Фрагмент документа "3.3.1. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА. БЕЗОПАСНОСТЬ РАБОТЫ С ПРОИЗВОДСТВЕННЫМИ ШТАММАМИ ФИКСИРОВАННОГО ВИРУСА БЕШЕНСТВА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".
4.4. Требования к проведению работ в лаборатории
4.4.1. Работу с производственными штаммами фиксированного вируса
бешенства выполняют специалисты с высшим и средним специальным
образованием, прошедшие специальную подготовку.
4.4.2. Персонал допускается к работе с производственными штаммами
фиксированного вируса бешенства после проведения инструктажа по
соблюдению требований биологической безопасности. Последующие
инструктажи проводят не реже 1 раза в год, с записями в
соответствующих журналах.
4.4.3. Приборы, оборудование и средства измерений, используемые в
работе лаборатории, должны быть аттестованы, технически исправны,
подвергаться метрологическому контролю в установленные сроки, иметь
технический паспорт. На каждый прибор (установку) должны быть
разработаны правила (инструкция) по их эксплуатации с учетом
требований биологической безопасности.
4.4.4. В лаборатории должны использоваться дезинфицирующие
средства, допущенные к применению (3%-ный хлорамин). Срок хранения
готового раствора не должен превышать 15 суток.
4.4.5. В помещениях "заразной" зоны лаборатории проводятся:
- работа с животными (заражение, вскрытие);
- содержание инфицированных животных;
- дезинтеграция, гомогенизация мозговых тканей и другие операции
с вероятным образованием аэрозоля;
- заражение культуры клеток;
- приготовление взвесей и суспензий;
- работа с лиофилизированными производственными штаммами
фиксированного вируса бешенства.
4.4.6. Во время работы двери рабочих комнат должны быть закрыты.
Перед работой включается вентиляция "на отток". Выход из рабочей
комнаты во время проведения работы запрещается.
4.4.7. Заражение животных осуществляется не менее чем двумя
сотрудниками.
4.4.8. При пипетировании необходимо пользоваться резиновыми
грушами или автоматическими устройствами.
4.4.9. Перед использованием посуда, пипетки, оборудование, шприцы
и т.д. должны быть проверены на целостность и исправность.
4.4.10. Ампулы с лиофилизированными производственными штаммами
фиксированного вируса бешенства вскрывают стерильно над подносом или
лотком с марлевой салфеткой, пропитанной дезинфицирующим раствором.
Верхний конец ампулы нагревают над пламенем горелки, снимают парафин,
затем кусочком стерильной ваты, смоченным в стерильной воде, осторожно
прикасаются к оттянутому концу ампулы для образования трещины. Той же
влажной ватой обводят вокруг носика ампулы. После образования круговой
(или не полностью круговой) трещины конец ампулы накрывают марлевой
салфеткой или ватой и обламывают пинцетом.
4.4.11. После вскрытия ампулы в нее добавляют 1,0 мл стерильной
дистиллированной воды и осторожно встряхивают. Полученную суспензию,
содержащую фиксированный вирус бешенства, используют для заражения
лабораторных животных.
4.4.12. Для внутримозгового заражения кролика его надежно
фиксируют на специальном станке или дают легкий наркоз (2 - 2,5 мл
раствора Рометара внутримышечно за 20 - 30 мин. до заражения). Затем
аккуратно выстригают шерсть в зоне предполагаемого введения,
обрабатывают 70%-ным раствором этанола и 5%-ным раствором йода и с
помощью стерильного шприца емкостью 2 мл и иглы размером N 20 (10 x
0,90) вводят 0,25 мл суспензии фиксированного вируса бешенства штамм.
Прокол делают приблизительно на середине линии, условно соединяющей
наружный угол глаза и ухо. При заражении крупных кроликов можно
пользоваться шилом из нержавеющей стали или троакаром. Явные признаки
паралича появляются у кроликов на 4 день после инокуляции; в редких
случаях они развиваются до 7 дня. Извлечение мозга производят у
животного только после развития полной картины паралича, характерного
для фиксированного вируса бешенства. К числу первых симптомов
экспериментального бешенства относятся: повышение температуры тела,
пугливость и расширение зрачков. Затем появляются менингеальные
явления, парезы, начинающиеся обычно с задних конечностей, быстро
прогрессирующие параличи, захватывающие все конечности, шейную и
затылочную мускулатуру.
4.4.13. Больных кроликов с картиной полного паралича, но с еще
сохранившимся дыханием забивают путем тотального обескровливания.
Головной мозг используется для изготовления рабического антигена.
После декапитации производят снятие шкурки, отделяют позвоночник
вместе со спинным мозгом, которые подвергают автоклавированию (2,0
кГс/кв. см (0,2 МПа), 132 +/- 2 ёC), как заразный материал.
4.4.14. Для извлечения головного мозга животное укладывают на
секционный лоток животом вниз так, чтобы голова оказалась на краю
стола. С помощью пинцета, скальпеля и ножниц отделяют голову от
туловища. Затем скальпируют кожу головы, удаляя уши и верхние веки.
Обнаженную поверхность черепа смачивают 70%-ным спиртом и помещают в
кристаллизатор. Кристаллизатор переносят в стерильный бокс для
приготовления антигена. Перед вскрытием черепа его двухкратно
обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом. Затем череп кролика закрепляют
в специальное приспособление (прилож. 1 - не приводится),
обеспечивающее надежную фиксацию головы животного. Удерживая
секционный нож в левой руке, правой рукой с помощью молотка вскрывают
черепную коробку четырьмя прямоугольными разрезами. Сначала следует
сделать разрез по линии, соединяющей середины глаз, затем разрез в
теменной области, а затем соединить эти два разреза перпендикулярными
разрубами. Затем, отложив в сторону секционный нож и молоток, с
помощью пинцета и ножниц высвобождают твердую мозговую оболочку и
переднюю часть мозга отделяют на уровне обонятельной доли; пересекают
продолговатый мозг позади мозжечка, приподнимают мозг, пересекают
перекрест зрительных нервов и затем переносят его на стерильную чашку
Петри для взвешивания.
4.4.15. Для приготовления антигена головной мозг после
взвешивания помещают в стерильную ступку или гомогенизатор и
измельчают. К измельченному мозгу добавляют дистиллированную воду,
содержащую 0,5% фенола, до получения 10%-ной мозговой суспензии.
Суспензию мозга фильтруют через тройной слой марли. Стерильность
мозговой суспензии проверяют посевом на сахарный бульон, мясопептонный
агар и мясопептонный бульон с 0,1% агара и кусочками мяса. Посевы
выдерживаются при 37 ёC в течение 5 сут. Разрешается для иммунизации
лошадей-продуцентов использовать стерильный антиген, сохранившийся при
температуре 4 ёC не более 14 сут.
4.4.16. Для приготовления исходных культур фиксированного вируса
бешенства головной мозг кролика помещают в стерильную ступку или
гомогенизатор и измельчают. К измельченному мозгу добавляют
дистиллированную воду до получения 10% мозговой суспензии.
Стерильность мозговой суспензии проверяют посевом на сахарный бульон,
мясопептонный агар и мясопептонный бульон с 0,1% агара и кусочками
мяса. Мозговую взвесь разливают стерильно по аликвотам объемом 4 - 5
мл и замораживают при температуре не выше минус 18 ёC. Оптимальной
температурой для хранения штаммов фиксированного вируса бешенства
является минус 70 ёC. Для заражения достают одну аликвоту из
морозильника и помещают в холодильник на 4 ёC на 18 - 20 ч. После
оттаивания осторожно пастеровской пипеткой отбирают среднюю фазу
мозговой суспензии, содержащую максимальное количество вируса.
4.4.17. Для проведения реакции нейтрализации и определения
LD штаммов фиксированного вируса бешенства используют беспородных
50
белых мышей или мышей любой инбредной линии в возрасте 6 - 8 недель и
весом 11,0 +/- 1,0 г. Пол мышей принципиального значения не имеет.
Животные должны быть в хорошем состоянии. Непосредственно перед
заражением необходимо тщательно осмотреть всех животных. При
обнаружении эктопаразитов, взъерошенной шерсти или признаков диареи
животные не используются. Мышь укладывают головой на деревянную
подставку толщиной 1 см и надежно, но не сильно, чтобы не вызвать
асфиксию, фиксируют пальцами. Экспериментатор берет в левую руку
тампон, смоченный 70%-ным этиловым спиртом, и тщательно обрабатывает
место предполагаемого введения. Затем, взяв в правую руку шприц,
придает ему строго вертикальное положение и быстрым движением
прокалывает иглой череп животного в точке, находящейся в вершине
воображаемого угла, стороны которого ведут к правому глазу и правому
уху животного. Игла легко проникает через кость и погружается далее на
0,1 - 0,2 см в ткань мозга. При этой манипуляции следует применять
иглы N 0416 длиной не более 1,5 см. Продвинув поршень до конца,
осторожно извлекают иглу. Объем вводимого материала не более 0,03 мл.
Зараженную мышь следует тотчас поместить в предварительно
заготовленную банку с этикеткой, на которой указывают название вируса,
заражающую дозу и другие необходимые отметки. Если заражают большую
группу животных, по окончании эксперимента необходимо точно
проконтролировать число живых мышей в каждой группе. При обнаружении
погибших животных надо провести дополнительную инокуляцию, добавив в
группу недостающее число мышей. После того как инокуляция всех мышей
закончена, шприцы с иглами осторожно разбирают и погружают в воду,
находящуюся в стерилизаторе. Инструменты стерилизуют кипячением в
течение 30 мин. Инкубационный период штаммов фиксированного вируса
бешенства равняется 5 - 6 дням, поэтому экспериментальных животных,
павших ранее 5 дня, в эксперименте не учитывают. Животных осматривают
ежедневно, начиная со следующего дня после заражения. Число
нормальных, больных и погибших животных регистрируют на специальной
карте, которая служит постоянным протоколом опыта. Период наблюдения
составляет 14 сут.
4.4.18. Правила вскрытия мышей. Мышей забивают в состоянии
выраженных терминальных симптомов бешенства хлороформом. Труп мыши
фиксируют на дощечке спиной кверху. Для этого необходимо две булавки -
одной прикалывают основание хвоста, другой - кончик морды. Можно
пользоваться и тремя булавками, чтобы фиксировать передние лапы и
хвост. После обработки спиртом кожу головы и шеи отпрепаровывают с
помощью ножниц и пинцета, открывая череп. Череп зажимают в глазницах
хирургическим пинцетом, изогнутыми ножницами отделяют крышку черепа,
обнажая мозг. С помощью тех же изогнутых ножниц извлекают мозг и
переносят в стерильную чашку Петри, которую заранее взвешивают.
Производят взвешивание чашки Петри с мозговой тканью. Затем мозг
переносят в стерильную ступку, где с помощью стерильного пестика
приготавливают 10%-ную мозговую взвесь с добавлением дистиллированной
воды. Взвесь разливают по аликвотам и хранят при температуре не ниже
минус 18 ёC. Оптимальной температурой для хранения штаммов
фиксированного вируса бешенства является минус 70 ёC.
4.4.19. По окончании работы все объекты с производственными
штаммами фиксированного вируса бешенства должны быть убраны в
хранилища (холодильники, термостаты, шкафы и т.д.); в обязательном
порядке проводится дезинфекция рабочих поверхностей столов 3%-ным
раствором хлорамина.
4.4.20. Использованные пипетки полностью (вертикально)
погружаются в дезинфицирующий раствор (3%-ный хлорамин), избегая
образования в каналах пузырьков воздуха. Длительность дезинфекции 60
мин.
4.4.21. Использованная посуда, твердые отходы из "заразной" зоны
лаборатории должны собираться в закрывающиеся емкости и передаваться в
автоклавную или дезинфицироваться на месте. Слив необеззараженных
жидкостей в канализационную сеть запрещается.
4.4.22. Перенос производственных штаммов фиксированного вируса
бешенства и использованной посуды для обеззараживания должен
осуществляться в закрытых емкостях, исключающих инфицирование
персонала во время транспортирования. После завершения работы
помещение "заразной" зоны лаборатории запирается и опечатывается.
Опечатывание и снятие печатей производят сотрудники лаборатории,
имеющие разрешение руководителя лаборатории (подразделения).
4.4.23. Иммунизацию лошадей-продуцентов осуществляют согласно
регламенту производства "Иммуноглобулина антирабического жидкого из
сыворотки крови лошади".
4.4.24. Правила введения антигена. Введение антигена лошади
производится в специально оборудованном помещении (операционной).
Сотрудники, осуществляющие инъекцию антигена, одеты в противочумный
костюм 3-типа с резиновыми перчатками. Для введения антигена
используют прибор для массовых прививок ПМП-1, который соединяется
посредством силиконового шланга с иглой и флаконом с антигеном. Вся
инъекционная система соединяется герметично. Место введения антигена
предварительно обрабатывают 70%-ным раствором спирта. Иглу вводят
подкожно и под небольшим давлением медленно вводят антиген. После
инъекции вентилем перекрывают подачу антигена, кожу на месте введения
иглы зажимают кровоостанавливающим пинцетом на 1 мин. Пинцет снимают,
место инъекции обрабатывают тампоном, смоченным 70%-ным раствором
спирта, и накладывают тампон с коллодием или фурапластом с
перхлорвинилом. После использования вся инъекционная система
подвергается кипячению в течение 30 мин. в 2%-ном содовом растворе. В
процессе гипериммунизации постоянно следят за общим состоянием и
температурной реакцией продуцентов. В случае повышения температуры
очередную инъекцию антигена производят после ее снижения до нормы.
4.4.25. Хранение производственных штаммов фиксированного вируса
бешенства осуществляется в помещениях заразной зоны. Хранение, учет,
передача, транспортирование и уничтожение производственных штаммов
фиксированного вируса бешенства проводятся в соответствии с
требованиями СП 1.2.036-95.
4.4.26. Прием посетителей разрешается только в специально
отведенных местах в "чистой" зоне лаборатории.
4.4.27. Вынос из лаборатории оборудования, лабораторной или
хозяйственной посуды, инструментов и др. производится только после их
дезинфекции и с разрешения ее руководителя.
4.4.28. В "заразной" зоне лаборатории запрещается:
- оставлять после окончания работы на рабочих местах посуду с
производственными штаммами фиксированного вируса бешенства "Москва" и
"CVS";
- пипетировать ртом, переливать жидкий инфекционный материал
через край сосуда (пробирки, колбы, флакона);
- хранить верхнюю одежду, головные уборы, обувь, зонты,
хозяйственные сумки, косметику и т.п., а также продукты питания;
- курить, пить воду;
- оставлять без надзора рабочее место во время выполнения любого
вида работ с производственными штаммами фиксированного вируса
бешенства;
- сливать жидкие отходы (инфицированные жидкости, исследуемый
материал и т.д.) в канализацию без предварительного обеззараживания.
4.4.29. Допускается в одном и том же помещении проведение
экспериментальных и производственных работ с производственными
штаммами фиксированного вируса бешенства. Экспериментальная и
производственная работа должны быть разнесены по времени.
Экспериментальный материал должен храниться отдельно от
производственного в специально отведенном для него холодильнике или
термостате.
4.4.30. Все сотрудники, работающие с производственными штаммами
фиксированного вируса бешенства, должны находиться на диспансерном
наблюдении. Периодические медицинские осмотры проводятся в
соответствии с действующими приказами (N 280/88 - Минздравмедпром и
Госкомсанэпиднадзор России).
|
Фрагмент документа "3.3.1. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА. БЕЗОПАСНОСТЬ РАБОТЫ С ПРОИЗВОДСТВЕННЫМИ ШТАММАМИ ФИКСИРОВАННОГО ВИРУСА БЕШЕНСТВА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".