Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ ТЕСТОВ ЦИСТ ЛЯМБЛИЙ И ООЦИСТ КРИПТОСПОРИДИЙ ДЛЯ ГИГИЕНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВОДООЧИСТКИ".
3.2. Подготовка модельной жидкости
Лаборатории, осуществляющие сертификационные испытания
водоочистных устройств по паразитологическому показателю, должны иметь
запас максимально очищенной взвеси цист лямблий (Giardia lamblia =
Lamblia intestinalis) в объеме не менее 25 мл с содержанием цист не
менее 10000 экз. в 1 мл.
При испытании водоочистных устройств, использующих химические и
физические (УФ-лучи, МИО, озон и др.) факторы воздействия,
используются только жизнеспособные тест-объекты. Цисты лямблий,
выделенные из фекалий человека, сохраняют свою жизнеспособность в
полном объеме в течение 10 суток при условии хранения их при 4 ЬC.
3.2.1. Материалом для получения жизнеспособных цист лямблий могут
служить фекалии больных лямблиозом лиц и лиц-цистоносителей. Материал
может быть получен в инфекционных больницах (особое внимание должно
быть обращено на детские отделения), кишечных кабинетах поликлиник,
гастроэнтерологических отделениях больниц и клиник, паразитологических
лабораториях центров госсанэпиднадзора.
Специалист, осуществляющий подготовку взвесей тест-объектов,
должен руководствоваться СП 1.2.731-99 (п. 2.8).
Цисты лямблий выделяют из оформленных или полуоформленных фекалий
инвазированных лямблиями людей. Для этого используются методы
обнаружения цист лямблий, описанные в нормативно-методических
документах МУК 4.2.735-99 (п. 2.3).
Фекалии, в которых обнаруживаются цисты лямблий более 100 экз. в
одном поле зрения при 200-кратном увеличении микроскопа (окуляр - 10x,
объектив - 20x), следует подвергать соответствующей дальнейшей
обработке.
3.2.1.1. Для получения взвеси цист лямблий фекалии, их
содержащие, в количестве 3 - 5 г (чайная ложка) отмывают изотоническим
раствором (0,85%) хлорида натрия (NaCl) путем повторного
центрифугирования (3 мин. x 1500 об./мин.) до образования прозрачной
надосадочной жидкости, которую осторожно удаляют путем пипетирования.
В оставшийся осадок фекалий добавляют флотирующий раствор объемом, в 3
- 4 раза превышающим объем фекалий (рис. 1) <*>.
--------------------------------
<*> Рисунки не приводятся.
3.2.1.2. В качестве флотационной жидкости используется насыщенный
(30%) раствор сахарозы (насыщение достигается при условии
нерастворения кристаллов сахарозы в воде с температурой около 50 ЬC
при перемешивании или встряхивании).
Раствор следует остудить до 18 - 20 ЬC. Обработка осадка фекалий
флотирующим раствором должна сопровождаться интенсивным перемешиванием
с помощью пипетки или стеклянной палочки.
Для ускорения перехода цист лямблий из осадка в поверхностную
пленку флотанта и очищения их пробирки центрифугируют при 1500
об./мин. в течение 5 мин.
После 10 - 15-минутной экспозиции поверхностную пленку флотанта
снимают металлической петлей (из медной или алюминиевой проволоки) с
внутренним диаметром 5 - 6 мм и переносят в пробирку с изотоническим
раствором хлорида натрия или жидкости Барбагалло (3%-ным раствором
формальдегида на физиологическом растворе). Процедуру повторяют не
менее 3-х раз. Вместо петли можно использовать пипеточный дозатор 0,1
мл, которым осторожно снимают поверхностную пленку. Для получения
концентрированной взвеси цист в работе должно быть задействовано 10 и
более пробирок (емкостью 10 - 15 мл) с фекалиями и флотантом.
3.2.1.3. Для более высокой очистки взвеси цист от фекального
загрязнения ее подвергают дополнительной обработке 8%-ным раствором
сахарозы следующим образом: взвесь цист центрифугируют 3 мин. при 1500
об./мин., надосадочную жидкость удаляют, осадок осторожно переносят на
поверхность 8%-ного раствора сахарозы (6 мл и более) в центрифужной
пробирке. Эту суспензию вновь центрифугируют в течение 2 мин. при 2000
об./мин. Надосадочную жидкость удаляют, а взвесь, обогащенную отмытыми
цистами, хранят в пробирках с резиновыми пробками при 4 ЬC.
Жизнеспособность отмытых цист при данном режиме консервации
сохраняется в течение 10 суток. Даже если суспензия не подвергалась
дополнительно очистке, ее следует освободить от остатков сахарозы
путем 2 - 3-кратного промывания, что резко снизит возможность развития
в суспензии плесени и бактериальной флоры.
При получении взвеси формалинизированных цист лямблий в качестве
начального этапа обработки фекалий может быть использована методика
формалин-эфирного осаждения (см. МУК 4.2.735-99, стр. 13, 14, 25, 26).
При этом могут быть использованы и фекалии, законсервированные в
фиксирующих жидкостях (Барбагалло, Турдыева и др.).
Полученный после такой процедуры осадок, содержащий цисты
лямблий, подвергается затем флотации вышеописанным способом. При этом
в качестве флотанта можно использовать 33%-ный водный раствор
семиводного сернокислого цинка (ZnSO4 H2O).
3.2.2. Количественное определение цист лямблий в полученной
взвеси. Взвесь интенсивно встряхивают путем постукивания пальцем по
пробирке или размешивания стеклянной палочкой. Пипеточным дозатором
отбирают 0,1 мл и переносят на предметное стекло. Образовавшуюся на
стекле каплю накрывают покровным стеклом и микроскопируют при
200-кратном увеличении микроскопа (окуляр - 10x, объектив - 20x). При
таком увеличении микроскопа покровное стекло размером 24 x 24 мм
накрывает площадь, соответствующую 2935 полям зрения. Просматривают не
менее 20 полей зрения и подсчитывают число цист лямблий в каждом из
них. Числа суммируют и делят на число просмотренных полей; получается
среднее число цист в одном поле зрения. Это число умножают на 2935 и
получают усредненное число цист, содержащихся в 0,1 мл взвеси. При
умножении на 10 получают содержание в 1 мл взвеси с поправкой +/- 5%.
Это маточная взвесь, которая должна содержать около 200000 цист
лямблий в 1 мл.
3.2.2.1. Концентрация цист лямблий в 1 мл взвеси, предназначенной
для приготовления модельной жидкости (рабочая суспензия), должна
составлять не менее 2000 единиц. Если она менее этих цифр, то ее
корректируют добавлением более концентрированной взвеси. Если
содержание цист превышает 10% обозначенной нормы, то суспензию
разводят.
3.2.2.2. Взвесь тест-объектов (цисты лямблий) вносят в воду
объемом не менее 50 л (куб. дм), предназначенную для приготовления
модельной жидкости, с таким расчетом, чтобы содержание их в 1 л (куб.
дм) модельной жидкости составляло, как минимум, 15 +/- 2 единицы.
Оптимальный вариант 20 +/- 2 единицы. Это достигается внесением 0,01
мл рабочей взвеси на каждый литр модельной жидкости или 0,5 мл на 50
л. Таким образом, общее число цист в пробе модельной жидкости должно
находиться в пределах 750 - 1000 единиц. Модельную жидкость затем
тщательно (1 - 1,5 мин.) размешивают.
3.2.3. Для приготовления модельной жидкости может быть
использована вода из распределительной сети водопровода при условии ее
соответствия ГОСТ 2874-82 "Вода питьевая. Контроль за качеством по
биологическим и микробиологическим показателям". При несоответствии ее
ГОСТ должна быть использована вода, предназначенная для
фармацевтических нужд или дистиллированная.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ ТЕСТОВ ЦИСТ ЛЯМБЛИЙ И ООЦИСТ КРИПТОСПОРИДИЙ ДЛЯ ГИГИЕНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВОДООЧИСТКИ".