Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ".
Методы оценки действия БАД к пище
на показатели перекисного окисления липидов
Мышам - самцам линии Balb/с вводят 0,25 мл 7%-ного масляного
раствора CCl4 - одного из сильнейших стимуляторов ПОЛ, внутримышечно
или алиментарно, через 15 - 20 мин. животным "per os" вводят
исследуемую БАД к пище (5 животных в группе), 5-ти мышам контрольной
группы вводят аналогичный объем физиологического раствора. Через 2
сут. животных забивают, выделяют печень и определяют продукты
перекисного окисления липидов, такие как диеновые конъюгаты
(появляются на начальных этапах перекисного окисления), гидроперекиси
липидов (обнаруживаются на более поздних этапах перекисного окисления)
и малоновый диальдегид (один из наиболее важных конечных продуктов
перекисного окисления липидов).
а. Определение малонового диальдегида в гомогенате печени мыши.
Печень мыши растирают в гомогенезаторе Поттера в 3 мл 0,025 М
трис-HCl (pH 7,4), содержащей 0,175 М хлорида калия. Гомогенат по 2,5
мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок добавлением 1 мл
17%-ного раствора ТХУ (конечная концентрация 5%). Образующийся осадок
отделяют центрифугированием в течение 10 мин. при 4000 g. Надосадочную
жидкость переносят в пробирки, добавляют по 1 мл 0,8%-ного водного
раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и помещают пробы на 10 мин. в
кипящую водяную баню. В качестве контроля используют пробы, содержащие
вместо надосадочной жидкости буфер (pH 7,4). После развития розовой
окраски пробы охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую
плотность при 532 нм. Количество малонового диальдегида рассчитывают,
5 -1 -1
используя молярный коэффициент экстикции 1,56 x 10 см x М , а
полученный результат выражают в н-молях на пробу (152).
б. Определение диеновой конъюгации полиненасыщенных высших жирных
кислот в гомогенате печени мыши.
Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера с 9 мл
экстрагирующей смеси гептана с изопропиловым спиртом в объемном
отношении 1:1. Полученную суспензию центрифугируют 10 мин. при 4000 g.
Надосадочную фракцию переносят в пробирки и добавляют одну десятую
часть объема дистиллированной воды. После 2-кратного встряхивания и
расслаивания фаз отсасывают гитпановую фазу. К равным объемам по 0,5
мл добавляют этиловый спирт в отношении 1:5 - 1:10. Оптическую
плотность проб измеряют при 233 нм. В качестве контроля используют
только экстрагирующую смесь.
Содержание диеновых конъюгатов рассчитывают, исходя из величины
молярного коэффициента экстинкции при 233 нм для сопряженных диенов
5 -1 -1
ПНЖК, равного 2,2 x 10 см x М (152).
в. Определение гидроперекиси липидов в гомогенате печени мыши.
Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера в 3 мл 0,025 М
трис HCl буфера (pH 7,4), содержащей 0,175 М хлорида калия. Гомогенат
по 2,0 мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок
добавлением 0,2 мл 50%-ного раствора ТХУ (конечная концентрация 5%).
Образующийся осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин. при
4000 g. 2 мл надосадочной жидкости доводят 96%-ным этанолом до 27 мл.
К равным объемам до 27 мл добавляют 0,2 мл концентрированной соляной
кислоты и 0,025 мл 5%-ного раствора соли Мора в 3%-ной соляной
кислоте, пробы интенсивно встряхивают. Точно через 30 с приливают 1 мл
20%-ного раствора тиоцианата аммония, после чего развивается малиновая
окраска. В качестве контроля используют пробы, содержащие 96%-ный
этанол вместо НЖ. Изменение оптической плотности проводят в течение 10
мин. после добавления тиоцианата аммония при 480 нм. Об относительном
уровне гидроперекисей в биологическом материале судят по величине
оптической плотности при 480 нм (152).
|
Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ".