Фрагмент документа "О НАДЗОРЕ ЗА ОБОРОТОМ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГМО".
VI. МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ
6.1. Перечень и объем исследований по разделу VI определяются
экспертными (учеными) советами соответствующих аккредитованных
испытательных центров Российской Федерации на основании анализа
представленных материалов.
6.2. Гигиенические исследования ГМО включают определение
показателей качества и безопасности:
6.2.1. Перечень показателей безопасности определяется на
основании требований СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования
безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" для соответствующей
группы продуктов.
Изучаемые показатели:
- содержание токсичных элементов;
- содержание микотоксинов;
- содержание пестицидов;
- содержание радионуклидов;
- содержание вредных примесей;
- микробиологические показатели;
- другие показатели (в случае необходимости).
6.2.2. Перечень показателей качества определяется на основании
свойств соответствующего растительного организма, а также анализа
представленных заявителем материалов. В случае если заявителем
представлены исчерпывающие данные по оценке композиционной
эквивалентности ГМО (содержание белка, аминокислотный состав,
содержание жира, жирнокислотный состав, углеводный состав, содержание
витаминов, макро- и микроэлементов, специфических компонентов,
биологически активных веществ, антинутриентов и других веществ,
характерных для растений данного вида), исследования могут быть
ограничены определением влажности, золы, содержания белка, жира,
углеводов, пищевых волокон.
6.2.3. В случае если генетическая модификация направлена на
изменение химического состава ГМО, должны быть проведены исследования,
подтверждающие заявленные изменения.
6.3. Токсикологические исследования ГМО проводятся в эксперименте
на лабораторных животных:
6.3.1. Схема проведения эксперимента
---------------------------------------------------------------------------
|Вид животных | крысы линии Вистар |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Пол | самцы |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Возраст | 40 - 50 дней |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Исходная масса тела | 70 - 80 г |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Количество животных в группе | не менее 50 особей в каждой группе |
|в начале эксперимента | |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Распределение по группам |Животных делят на 2 группы: |
| | группа "контроль" получает рацион с |
| | включением традиционного аналога |
| | исследуемого ГМО; |
| | группа "опыт" получает рацион с включением|
| | исследуемого ГМО |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Рацион |Пищевая и биологическая ценность рациона |
| |полностью удовлетворяет физиологические |
| |потребности животных |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Карантин |не менее 7-ми дней |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Условия содержания |Животные получают свободный доступ к корму |
| |и воде; содержатся в отапливаемом, |
| |вентилируемом помещении |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Продолжительность | 180 дней |
|эксперимента | |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Забор материала для | На 30-й и 180-й дни эксперимента |
|гематологических, | |
|биохимических, | |
|морфологических исследований | |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Количество животных, взятых | Не менее 10/группу |
|на исследование | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.2. На протяжении эксперимента животные получают
полусинтетический казеиновый рацион (ПКР). Исследуемый ГМО и его
традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном
количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Замена
ингредиентов рациона должна быть проведена с учетом содержания белков,
жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа
изокалорийности.
Продуктовый набор и химический состав базового ПКР представлен в
табл. 1 - 2.
Таблица 1
Состав базового полусинтетического казеинового рациона
---------------------------------------------------------------------------
| Ингредиенты | Кол-во |Белок| Жиры |Углеводы| Калорийность |
| |--------|-----|-------|--------|--------------|
| | г | г | г | г | ккал | % |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Казеин | 25,0 |20,20| 0,38 | - | 84,22 |22,1 |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Крахмал маисовый | 58,0 |0,58 | - | 50,2 | 203,12 |53,3 |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Масло подсолнечное | | | | | | |
|нерафинированное | 5,0 | - | 4,99 | - | 44,91 |11,8 |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Лярд | 5,0 | - | 4,98 | - | 44,82 |11,8 |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Солевая смесь <*> | 4,0 | - | - | - | - | - |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Смесь в/р витаминов <**> | 1,0 | - | - | 1,0 | 4,00 | 1,0 |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Смесь ж/р витаминов <***> | 0,1 | - | 0,1 | - | - | - |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Микрокристаллическая | | | | | | |
|целлюлоза | 2,0 | - | - | - | - | - |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|ИТОГО | 100,1 |20,78| 10,45 | 51,2 | 381,07 | 100 |
---------------------------------------------------------------------------
--------------------------------
<*> Состав солевой смеси представлен в табл. 2.
<**> 1 г содержит: тиамина (B1) - 0,4 мг, рибофлавина (B2) - 0,6
мг, пиридоксина (B6) - 0,4 мг, никотиновой кислоты - 3,0 мг,
пантотената кальция - 1,5 мг, фолиевой кислоты - 0,2 мг,
цианкобаламина (B12) - 0,003 мг, викасола - 0,1 мг, L-метионина - 50
мг, глюкозы - до 1 г.
<***> 0,1 мл содержит: ретинола ацетата 800 ME, эргокальциферола
- 70 ME, альфа-токоферола ацетата - 5 мг, подсолнечного масла - до 0,1
мл.
Таблица 2
Состав солевой смеси
---------------------------------------------------------------------------
| N | Название соли | Химическая формула |Количество, г|
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 1 | Хлористый натрий | NaCl | 139,3 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 2 | Калий фосфорнокислый | KH2PO4 | 388,8 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 3 | Магний сернокислый | MgSO4 | 57,4 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 4 | Кальций углекислый | CaCO3 | 380,4 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 5 | Железо сернокислое | FeSO4 x 7H2O | 26,4 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 6 | Калий йодистый | KI | 0,77 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 7 | Марганец сернокислый | MnSO4 x 7H2O | 4,55 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 8 | Цинк сернокислый | ZnSO4 x 7H2O | 0,53 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 9 | Медь сернокислая | CuSO4 x 5H2O | 0,48 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
|10 | Кобальт хлористый | CoCl2 x 6H2O | 0,024 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
|11 | Натрий фтористый | NaF | 0,50 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
|12 | Алюмокалиевые квасцы | K2SO4Al2(SO4)3 x 24H2O | 0,11 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| | ИТОГО | | 1000 |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3. Исследуемые показатели:
6.3.3.1. Интегральные показатели
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели |Периодичность сбора данных |
|---------------------------------------------|---------------------------|
|Общее состояние животных (внешний вид, | каждые 2 дня |
|двигательная активность, состояние шерстного | |
|покрова) | |
|---------------------------------------------|---------------------------|
|Поедаемость корма | ежедневно |
|---------------------------------------------|---------------------------|
|Масса тела | каждые 7 дней |
|---------------------------------------------|---------------------------|
|Масса внутренних органов (головной мозг, | На 30-й и 180-й дни |
|сердце, селезенка, легкие, тимус, гипофиз, | эксперимента |
|печень, почки, надпочечники, семенники) | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3.2. Гематологические показатели
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели |Периодичность сбора данных |
|---------------------------------------------|---------------------------|
|- концентрация гемоглобина; | На 30-й и 180-й дни |
|- гематокрит; | эксперимента |
|- общее количество эритроцитов; | |
|- средний объем эритроцита (СОЭ); | |
|- среднее содержание гемоглобина в эритроците| |
|(ССЭ); | |
|- средняя концентрация гемоглобина в | |
|эритроците (СКЭ); | |
|- общее количество тромбоцитов; | |
|- общее количество лейкоцитов; | |
|- дифференцированный подсчет лейкоцитов | |
|(нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты,| |
|базофилы) | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3.3. Биохимические показатели
6.3.3.3.1. Общий биохимический анализ крови
Материал для исследований: сыворотка крови
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели |Периодичность сбора данных |
|---------------------------------------------|---------------------------|
|- аланинаминотрансфераза (АЛТ); | На 30-й и 180-й дни |
|- аспартатаминотрансфераза (ACT); | эксперимента |
|- желчные кислоты; | |
|- фосфатаза щелочная; | |
|- билирубин общий; | |
|- билирубин прямой; | |
|- белок общий; | |
|- альбумин; | |
|- глобулин; | |
|- креатинин; | |
|- глюкоза; | |
|- альфа-амилаза; | |
|- липаза; | |
|- лактатдегидрогеназа; | |
|- общие липиды; | |
|- триглицериды; | |
|- холестерин; | |
|- холинэстераза; | |
|- мочевина; | |
|- хлориды; | |
|- натрий; | |
|- фосфор; | |
|- калий | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3.3.2. Общий анализ мочи. Материал для исследований: моча
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Периодичность сбора данных |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|- суточный диурез; | На 30-й и 180-й дни |
|- цвет и прозрачность; | эксперимента |
|- относительная плотность; | |
|- pH; | |
|- белок; | |
|- глюкоза; | |
|- креатинин | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3.3.3. Системные биомаркеры
6.3.3.3.3.1. Система антиоксидантной защиты
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Периодичность сбора данных |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|Активность ферментов антиоксидантной защиты.| На 30-й и 180-й дни |
|Материал для исследований: эритроциты | эксперимента |
| - глутатионредуктаза; | |
| - глутатионпероксидаза; | |
| - супероксиддисмутаза; | |
| - каталаза; | |
|--------------------------------------------| |
|Содержание продуктов перекисного окисления | |
|липидов. Материал для исследований: кровь, | |
|печень | |
| - малоновый диальдегид | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3.3.3.2. Система ферментов метаболизма ксенобиотиков
Материал для исследований: печень
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Периодичность сбора данных |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|Активность ферментов 1-й и 2-й фазы | На 30-й и 180-й дни |
|метаболизма ксенобиотиков | эксперимента |
| - общее содержание цитохрома Р-450; | |
| - 7-этоксирезоруфин-О-деэтилаза; | |
| - 7-пентоксирезоруфнн-О-деэтилаза; | |
| - UDP-глюкуронозилтрансфераза; | |
| - глутатионтрансфераза | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3.3.3.3. Система регуляции апоптоза
1) стабильность мембран лизосом
Материал для исследований: печень
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Периодичность сбора данных |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|Общая и неседиментируемая активность | На 30-й и 180-й дни |
|ферментов лизосом | эксперимента |
| - бета-галактозидаза; | |
| - бета-глюкуронидаза; | |
| - арилсульфатазы A и B | |
---------------------------------------------------------------------------
2) другие методы
6.3.3.4. Морфологические исследования
---------------------------------------------------------------------------
| Исследуемые органы | Методы исследований |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|- кожа; |На 30-й и 180-й дни эксперимента (плановый |
|- головной мозг; | забор) |
|- сердце; | |
|- аорта; |1. Макроскопические исследования |
|- селезенка; |2. Микроскопические исследования: |
|- легкие; | а) обзорные гистологические исследования |
| |3. Морфометрический анализ |
| |-------------------------------------------|
|- лимфатические узлы; | Вскрытие погибших в течение эксперимента |
|- тимус; | животных (внеплановый забор) |
|- щитовидная железа; | |
|- гипофиз; |1. Макроскопические исследования |
|- ЖКТ: желудок, тонкая и |2. Микроскопические исследования (перечень |
| толстая кишки; |исследуемых органов может быть сокращен до |
|- печень; |минимально необходимого для установления |
|- поджелудочная железа; |причины смерти): |
|- почки; | а) обзорные гистологические исследования |
|- семенники |-------------------------------------------|
| | Дополнительные исследования |
| | |
| |1. Микроскопические исследования: |
| | а) гистохимические исследования; |
| | б) иммуногистохимические исследования |
| |клеточных популяций и их производных. |
| |2. Электронно-микроскопические |
| |исследования |
---------------------------------------------------------------------------
6.4. Иммунологические исследования ГМО проводятся в эксперименте
на мышах линий СВА и С57В1/6 и включают изучение его
иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам:
1) действие на гуморальное звено иммунитета - в тесте определения
уровня гемагглютининов к эритроцитам барана;
2) действие на клеточное звено иммунитета - в реакции
гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана;
3) действие как сенсибилизирующего агента - в тесте
чувствительности к гистамину;
4) действие на естественную резистентность мышей к Salmonella
typhimurium (сальмонеллы мышиного тифа).
В табл. 3 представлены сравнительные характеристики мышей линий
СВА и С57В1/6.
Таблица 3
Характеристики мышей линий СВА и С57В1/6
---------------------------------------------------------------------------
| Действующий фактор | Линия мышей |
| |------------------------------------------------|
| | СВА | С57В1/6 |
|------------------------|------------------------|-----------------------|
|Эритроциты барана | высокочувствительны | низкочувствительны |
|------------------------|------------------------|-----------------------|
|Гиотамин | не чувствительны | чувствительны |
|------------------------|------------------------|-----------------------|
|Salmonella typhimurium | не чувствительны | чувствительны |
---------------------------------------------------------------------------
6.4.1. Схема проведения эксперимента
---------------------------------------------------------------------------
|Вид животных | мыши линий СВА и С57В1/6 |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Пол | самцы |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Возраст | половозрелые |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Исходная масса тела | 18 - 20 г |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Распределение по |Животных каждой линии делят на 2 группы: |
|группам | группа "контроль" получает рацион с включением |
| | традиционного аналога исследуемого ГМО; |
| | группа "опыт" получает рацион с включением |
| | исследуемого ГМО |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Рацион <*> |Пищевая и биологическая ценность рациона |
| |полностью удовлетворяет физиологические |
| |потребности животных |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Карантин |не менее 7-ми дней |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Условия содержания |Животные получают свободный доступ к корму и |
| |воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом |
| |помещении |
---------------------------------------------------------------------------
--------------------------------
<*> Состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.
Исследования начинают через 21 день с момента перевода мышей на
экспериментальные рационы. В течение эксперимента ведутся наблюдения
за поедаемостью корма и общим состоянием животных.
6.4.2. Исследуемые показатели:
1) действие ГМО на гуморальное звено иммунитета.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 20
животных) и опытной (не менее 20 животных) групп обеих линий
внутрибрюшинно вводят 0,5 мл эритроцитов барана (20 млн. клеток/мл).
Забор крови для исследований проводится на 7-й, 14-й и 21-й день после
введения эритроцитов барана. Сыворотку крови титруют в реакции
гемагглютинации общепринятым методом. Полученные данные обрабатывают
методами вариационной статистики с использованием t-критерия
Стьюдента. Результаты приводятся в виде M +/- m, где M - выборочное
среднее измеряемых величин, m - стандартная ошибка.
2) действие ГМО на клеточное звено иммунитета.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15
животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий подкожно
в межлопаточную область вводят 0,5 мл эритроцитов барана (2 млн.
клеток/мл). Через пять дней всем мышам в подушечку одной задней лапы
вводят разрешающую дозу эритроцитов барана - 0,02 мл (1 млрд.
клеток/мышь); в контрлатеральную лапу - 0,02 мл 0,95%-ного раствора
хлорида натрия. Местную воспалительную реакцию оценивают через 18 - 20
часов путем определения массы опытной и контрольной лапок.
Интенсивность местной реакции определяют по индексу реакции (ИР).
3) действие ГМО как сенсибилизирующего агента к гистамину.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15
животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий
внутрибрюшинно вводят гистамин гидрохлорид (2,5 мг/мышь в 0,5 мл
физиологического раствора). Реакцию учитывают через 24 часа по
проценту гибели мышей.
4) действие ГМО на естественную резистентность мышей к S.
typhimurium изучают на модели внутрибрюшинного заражения мышей
десятикратно отличающимися дозами S. typhimurium штамм 415. Через 21
день эксперимента мышей контрольной (не менее 30 животных) и опытной
(не менее 30 животных) групп обеих линий заражают тремя дозами
культуры: 1000, 100, 10 микробных клеток/мышь. После заражения за
животными наблюдают в течение 21 дня. Вычисляют ЛД50, а также процент
гибели животных по каждой дозе, затем проводят сравнительный анализ
результатов.
6.5. Аллергологические исследования ГМО проводятся в эксперименте
на лабораторных животных: потенциальную аллергенность оценивают,
определяя тяжесть протекания системной анафилаксии и уровня
циркулирующих сенсибилизирующих антител (субклассов IgG1 + IgG4) у
крыс, получающих в составе рациона исследуемый ГМО (группа "опыт") и
его традиционный аналог (группа "контроль"). Метод основан на
количественной сравнительной оценке тяжести реакции системной
анафилаксии, возникающей при внутрибрюшинной (в/б) сенсибилизации
взрослых крыс пищевым антигеном - овальбумином куриного яйца (ОВА) с
последующим внутривенным (в/в) введением сенсибилизированным животным
разрешающей дозы того же белка.
6.5.1. Схема проведения эксперимента
---------------------------------------------------------------------------
|Вид животных | Крысы линии Вистар |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Пол | Самцы |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Возраст | Половозрелые |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Исходная масса тела | 150 - 180 г |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Количество животных в | не менее 25 особей в каждой группе |
|группе в начале | |
|эксперимента | |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Распределение по |Животных делят на 2 группы: |
|группам | группа "контроль" получает рацион с включением |
| | традиционного аналога исследуемого ГМО; |
| | группа "опыт" получает рацион с включением |
| | исследуемого ГМО |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Рацион (табл. 4) |Пищевая и биологическая ценность рациона |
| |полностью удовлетворяет физиологические |
| |потребности животных. Рацион не содержит яичного |
| |белка |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Карантин |не менее 7-ми дней |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Условия содержания |Животные получают свободный доступ к корму и |
| |воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом |
| |помещении |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Продолжительность | 29 дней |
|эксперимента | |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Забор материала для | На 29-й день эксперимента |
|исследований | |
---------------------------------------------------------------------------
Таблица 4
Стандартный рацион вивария
---------------------------------------------------------------------------
| Ингредиент | Масса, г на 1 крысу в день |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Крупа овсяная | 2,5 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Зерновая смесь | 14,0 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Хлеб 2 сорт | 4,0 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Творог | 2,0 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Рыбная мука | 0,5 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Мясо 2 категория | 4,0 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Морковь | 8,0 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Зелень | 8,0 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Рыбий жир | 0,1 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Дрожжи | 0,1 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|NaCl | 0,15 |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Основные нутриенты |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Белок | 3,69 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Жир | 1,28 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Углеводы | 12,42 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Энергия, ккал | 76,0 |
---------------------------------------------------------------------------
6.5.2. Исследуемые показатели:
На 1-й, 3-й, 5-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют ОВА, а на
21-й день эксперимента вводят дополнительную ("бустерную") дозу
антигена, уменьшенную в 10 раз в сравнении с первоначальной. Кормление
рационами продолжают до утра 29-го дня эксперимента и затем вводят
раствор ОВА в/в, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть
развивающейся реакции анафилаксии по показателям числа летальных
реакций, общего числа судорожных реакций и величины анафилактического
индекса. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс
отбирают 0,1 - 0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня
специфических антител.
Иммуноферментное определение уровней циркулирующих специфических
антител к ОВА проводят согласно. Статистическую обработку результатов
проводят согласно U-критерию Фишера для долевых показателей,
непараметрическим критериям хи-квадрат и Мана-Уитни с использованием
пакетов программ Excel и SPSS 11.5.
6.6. Генотоксикологические исследования ГМО проводятся в
эксперименте на лабораторных животных. Оценка потенциальной
генотоксичности ГМО включает выявление повреждений ДНК и выявление
мутагенной активности в эксперименте in vivo. Метод выявления
мутагенной активности основан на учете хромосомных аберраций в
метафазных клетках пролиферирующих тканей. Регистрация повреждений ДНК
предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного
гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет).
6.6.1. Схема проведения эксперимента
---------------------------------------------------------------------------
|Вид животных | мыши линии С57В1/6 |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Пол | самцы |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Возраст | половозрелые |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Исходная масса тела | 18 - 20 г |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Количество животных в | не менее 15 особей в каждой группе |
|группе в начале | |
|эксперимента | |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Распределение по |Животных делят на 2 группы: |
|группам | группа "контроль" получает рацион с включением |
| | традиционного аналога исследуемого ГМО; |
| | группа "опыт" получает рацион с включением |
| | исследуемого ГМО |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Рацион <*> |Пищевая и биологическая ценность рациона |
| |полностью удовлетворяет физиологические |
| |потребности животных |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Карантин |не менее 7-ми дней |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Условия содержания |Животные получают свободный доступ к корму и |
| |воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом |
| |помещении |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Продолжительность | 30 дней |
|эксперимента | |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Забор материала для | На 30-й день эксперимента |
|исследований | |
---------------------------------------------------------------------------
--------------------------------
<*> Состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.
6.6.2. Исследуемые показатели:
1) в основе метода выявления мутагенной активности лежит
регистрация видимых структурных нарушений хромосом в клетках костного
мозга на стадии метафазы. Анализируют 100 метафаз от каждого
животного. Учитывают число одиночных и парных фрагментов, хроматидных
и хромосомных обменов, ахроматических пробелов (гепов) и разрывов по
центромере, число клеток с множественными повреждениями и клеток с
полной деструкцией хромосом. Оценку результатов цитогенетического
анализа проводят путем сопоставления долей клеток с хромосомными
аберрациями в контрольной и опытной группах.
2) регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности
структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных
клеток (метод ДНК-комет). Метод основан на регистрации различной
подвижности ДНК и возможных фрагментов ДНК лизированных клеток,
заключенных в агарозный гель, в постоянном электрическом поле. При
этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след,
напоминающий "хвост кометы", параметры которого зависят от степени
поврежденности исследуемой ДНК. Общая схема метода включает получение
гель-слайдов (подложки), получение микропрепаратов, лизис, щелочную
денатурацию, электрофорез, нейтрализацию/фиксацию, окрашивание и
микроскопический анализ.
Микроскопический анализ проводят на эпифлуоресцентном микроскопе
с соответствующими для конкретного красителя фильтрами при увеличении
200х - 400х. На каждый микропрепарат анализируют не менее 100
"ДНК-комет". Анализ "ДНК-комет" может проводиться визуально или с
помощью программно-аппаратного комплекса.
6.7. Исследования репродуктивной токсичности ГМО проводятся в
эксперименте на лабораторных животных и включают:
1) изучение влияния на генеративную функцию;
2) изучение эмбриотоксического и тератогенного действий,
регистрируемых в пренатальном и постнатальном периодах развития.
6.7.1. Схема проведения эксперимента
---------------------------------------------------------------------------
|Вид животных | крысы линии Вистар |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Пол | самцы, самки |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Возраст | 40 - 50 дней |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Исходная масса тела | 70 - 80 г |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Количество животных в | не менее 50 особей в каждой группе |
|группе в начале | /\ |
|эксперимента | / |
| | 30 о, 20 о |
| | + |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Распределение по |Животных делят на 2 группы: |
|группам | группа "контроль" получает рацион с включением |
| | традиционного аналога исследуемого ГМО; |
| | группа "опыт" получает рацион с включением |
| | исследуемого ГМО |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Рацион <*> |Пищевая и биологическая ценность рациона |
| |полностью удовлетворяет физиологические |
| |потребности животных |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Карантин |не менее 7-ми дней |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Начало опытного |за 45 - 50 дней перед первым спариванием |
|вскармливания | |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Условия содержания |Животные получают свободный доступ к корму и |
| |воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом |
| |помещении |
---------------------------------------------------------------------------
--------------------------------
<*> Состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.
6.7.2. Исследуемые показатели:
6.7.2.1. Интегральные показатели
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Периодичность сбора данных |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|Общее состояние животных (внешний вид, | каждые 2 дня |
|двигательная активность, состояние шерстного| |
|покрова) | |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|Поедаемость корма | ежедневно |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|Масса тела | каждые 7 дней |
---------------------------------------------------------------------------
6.7.2.2. Показатели, характеризующие генеративную функцию
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Сроки сбора данных |
|-------------------------------------------------|-----------------------|
|Морфологические исследования семенников | половозрелые особи |
|(определяют индекс сперматогенеза, среднее | |
|количество нормальных сперматогоний в каждом | |
|канальце, относительное количество канальцев с | |
|12-й стадией мейоза) | |
|-------------------------------------------------| |
|Морфологические исследования яичников | |
|(примордиальные фолликулы, фолликулы с двумя и | |
|более слоями фолликулярных клеток, третичные | |
|фолликулы, атретические тела, желтые тела, общее | |
|количество генеративных форм) | |
---------------------------------------------------------------------------
6.7.2.3. Показатели, характеризующие пренатальное развитие
потомства
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Сроки сбора данных |
|-------------------------------------------------|-----------------------|
|1. Забой и вскрытие не менее 7 беременных самок | 19 - 20-й день |
| на группу | беременности |
|-------------------------------------------------| |
|2. Визуальное исследование матки, плаценты, | |
| плодов: выявление живых и мертвых плодов, | |
| подсчет количества желтых тел, мест | |
| имплантации, количество резорбций по правому и| |
| левому рогу матки (с последующим вычислением | |
| пред- и постимплантационной эмбриональной | |
| смертности) | |
|-------------------------------------------------| |
|3. Анализ эмбрионального материала (не менее 5-ти| |
| плодов от каждой крысы) | |
---------------------------------------------------------------------------
6.7.2.4. Показатели, характеризующие постнатальное развитие
потомства
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Сроки сбора данных |
|------------------------------------------------|------------------------|
|1. Контроль рождения потомства | 20 - 22-й дни |
| | беременности |
|------------------------------------------------|------------------------|
|2. Учет величины помета в день родов, подсчет | 1-й день жизни |
|количества живых и мертвых крысят, подсчет | |
|особей разного пола, установление внешних | |
|уродств, измерение массы тела, определение | |
|краниокаудального размера | |
|------------------------------------------------|------------------------|
|3. Учет показателей физиологического развития | 1 - 30 дни жизни |
|крысят: срок отлипания ушных раковин, появление | |
|первичного волосяного покрова, прорезывание | |
|резцов, открытие глаз, опускание семенников, | |
|открытие влагалища; выживаемость потомства | |
|------------------------------------------------|------------------------|
|4. Измерение массы тела и роста крысят | 1, 4, 7, 14, 21 и 25 |
| | дни жизни |
---------------------------------------------------------------------------
6.7.3. Отчет по результатам исследований репродуктивной
токсичности ГМО должен включать цифровые данные в форме таблиц,
содержащих основные сведения, необходимые для суждения о наличии или
отсутствии у исследуемого ГМО неблагоприятного действия на
внутриутробное развитие и процессы репродукции.
Приложение 2
УТВЕРЖДЕНО
Постановлением Главного
государственного
санитарного врача
Российской Федерации
от 30 ноября 2007 года
N 80
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
|
Фрагмент документа "О НАДЗОРЕ ЗА ОБОРОТОМ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГМО".