Фрагмент документа "ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА "АТИПИЧНОЙ ПНЕВМОНИИ" (SARS) МЕТОДОМ ПЦР. ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ".
5. Проведение анализа
5.1. Первичная подготовка проб
Контейнер (герметичную тару, бикс) с доставленными на
исследования пробами устанавливают в поддон, в бокс безопасности на 35
- 40 мин. Затем осторожно открывают крышку контейнера и, убедившись в
целостности емкости(ей) с материалом, выставляют их на поддон
предварительно обработав снаружи дезраствором. Емкости маркируют и
регистрируют (лист регистрации выносят из "заразной" зоны только после
обработки погружением в дезинфицирующий раствор).
5.2. Выделение РНК
В микроцентрифужные пробирки с завинчивающейся крышкой,
содержащие 450 мкл лизирующего буфера 1, вносят по 100 мкл исследуемых
проб, перемешивают и инкубируют при 65 град.С в течение 10 мин. на
твердотельном термостате. Оставшийся материал помещают в холодильник
на минус 20 град.С для хранения. Использованные пробирки и
наконечники, супернатант помещают в емкость, заполненную на 1/3 объема
0,1 N раствором гидроокиси натрия.
Затем в пробирку вносят 30 мкл нуклеосорбента, периодически
встряхивают на вортексе (микроцентрифуге/встряхивателе) в течение 5
мин. После этого центрифугируют при 8000 g в течение 30 сек.,
супернатант удаляют, а к осадку добавляют 300 мкл буфера 2.
Содержимое пробирки вновь перемешивают на вортексе до гомогенного
состояния, центрифугируют при 8000 g в течение 30 сек., супернатант
отбирают, а к осадку добавляют буфер 3. Осадок ресуспендируют на
вортексе и центрифугируют при 8000 g в течение 1 мин. Супернатант
удаляют, к осадку добавляют 500 мкл буфера 4. Содержимое перемешивают
на вортексе, затем центрифугируют при 8000 g в течение 30 сек.,
супернатант удаляют.
Осадок высушивают при температуре 65 град.С в течение 5 - 7 мин.
К осадку добавляют 30 мкл деионизованной стерильной воды и выдерживают
при температуре 65 град.С в течение 10 мин., периодически встряхивая
на вортексе. По окончании взвесь центрифугируют при 8000 g в течение 1
мин.; 10 мкл супернатанта используют для проведения реакции обратной
транскрипции.
5.3. Проведение реакции обратной транскрипции
Обратную транскрипцию РНК проводят с использованием набора
"Реверта", обеспечивающего синтез комплементарной ДНК (кДНК), в
соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. Пробирки с реакционной
смесью, в количестве соответствующем числу проб, переносят в комнату
"а", где вносят по 10 мкл каждой пробы экстрагированной РНК, аккуратно
перемешивают, инкубируют при 37 град.С в течение 30 мин.
5.4. Постановка ПЦР
Для проведения ПЦР используют две пары праймеров, обеспечивающих
амплификацию фрагментов гена РНК-зависимой РНК-полимеразы:
1) CDC1-5`-gggttgggactatcctaagtgtga-3`,
CDC2-5`-ccatcatcagatagaatcatcata - 3`, размер ампликонов 440 п. н.
(CDC, 2003);
2) SARls-5`-cctctcttgttcttgctcgca-3`, SARlas-5` -
tatagtgagccgccacacatg - 3`, размер ампликонов 121 п. н. (Drosten С.,
et al. 2003).
ПЦР с каждой парой праймеров проводят в двух отдельных пробирках.
Готовят необходимое количество микропробирок объемом 0,6 мл, по 2
пробирки на каждую пробу и одну - для отрицательного контроля,
нумеруют их. Реактивы для постановки ПЦР полностью размораживают и
перемешивают на вортексе в течение 10 сек. Предварительно в помещении
"г" готовят общую реакционную смесь, исходя из того, что на одну
реакцию необходимо: H O - 14,8 мкл; 2,5 мкл 10 х Б (0,7 мМ Трис, 0,2
2
мМ (NH ) SO 0,1% Твин 20, 200 мкг/мл БСА, рН 8,5); 2,5 мкл дНТФ (2 мМ
4 2
раствор дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ); 1,0 мкл 50 мМ раствора MgCl , по 1
2
мкл каждого праймера с концентрацией 12 пмоль/мкл, 0,2 мкл фермента
Taq-полимеразы с концентрацией 5 ед./мкл. Тщательно перемешивают на
вортексе и переносят во все пробирки по 23 мкл. Наслаивают на
поверхность по 25 - 30 мкл минерального масла.
Пробирки переносят в помещение "б" и во все, кроме контрольной,
вносят под масло по 2 мкл полученной кДНК. В пробирку, помеченную как
отрицательный контроль, вносят 2 мкл деионизованной воды. При наличии
положительного контроля в соответствующую пробирку добавляют 2 мкл
положительной кДНК. Пробирки помещают в программируемый термоциклер и
проводят амплификацию по следующей программе:
95 град.С - 3 мин.;
10 циклов
94 град.С - 10 сек.,
60 град.С - 10 сек. (с понижением каждый следующий цикл на 1
град.С),
72 град.С - 30 сек.;
40 циклов
94 град.С - 10 сек.,
56 град.С - 10 сек.,
72 град.С - 30 сек;
72 град.С - 7 мин.
Полученные образцы хранят при температуре 4 град.С.
После завершения программы амплификации пробирки переставляют из
прибора в штатив, который помещают в контейнер для транспортировки.
Контейнер обрабатывают снаружи дезсредством и передают для переноса в
комнату "в".
5.5. Учет результатов
В комнате "в" штатив с пробирками помещают на поддон. Для учета
результатов используют электрофорез в 2,5% агарозном геле. К продуктам
амплификации с помощью автоматической пипетки добавляют 1 мкл буфера
для нанесения проб (0,25% бромфеноловый синий, 15% фиколл 400 на
дистиллированной воде), тщательно перемешивают пипетированием и по 10
мкл вносят в лунки геля. Использованные наконечники помещают в
емкость.
При отсутствии положительного контроля в лунку геля вносят маркер
молекулярного веса ДНК с шагом 50 или 100 п. н., например ФХ 174
DNA/BsuRI (HaeIII) (MBI Fermentas, USA). После чего гель переносят в
камеру для электрофореза, заполненную 1 х ТАЕ буфером (Трис - 4,84 г,
ледяная уксусная кислота - 1,16 мл, 0,5 М раствор ЭДТА, рН 8,0 - 4
мл). Закрывают крышку аппарата и включают его в электросеть через блок
питания.
Электрофорез проводят в соответствии с инструкцией по
эксплуатации прибора в течение 1 - 1,5 ч, при градиенте напряжения 10
В/см, пока красителю останется пройти до анодного края геля 2 - 1,5
см. Окрашенную бромидом этидия в ходе электрофореза ДНК в геле
визуализируют под ультрафиолетовым освещением, для чего используют
трансиллюминатор. В случае появления в треках, соответствующих
исследуемым образцам светящихся полос их размер определяют
относительно маркера молекулярного веса ДНК. При использовании
праймеров SARSls и SARSlas при положительной реакции размер ампликонов
121 п. н., а с праймерами CDC1 и CDC2 - 440 п. н. Полученные
результаты документируют фотографированием или с помощью компьютерной
видеосистемы.
4.2.6. По окончанию работы емкости с отработанным материалом
помещают в бак для автоклавирования. В боксе и комнатах проводят
текущую дезинфекцию.
|
Фрагмент документа "ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА "АТИПИЧНОЙ ПНЕВМОНИИ" (SARS) МЕТОДОМ ПЦР. ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ".