза и явного абсцедирования,
без грубого рубцевания по периферии, иногда с небольшим накоплением
полиморфно-ядерных лейкоцитов (псевдоабсцесс) при процессах резорбции
не более чем у 5 - 6 опытных животных; при введении исследуемой
7
культуры в дозе 5 х 10 м.к. допустимы у отдельных животных единичные
мелкие гранулемы (1 - 2 в срезе) продуктивного характера.
9.2.5. Печень
Макроскопическая картина. При введении исследуемой культуры во
всех указанных дозах допустимы: признаки умеренных диффузных
дистрофических изменений органа (незначительное увеличение размеров,
набухание, сероватый оттенок окраски); венозное полнокровие; у
единичных (1 - 2 свинки) животных возможно развитие узелков (до 3 в
органе), преимущественно точечных без признаков некроза, нагноения и
грубого рубцевания; беловатых или сероватых точечных и штрихообразных
очагов.
9
При введении исследуемой культуры в дозе 5 х 10 м. к.
допустимы: у отдельных животных (не более 6) немногочисленные (до 10 в
органе) преимущественно точечные и субмиллиарные, редко миллиарные
узелки без признаков некротизации, без абсцедирования, инкапсуляции и
грубых рубцовых изменений ткани печени в поздние сроки, иногда с
небольшими втяжениями поверхности; при введении исследуемой культуры в
7
дозе 5 х 10 м.к. у единичных (1 - 3) животных возможно развитие
точечных и субмиллиарных узелков без признаков некротизации, без
абсцедирования, без инкапсуляции и грубых рубцовых изменений ткани
органа.
Гистологические изменения. При введении исследуемой культуры во
всех указанных дозах у 50% животных допустимы: наличие умеренно
выраженных признаков функционального напряжения гепатоцитов
("зернистая дистрофия"), умеренно выраженные очаговые вакуольная и
(или) жировая дистрофии; мелкие единичные (2 - 3 в срезе)
лимфогистиоцитарные инфильтраты в строме.
9
При введении испытуемой культуры в дозе 5 х 10 м. к.
допустимы: гранулемы эпителиоидно-клеточные без фокусов некроза,
абсцедирования, инкапсуляции выраженных склеротических очагов, с
признаками резорбции не более чем у 6 животных; единичные (1 - 3 в
срезе) очаги некроза и некробиоза в пределах 10 - 15 печеночных клеток
при наличии хорошо выраженной продуктивной клеточной реакции без
склонности к дальнейшей некротизации и к абсцедированию не более чем у
7
1 - 2 свинок. При введении исследуемой культуры в дозе 5 х 10 м.к.
возможно развитие единичных (1 - 2 в срезе) гранулем не более чем у 1
5
- 2-х животных. При введении исследуемой культуры в дозе 5 х 10 м.к. и
3
5 х 10 м.к. допустимо развитие лишь единичных (1 - 2 в срезе)
продуктивных гранулем у отдельных (1 - 2) животных.
9.2.6. Легкие
Макроскопическая картина. При введении исследуемой культуры во
всех дозах допустимы: участки неравномерного полнокровия легких;
участки пониженной воздушности серовато-синюшного цвета.
9
При введении исследуемой культуры в дозе 5 х 10 м. к.
допустимы: миллиарные и субмиллиарные очаги уплотнения легочной ткани
серовато-розоватого, иногда синюшно-красного цвета, немногочисленные
(до 10 в обоих легких) в половине случаев при отсутствии
бактериологического выделения возбудителя туляремии из ткани легких;
7 5
при введении исследуемой культуры в дозах 5 х 10 и 5 х 10 м.к.
возможно развитие единичных (1 - 3) миллиарных и субмиллиарных очагов
уплотнения легочной ткани у отдельных (1 - 3) свинок при отсутствии
позитивных бактериологических данных.
Гистологические изменения. При введении всех указанных доз
допустимы: признаки умеренной очаговой интерстициальной инфильтрации
перегородок между альвеолами лимфоидными и гистиоцитарными клеточными
элементами при отсутствии сужения просветов альвеол, кровоизлияний,
значительной примеси в инфильтрате ПМН-лейкоцитов, гиперплазии
бронхопульмонарных лимфатических узелков, крупных лимфогистиоцитарных
инфильтратов вокруг сосудов и бронхов. При введении испытуемой
9
культуры в дозе 5 х 10 м.к. допустимы: вышеописанные изменения
преимущественно гиперпластические - типа интерстициальной реакции
распространенного или диффузного характера с участием
бронхопульмональных лимфатических узелков, наличием
лимфогистиоцитарных инфильтратов умеренных размеров вокруг сосудов и
бронхов.
9.2.7. В других органах (сердце, почки, надпочечники) допустимы
гиперпластические и умеренные дистрофические изменения в пределах,
наблюдаемых при обычном вакцинном процессе после введения культуры
вакцинного штамма туляремийного микроба 15 НИИЭГ.
9.3. Все вышеотмеченные изменения, допустимые при развитии
вакцинальной реакции, могут колебаться в известных пределах у
отдельных морских свинок по выраженности, срокам развития и полноте
резорбции. Оценка изменений в месте введения культуры и в
лимфатических узлах в смысле их допустимости как вакцинальных не
представляет трудности. В противоположность этому дать правильную
оценку изменениям во внутренних органах, укладывающимся в пределы
вакцинальных реакций, очень сложно. Возникают затруднения даже при
подсчете числа узелков в печени и селезенке. Иногда количество узелков
может быть решающим в оценке испытуемых культур. Наличие 12 - 15
узелков в печени и селезенке у 1 - 2 морских свинок, которым
9
испытуемая культура была введена в дозе 5 х 10 м.к. при отсутствии
других недопустимых изменений, не может быть абсолютным показателем
для ее отклонения.
Отсутствие или слабая выраженность дистрофических процессов в
паренхиматозных органах, отсутствие роста испытуемого штамма
туляремийного микроба в посевах из этих органов наряду с другими
позитивными характеристиками штамма указывают на безвредность
последнего, несмотря на несколько большую узелковую реакцию. В то же
время единичные узелки (2 - 5 в органе), заканчивающиеся формированием
абсцессов и рубцов, приводящие к нарушению структуры органа, могут
быть показателем высокой степени остаточной вирулентности изучаемой
культуры и на основании этого штамм может быть поставлен под сомнение
как соответствующий вакцинному.
Наиболее важное значение имеет качество узелков: их характер,
развитие и исходы. Узелки должны развиваться в острой, нестерильной
фазе поствакцинальной реакции, иметь продуктивный характер. В период
резорбции приобретать строение псевдоабсцессов и рассасываться к 30-м
сут. наблюдения, когда наступает полное восстановление структуры
органов.
Чаще формирование узелков в печени и селезенке сочетается с
выраженными местными изменениями. Однако в ряде случаев узелки
обнаруживаются у морских свинок, у которых в месте введения культуры и
регионарных лимфатических узлах изменения минимальные. Испытуемые
штаммы, вводимые в максимальной дозе, могут сохранять токсигенные
свойства, проявляющиеся образованием очагов некробиоза печени.
9.4. Недопустимо развитие: при подкожном введении испытуемого
9
штамма даже в максимальной дозе (5 х 10 м.к.) в месте введения
обширных кровоизлияний в подкожной клетчатке с выраженным отеком,
гнойным расплавлением или некрозом тканей; в регионарных лимфатических
узлах - диффузного гнойного аденита и периаденита с видимыми участками
некроза; в легких - сливных очагов интерстициальной пневмонии или
микроскопических очагов серозной, серозно-геморрагической и
серозно-десквамативной пневмонии с выделением из легких испытуемой
культуры; в печени и селезенке - множественных узелков и очагов
некроза, абсцессов, обширных кровоизлияний, а в поздние сроки -
рубцовых изменений.
|
Фрагмент документа "3.3.1. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА. ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИННЫМ ШТАММАМ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".