Фрагмент документа "3.3.1. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА. ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИННЫМ ШТАММАМ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ЛЮДЕЙ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".
4. Характеристика штамма по видовым признакам
Возбудителями сибирской язвы являются микроорганизмы рода
Bacillus, вида anthracis. В. anthracis - облигатный паразит,
хемоорганотроф, метаболизм факультативно аэробный, грамположительные,
неподвижные палочки, образуют термоустойчивые эндоспоры.
4.1. Испытуемый сибиреязвенный штамм при посеве в бульон
Хоттингера <*>, при рН 7,2 - 7,3 после суточной инкубации при
температуре 35 - 37 град.С должен давать типичный для возбудителя
сибирской язвы рост культуры у дна пробирки в виде "комка ваты",
относительно трудно разбивающегося при встряхивании; в толще
прозрачного бульона возможно наличие хлопьев растущей культуры. В
мазках из суточных бульонных культур, окрашенных по Граму, -
морфологически типичные для возбудителя сибирской язвы
грамположительные палочки длиной 3 - 10 мкм и цепочки из этих палочек.
В висячей капле - отсутствие подвижности бацилл.
4.2. При посевах на чашки Петри с питательным агаром Хоттингера
<*> после суточной инкубации при температуре (36 +/- 1) град.С
культура штамма должна вырастать в виде сухих, с "шагреневой"
поверхностью колоний, с неровными краями, характерных для R или
RО-формы, не должно быть гладких S-форм колоний.
--------------------------------
<*> Бульон и агар Хоттингера готовят по МУК 4.1/4.2.588-96.
В мазках из агаровых культур должны обнаруживаться
грамположительные бациллы, обычно группирующиеся более короткими
цепочками, чем в мазках из бульонных культур.
4.3. При посеве испытуемого сибиреязвенного штамма на агар
Хоттингера в чашках Петри с добавлением 5%-ной дефибринированной крови
кролика или барана не должно наблюдаться гемолиза. При посеве 1 капли
(0,05 мл) взвеси, содержащей 100 - 200 тысяч спор,
неантибиотикорезистентного штамма в пробирки с питательным бульоном,
разлитым по 5 - 7 мл и содержащим 1000 ед./мл пенициллина, не должно
быть роста культуры испытуемого сибиреязвенного штамма через 20 - 24 ч
инкубации при температуре (36 +/- 1) град.С.
4.4. При посеве 3-часовой бульонной культуры
неантибиотикорезистентных сибиреязвенных штаммов на агар Хоттингера в
чашках Петри с добавлением к среде 0,5 и 0,05 ед./мл пенициллина через
2,5 - 3 ч инкубирования при температуре (36 +/- 1) град.С должен
проявляться рост культуры, наблюдаемый при фазово-контрастной
микроскопии в виде шаров, соединенных в цепочки - "феномен ожерелья".
Необходим контрольный посев изучаемой 3-часовой бульонной культуры на
тот же агар без добавления пенициллина; рост должен быть типичным для
возбудителя сибирской язвы.
4.5. На плотной питательной среде Гладстона - Фильда (состав
среды приведен в п. 1 Прилож. 1) или на питательной среде на основе
ферментативного гидролизата мяса или рыбокостной муки, принятой для
изготовления живой споровой вакцины (РП N 831-98), через 4 сут.
инкубации при температуре 33 - 35 град.С в мазках из выросшей культуры
должно быть не менее 90% типичных сибиреязвенных спор по отношению к
общему числу бацилл. Мазки окрашивают по методу Циля - Нильсена или
Ребигера <*>. Методика определения концентрации спор приведена в п. 2
Прилож. 1.
--------------------------------
<*> Методика окрашивания мазков по Цилю - Нильсену и Ребигеру
приведена в Инструкции и методических указаниях по клинической и
лабораторной диагностике, лечению и профилактике сибирской язвы у
людей (Саратов, 1970. С. 56 - 57).
4.6. В испытуемой культуре вакцинного штамма должно выявляться
методом микрокультур не менее 90% живых спор, высевом - не менее
половины. Методика определения приведена в п. 2 Прилож. 1.
4.7. Оценка генетической и фенотипической полноценности
сибиреязвенных штаммов как вакцинных по детерминантам и факторам
иммуногенности и вирулентности.
4.7.1. Определение присутствия плазмиды рХО1 в вакцинном штамме.
Вакцинный штамм должен содержать плазмиду рХО1 или клонированные
гены ответственные за синтез ПА. Плазмида рХО1 (110 МД) кодирует
синтез сибиреязвенного токсина, состоящего из ПА - протективного
антигена, ЛФ - летального фактора, ОФ - отечного фактора. ПА является
основным иммуногенным фактором. Методика определения приведена в п. 3
Прилож. 1.
4.7.2. Определение отсутствия у штамма капсулы при
культивировании на питательных средах.
В посевах культур испытуемого штамма на чашки Петри со средой
Шефера (сыворотка крови лошади, свернутая при температуре 80 град.С в
течение 48 ч) или на 1%-ном бикарбонатном агаре (агар Хоттингера с
1%-ной питьевой содой) после инкубации в течение 2 сут. при
температуре 37 град.С в анаэростате должен наблюдаться рост
шероховатых матовых колоний, сходных с R-колониями на обычных
питательных средах; в мазках из колоний должны обнаруживаться только
бациллы, лишенные капсулы. Должны полностью отсутствовать гладкие,
блестящие колонии, содержащие капсульные формы бацилл.
В жидкой среде ГКИ (60% раствора Хенкса с 40% сыворотки крови
крупного рогатого скота, инактивированной при 56 град.С 30 мин., рН
7,2 - 7,3) должен быть рост только бескапсульных палочек. Для
выявления капсулообразования посевы, закрытые резиновыми пробками,
инкубируют 16 - 18 ч при температуре 37 град.С. Мазки из культур
фиксируют метиловым спиртом с 10%-ным формалином и окрашивают
раствором метиленового синего по Леффлеру. Для контроля качества сред
и условий культивирования таким же образом следует провести посевы
капсулообразующего штамма 71/12 2-й вакцины Ценковского.
4.7.3. Определение отсутствия у испытуемого штамма плазмиды рХО2,
кодирующей синтез капсулы, с использованием метода электрофореза ДНК в
агарозовом геле.
Вакцинный штамм сибиреязвенного микроба не должен иметь в своем
геноме плазмиды рХО2, кодирующей синтез капсулы. Определение
отсутствия у штамма плазмиды рХО2 проводят по методике, изложенной в
п. 4.7.1, одновременно с определением плазмиды рХО1.
На фотографии агарозного геля у испытуемого штамма и контрольного
вакцинного штамма СТИ-1 должна отсутствовать полоска, соответствующая
по размеру ДНК плазмиде рХО2 (60 МД). В качестве контроля используют
+
штамм В. anthracis КМ 34 рХО2 , pХ01 или аналогичный несущий только
плазмиду капсулообразования и не содержащий в своем геноме плазмиду
pX01 (ПО МД), ответственную за синтез сибиреязвенного токсина.
4.7.4. Определение наличия pag-гена, кодирующего
токсинообразование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Вакцинный штамм сибиреязвенного микроба должен содержать pag-ген
плазмидной или иной локализации.
Определение наличия pag-гена приведено в п. 4 Прилож. 1.
4.8. Характеристика основных свойств эталонного вакцинного штамма
сибиреязвенного микроба СТИ-1.
Таблица 1
---------------------------------------------------------------------
| N | Признаки | Характеристика |
|п/п| | |
|---|------------------------------|--------------------------------|
|1 | Морфология | палочки, споры |
|---|------------------------------|--------------------------------|
|2 | Подвижность | отсутствует |
|---|------------------------------|--------------------------------|
|3 | Окраска по Граму | грамположительная |
|---|------------------------------|--------------------------------|
|4 | Рост на МПБ | "комок ваты" в прозрачном |
| | | бульоне |
|---|------------------------------|--------------------------------|
|5 | Рост на плотных питательных | R и RO-формы с типичными |
| | средах | "локонами", в виде "головы |
| | | медузы" или "львиной гривы" |
|---|------------------------------|--------------------------------|
|6 | Гемолиз на агаре Хоттингера | отсутствует |
| | с 5% дефибринированной крови | |
|---|------------------------------|--------------------------------|
|7 | Рост на агаре Хоттингера с | "феномен ожерелья" |
| | пенициллином | |
|---|------------------------------|--------------------------------|
|8 | Наличие капсулы | отсутствует |
|---|------------------------------|--------------------------------|
|9 | Наличие плазмиды рХО1 | имеется |
|---|------------------------------|--------------------------------|
|10 | Наличие pag-гена | имеется |
|---|------------------------------|--------------------------------|
|11 | Наличие плазмиды рХО2 | отсутствует |
|---|------------------------------|--------------------------------|
|12 | Наличие сар-гена | отсутствует |
---------------------------------------------------------------------
|
Фрагмент документа "3.3.1. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА. ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИННЫМ ШТАММАМ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ЛЮДЕЙ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".