Страницы: 1 2
0,9%-ным раствором натрия хлорида (в соотношении 3:2).
Для культивирования туляремийных бактерий применяются различные
варианты агаровых сред лабораторного изготовления на рыбных, мясных,
дрожжевых основах с обязательным добавлением цистина (цистеина) 0,1%;
глюкозы 1,0%; дрожжевого экстракта (источник витамина В).
Чувствительность указанных агаровых сред можно повысить добавлением
дефибринированной кроличьей или лошадиной крови (5 - 10%).
На свежей агаровой среде приживаются единичные бактерии, при этом
формируются колонии, которые становятся заметными через 2 - 3 суток
инкубации, редко - в более отдаленные сроки. Посевы следует
выдерживать при 37 ёС до 10 - 12 суток. При посеве взвеси из растертых
тканей животного высокоэффективные агаровые среды позволяют
обнаруживать единичные бактерии и не уступают биологической пробе. При
исследовании трупов животных в первую очередь производят посев из
селезенки, печени, лимфатического узла. При посеве из недостаточно
свежих органов животных полезно использовать селективные добавки (СД).
В качестве СД можно применять пенициллин (100 ед./мл), ампициллин (100
ед./мл), полимиксин (50 - 100 мкг/мл), кефзол (или цефалексин),
амфотерицин В (или амфоглюкамин), ристомицин сульфат и некоторые
другие.
Свернутая желточная среда Мак - Коя. Среду готовят из желтков
куриных яиц, которые тщательно моют, протирают спиртом, обжигают на
пламени горелки, разбивают, сливают желтки, отделяя их от белка, в
стерильный градуированный сосуд, смешивают с 0,9%-ным раствором натрия
хлорида (рН 7,0 - 7,2) в соотношении: 60% желтка и 40% раствора
хлористого натрия. Жидкую среду разливают в пробирки по 4 - 5 мл и
помещают в аппарат для свертывания сывороток при наклонном положении
пробирок, чем достигают скашивания среды. Свертывание среды производят
при 80 ёС в течение 1 ч. Среду сохраняют при 4 - 6 ёС, предохраняя от
высыхания. Правильно приготовленная среда должна иметь на дне пробирки
конденсационную жидкость. Приготовленную среду можно использовать в
течение 1 месяца. При необходимости в среду добавляют СД.
Кровяная среда Емельяновой. Среду готовят на рыбно-дрожжевом
гидролизате. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 20 мл
гидролизата свежей рыбы, 10 мл гидролизата желатины, 2,5 мл аутолизата
дрожжей, 0,5 г хлорида натрия, 1 г глюкозы, 0,1 г цистина (цистеина),
1,5 - 2,5 г агара (в зависимости от его качества); рН среды 7,0 - 7,2.
После стерилизации в расплавленную, и охлажденную до 45 ёС среду
добавляют 10 мл свежей кроличьей или лошадиной дефибринированной
крови, разливают в пробирки (или чашки) и скашивают. Правильно
приготовленная кровяная среда хранится при 4 - 6 град.С в течение 1
месяца. Однако в процессе хранения чувствительность среды постепенно
снижается. При необходимости в среду одновременно с кровью добавляют
(СД).
Разработаны и используются на практике питательные сухие агаровые
среды для культивирования и выделения туляремийного микроба,
содержащие все необходимые факторы роста и не требующие добавления
крови (или желтка): питательная среда элективная для выделения
возбудителя туляремии сухая (АДЭТ); питательная среда культивирования
и выделения туляремийного микроба (FT); основа питательной среды для
культивирования туляремийного микроба сухая и другие, разрешенные к
применению для этих целей в установленном порядке.
Биологический метод. Биологическая проба является самым
эффективным способом обнаружения туляремийных бактерий в любом
исследуемом материале. Биологическим методом можно исследовать органы
павших или убитых диких млекопитающих, кровососущих членистоногих,
гидробионтов, воду, смывы с различных субстратов, т.е. материалы, где
могут содержаться живые туляремийные бактерии. Для биологической пробы
обычно используют белых мышей, которые заболевают и гибнут от
туляремии при подкожном введении суспензии, содержащей единичные
бактерии. При массивном инфицировании исследуемых объектов мыши
погибают уже на 3 - 4 сутки; при меньшей обсемененности материала
гибель животных может затянуться до 7 - 9 суток, иногда до 15 - 20
суток. В большинстве случаев животные погибают от туляремии с
характерными патолого-анатомическими изменениями: обнаруживаются
воспалительные изменения ткани на месте заражения (плотный
инфильтрат), увеличение, уплотнение и гиперемия лимфатических узлов,
особенно близлежащих к месту заражения, резкая гиперемия сосудов
подкожной клетчатки, уплотнение и увеличение селезенки, печени,
увеличение и гиперемия надпочечников, гиперемия тонкого кишечника. В
мазках - отпечатках из селезенки, печени и крови (при окраске по
Романовскому - Гимзе или путем люминесцентной микроскопии)
обнаруживают большое количество туляремийных бактерий, а в посеве на
специальные питательные среды селезенки и печени уже через 18 - 24 ч.
появляется рост культуры возбудителя туляремии. Для биологической
пробы могут быть использованы и морские свинки, обладающие такой же
высокой чувствительностью к туляремии, как и белые мыши, а также дикие
грызуны 1-й группы (обыкновенные полевки, домовые мыши), отловленные
на неэпизоотических территориях и выдержанные в карантине 30 суток.
Биопробных животных содержат поодиночке. При гибели биопробных
животных или обнаружении у забитых характерных для туляремии
патолого-анатомических изменений осуществляют следующий пассаж через
белую мышь (подкожным или накожным методами). Биопробных животных
выдерживают: белых мышей до 15 - 21 суток, морских свинок - до 25
суток, после чего забивают.
Иммуносерологические методы исследования. Возможность
исследования материала, не пригодного для бактериологического
исследования, делает серологические методы в ряде случаев основным
методическим приемом, позволяющим выявить туляремийные эпизоотии.
Все найденные трупы грызунов подлежат обязательному
серологическому исследованию на наличие туляремийного антигена
параллельно с биологическим и бактериологическим исследованием,
включая люминесцентную микроскопию. Серологические методы особенно
эффективны при поисках антигена в ПП, ПХМ, субстратах гнезд и других
объектах внешней среды.
При исследовании трупов диких или лабораторных животных готовят
суспензию из кусочков органов животных (селезенка, печень) путем
растирания их в ступке с добавлением 0,9%-ного раствора натрия хлорида
из расчета 1:5 или 1:10. Полученную суспензию обеззараживают в
соответствии с п. 2.8.16 СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с
микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)", фильтруют
(лучше через асбестовую вату) для получения относительно прозрачного
фильтрата. Можно использовать остатки суспензии из органов,
приготовленных для постановки биологической пробы.
Для исследования субстрата гнезда грызунов желательно брать его
целиком вместе с прилегающими слоями почвы. Материал заливают 0,9%-ным
раствором натрия хлорида с избытком (примерно 10 мл). Через 1 - 6 ч.
надосадочную жидкость отсасывают, обеззараживают в соответствии с п.
2.8.16 СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II
групп патогенности (опасности)", фильтруют и используют в
серологических реакциях.
Для серологического исследования бактериальной культуры последнюю
выращивают 2 суток при 37 град.С на желточной или агаровой среде,
готовят взвесь на физиологическом растворе (рН 7,0 - 7,2) с
9
концентрацией 1 х 10 м.к./мл по оптическому стандарту мутности,
обеззараживают в соответствии с п. 2.8.16 СП 1.3.1285-03 "Безопасность
работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)".
Взвесь разводят в 10 раз до концентрации 100 млн. м.к./мл и используют
в серологических реакциях.
Наиболее эффективной и специфичной серологической реакцией для
выявления туляремийного антигена при исследовании органов животных,
ПП, ПХМ, субстрата гнезд, почвы и тому подобного является реакция
нейтрализации антител (РНАт) с туляремийным антигенным эритроцитарным
диагностикумом. При массовых исследованиях ПП, ПХМ, других объектов
внешней среды за диагностический титр принимают разведение фильтрата
1:20 и выше. Реакции в более низких титрах расценивают как
сомнительные. При исследовании некоторых объектов (бактериальные
суспензии, органы животных и др.) помимо РНАт можно применять
иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию объемной агломерации (РОА),
реакцию коагглютинации (РК) и некоторые другие методы, с успехом
используемые в отдельных регионах и учреждениях.
Иммуноферментный анализ на твердофазном носителе (ИФА)
используется для выявления туляремийного антигена в различных
объектах: органы животных, ПП, ПХМ, другие объекты внешней среды, а
также для идентификации выделенных культур возбудителя туляремии.
Метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью,
возможностью количественной и автоматизированной оценки результатов,
воспроизводимостью и стандартностью основных ингредиентов анализа. С
3 4
помощью ИФА возможно обнаружение n х 10 - n х 10 туляремийных бактерий
в 1 мл или 1 - 5 нг/мл туляремийного антигена.
Для постановки ИФА используют диагностическую иммуноферментную
тест-систему для определения туляремийного антигена.
Наиболее эффективными и доступными методами выявления антител
являются реакция агглютинации (РА) и реакция непрямой гемагглютинации
(РНГА). Титры антител у переболевших диких животных колеблются в
пределах 1:10 - 1:320, редко выше, в зависимости от давности
заболевания. У сельскохозяйственных животных они могут достигать 1:320
- 1:640, но чаще бывают низкими. Наличие антител у животных указывает
на контакт животного с возбудителем туляремии и наличие эпизоотии. Для
выявления антител у животных могут быть использованы сыворотка, плазма
или "смывы" из грудной полости.
Исследование методом ПЦР. В ряде случаев для определения ДНК
возбудителя туляремии в различных объектах применяется ПЦР. Метод
превышает по чувствительности серологические тесты и используется для
индикации и ускоренной диагностики туляремии. Подготовку материала и
проведение реакции осуществляют в соответствии с МУ 1.3.1794-03
"Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала,
инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности" и
инструкцией по применению препарата с использованием ПЦР-тест-системы
для выявления ДНК возбудителя туляремии.
4.4.3. Идентификация возбудителя туляремии.
Идентификацию осуществляют на основании совокупности следующих
признаков:
- морфологии и окраски бактерий в мазках и специфического
свечения в РИФ;
- характера роста на свернутой желточной среде;
- отсутствия роста на простых питательных средах;
- агглютинации специфической туляремийной сывороткой;
- патогенности для белых мышей и морских свинок.
Выделенная культура должна иметь характерный для микроба
туляремии рост на свернутой желточной среде в виде извилистого, слегка
блестящего (не сухого) почти бесцветного налета не очень сильно
выраженной слизистой консистенции, хорошо снимающегося петлей.
Культура легко суспендируется. Для изучения морфологии и
тинкториальных свойств готовят мазок на предметном стекле, который
фиксируют и окрашивают по Граму. В мазке возбудитель туляремии
представляет собой мелкую, грамотрицательную коккобактерию. В
окрашенных мазках из культуры с плотной среды обнаруживается обильная
слизь. Присутствие в мазке окрашенной слизи весьма характерно для
возбудителя туляремии. Для проверки отсутствия роста на простых
питательных средах используют слабощелочной питательный агар и бульон.
Антигенную специфичность выделенной культуры проверяют с помощью
реакции агглютинации с лошадиной (коммерческой) агглютинирующей
сывороткой. Для этого испытуемую культуру выращивают в течение 2 суток
при 37 град.С на свернутой желточной среде в количестве 2 - 3
пробирок. Чистоту посева контролируют бактериоскопией. Реакцию
агглютинации (РА) ставят общепринятым способом в пробирках. В качестве
антигена используют живую испытуемую культуру, суспендированную в
0,9%-ном растворе натрия хлорида (рН 7,0 - 7,2) до концентрации 1 х
9
10 м.к./мл по оптическому стандарту мутности 10 единиц (ОСО
42-28-86П). После добавления антигена к разведениям сыворотки пробирки
выдерживают 2 ч. при 37 ёС, затем 12 - 18 ч. при комнатной
температуре, после чего проводят учет результатов. Культура должна
агглютинироваться до титров, указанных в инструкции по применению
препарата. При этом должна иметь место четкая реакция,
сопровождающаяся полным просветлением жидкости и выпадением на дно
пробирки плотного агглютината. При встряхивании пробирки агглютинат
разбивается на крупные хлопья, а жидкость остается прозрачной.
Специфичность выделенной культуры может быть подтверждена также с
помощью РИФ. При обработке культуры туляремийной люминесцирующей
сывороткой обнаруживают специфическое яркое зелено-желтое свечение
бактерий.
При возможности проводят проверку вирулентности выделенных
культур, но не позднее месячного срока после их выделения.
Ориентировочное определение вирулентности проводят, как правило, на
одном из двух видов животных (белые мыши или морские свинки). Для
заражения используют 2 дозы: 1 и 10 м.к. по 2 - 3 животных на каждую
дозу. Свежевыделенные туляремийные культуры при подкожном введении
вызывают гибель белых мышей (морских свинок) при дозе 1 м.к. с
обнаружением характерных для туляремии изменений в органах и
выделением чистой культуры. При необходимости определяют LD для
50
лабораторных животных.
На территории Российской Федерации циркулируют и выделяются
культуры голарктического подвида возбудителя туляремии F. tularensis
subspecies holarctica, различающиеся по чувствительности к
эритромицину (и другим макролидам). Для определения этого свойства
используют диски с эритромицином, содержащие 15 мкг антибиотика. Эта
концентрация антибиотика позволяет дифференцировать штаммы
туляремийного микроба на два биологических варианта: биовар I Ery(s) и
биовар II Егу(r). Для определения принадлежности к тому или иному
биовару готовят суспензию испытуемой культуры в концентрации 1 х
9
10 м.кл./мл по оптическому стандарту мутности 10 единиц (ОСО
42-28-86П). Вносят 0,5 мл такой суспензии на чашку с агаровой средой,
равномерно распределяя по поверхности, после чего накладывают в
центральную часть чашки диск с эритромицином. Чашку помещают в
термостат при 37 град.С. Учет и оценку результатов производят через 1
- 2 суток. При посеве чувствительной к эритромицину культуры вокруг
диска с антибиотиком обнаруживают выраженную зону задержки роста
диаметром 2 - 3 см; при посеве культуры, резистентной к эритромицину,
по всей поверхности чашки отмечается равномерный рост.
5. Лабораторная диагностика туляремии у людей
Лабораторная диагностика туляремии у людей основывается на
иммунологических (сероаллергическая диагностика) и бактериологических
методах.
5.1. Аллергические и серологические методы
Аллергические и серологические методы играют основную роль в
лабораторной диагностике туляремии.
В патогенезе туляремийной инфекции значительную роль играет
развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), выявление
которой может служить методом аллергической диагностики туляремии.
Метод основан на особенностях организма человека, заболевшего или
переболевшего туляремией, отвечать местной аллергической реакцией в
виде гиперемии и инфильтрата на введение туляремийного антигена
(тулярина). У больных туляремией людей кожная аллергическая реакция
становится положительной обычно с 3 - 5 суток болезни, реже - в более
поздние сроки, и сохраняется многие годы, благодаря чему аллергический
метод служит для ранней или ретроспективной диагностики, являясь при
этом строго специфичным. У привитых живой вакциной также возникает
аллергическая реактивность, но она развивается медленнее (через 10 -
15 дней после вакцинации). Аллергический ответ у вакцинированных
сохраняется 5 - 6 лет, иногда дольше, и может служить методом
определения сохранности поствакцинального иммунитета. Кожную
аллергическую реакцию выполняют как накожно, так и внутрикожно с
соответствующим тулярином. Следует помнить, что аллергическая реакция
на введение антигена - это общая реакция организма, которая при
развившемся инфекционном процессе может вызвать ухудшение состояния
больного, а местная реакция иногда сопровождается некрозом. Поэтому в
качестве диагностического приема у больных людей пробу с тулярином
применяют с осторожностью.
Для внутрикожной пробы применяют внутрикожный тулярин - взвесь
туляремийных бактерий вакцинного штамма, убитых нагреванием при 70 ёС
в течение 1 ч. Взвесь готовят на 0,9%-ном растворе натрия хлорида,
содержащем 3% глицерина. В 1 мл препарата содержится 500 млн. убитых
бактерий. Выпускают препарат в запаянных ампулах, содержащих 1 мл
препарата (или 10 человеко-доз). Препарат предназначен в первую
очередь для диагностики туляремии.
Тулярин в количестве 0,1 мл вводят стерильным шприцем строго
внутрь кожи левого предплечья (на границе верхней и средней трети).
Кожу предварительно обрабатывают спиртом и эфиром. На месте введения
препарата образуется беловатый пузырек диаметром 3 - 4 мм, который
примерно через 30 мин. рассасывается.
Учет и оценка реакции. Учет реакции производят через 24 - 48 ч.
путем осмотра и ощупывания участка кожи, куда был введен тулярин. При
положительной реакции на месте введения тулярина уже через 6 - 10 ч.
обнаруживаются покраснение (гиперемия) и отек (инфильтрат). Через 24
ч. реакция кожи выражена вполне отчетливо и имеет вид
гиперемированного, нередко болезненного инфильтрата. Реакцию считают
положительной при наличии инфильтрата и гиперемии диаметром не менее
0,5 см. Интенсивность реакции определяют по величине реагирующего
участка (отека и гиперемии) кожи, который измеряют в сантиметрах в
двух взаимно перпендикулярных направлениях. Изменения кожи в виде
гиперемии без инфильтрата, исчезающие через 48 ч., расценивают как
отрицательный результат. В сомнительных и подозрительных случаях
возможна повторная постановка реакции, т.к. отрицательный результат
мог быть обусловлен ранним сроком от начала заболевания. Так,
аллергическая реакция может запаздывать при тяжелых формах инфекции.
Запаздывание реакции может также иметь место при раннем применении
антибиотиков для лечения больного. В ряде случаев аллергическая
реакция сопровождается образованием пустулы или кратковременным
лимфангоитом с незначительным увеличением регионарных лимфатических
узлов и повышением температуры тела на 1 - 1,5 град. С в течение 1 - 2
дней. Известны редкие случаи образования некроза на месте инъекции
тулярина. В этой связи для диагностики туляремии предпочтительнее
использовать аллергические методы in vitro или серологические методы.
Для накожной пробы применяют накожный тулярин - взвесь
туляремийных бактерий вакцинного штамма, убитых нагреванием при 70 ёС
в течение 1 ч. Взвесь готовят в 0,9%-ном растворе натрия хлорида,
содержащем 3% глицерина. В 1 мл препарата содержится 10 млрд. убитых
бактерий. Выпускают препарат в запаянных ампулах, содержащих 1 мл, что
составляет 20 человеко-доз. Препарат предназначен в первую очередь для
определения иммунитета у привитых против туляремии или для
ретроспективного обследования.
Перед употреблением ампулу с накожным тулярином встряхивают до
образования равномерной взвеси. Одну каплю тулярина глазной пипеткой
наносят на обработанную спиртом и эфиром кожу наружной поверхности
левого плеча в его средней трети. Через каплю стерильным
скарификатором делают две параллельные насечки длиной 8 - 10 мм,
соблюдая расстояние между насечками 5 мм, до появления росинок крови.
Затем тулярин тщательно втирают в насечки плоской стороной
скарификатора в течение 1 мин. Тулярин применяют немедленно после
вскрытия ампулы.
Учет и оценка реакции. Учет реакции производят через 48 - 72 ч.
Положительная реакция выражается отечностью кожи вокруг насечек и
краснотой, которые иногда появляются уже через 24 ч после введения
тулярина, через 48 - 72 ч. реакция ярко выражена и далее постепенно
угасает, полностью исчезая к 7 - 10 дню. Диаметр реагирующего участка
достигает 1 - 2 см. В редких случаях по ходу насечек появляются
везикулы, исчезающие через 2 - 3 дня. Реакцию считают положительной
при величине реагирующего участка кожи не менее 0,5 см и наличии вдоль
насечек ясного покраснения и небольшой отечности (валик). При
правильной технике постановки накожная туляриновая проба по
чувствительности не уступает внутрикожной, но в отличие от последней
не сопровождается повышенными местными или общими реакциями.
Категорически запрещается накожный тулярин вводить внутрикожно или
подкожно, т.к. он может вызвать бурную местную и общую реакции.
Реакция лейкоцитолиза (РЛ) основана на учете разрушения
лейкоцитов сенсибилизированного организма под влиянием специфического
аллергена (антигена), регистрируемого методом in vitro. Реакция лизиса
лейкоцитов становится положительной уже в первые дни после вакцинации
или заболевания (3 - 4 день), удерживается в течение многих лет (у
переболевших - до 40 лет). На 7 - 15 день после вакцинации показатели
лизиса лейкоцитов составляют, в среднем, 49 - 50%, затем постепенно
снижаются, но даже через 1 - 5 лет после вакцинации иногда остаются на
достаточно высоком уровне (30 - 31%). РЛ обладает строгой
специфичностью, дает возможность количественного учета степени
сенсибилизации организма, позволяет получить ответ через несколько
часов после взятия крови.
В две лунки полистироловой пластины вносят по 50 мкл 10%-ного
раствора натрия цитрата, затем в первую (опытную) лунку добавляют 50
мкл антигена (накожного тулярина, содержащего 1,10 (в степени 10)
бактерий в 1 мл)), а во вторую (контрольную) - 50 мкл 0,9%-ного
раствора натрия хлорида. Таким образом, в обеих лунках конечная
концентрация цитрата натрия составляет 5%. Кровь для исследования
берут из пальца руки и в количестве 100 мкл вносят в каждую из двух
лунок. Пластинку закрывают и помещают на 2 ч. в термостат при
температуре 37 ёС. Кровь в лунках тщательно перемешивают стеклянной
палочкой. Затем по 20 мкл крови из обеих лунок поочередно забирают с
помощью микропипеточного дозатора и переносят в соответствующие лунки
планшета для макроагглютинации, содержащие 0,4 мл 3%-ной уксусной
кислоты, подкрашенной до светло-голубого цвета с помощью метиленовой
синьки.
Количество лейкоцитов подсчитывают в крови из обеих лунок в
камере Горяева. Разрушенные клетки, а также клетки, собирающиеся в
кучки, не учитывают. Коэффициент лейкоцитолиза вычисляют по формуле:
M - М
к 0
K% = ------- х 100,
М
к
где:
М - количество лейкоцитов в опыте (первая лунка);
0
М - количество лейкоцитов в контроле (вторая лунка).
к
Для оценки результатов используют следующую шкалу показателей:
К = 15% - отрицательный или сомнительный результат;
К = 16 - 20% - слабо положительный результат;
К = 21 - 30% - положительный результат;
К = 31% и выше - резко положительный результат.
Реакция агглютинации (РА) служит для установления диагноза у
больного или переболевшего (ретроспективный диагноз) и может быть
использована при изучении иммунологического состояния привитых против
туляремии. Обнаружение агглютининов у больного туляремией обычно
отмечается через 10 - 15 дней, при этом агглютинационный титр
сыворотки в этот период составляет 1:50 - 1:100, но далее быстро
нарастает и на 4 - 6 неделе болезни достигает 1:400 - 1:800, реже
1:1600 и выше. По достижении максимальных показателей агглютинационный
титр сыворотки затем медленно снижается и через 6 - 12 месяцев
составляет 1:100 - 1:400, позднее падает до 1:10 - 1:50 и на этом
уровне может удерживаться в течение многих лет. Длительность
сохранения агглютининов делает возможным использование РА для
ретроспективного диагноза. У привитых против туляремии агглютинины
обнаруживаются через 2 - 3 недели, достигают через 4 - 6 недель
максимальных титров 1:160 - 1:320, реже выше, затем снижаются до 1:10
- 1:40 и обычно выявляются в течение 5 - 7 лет после вакцинации
(иногда дольше). В случае необходимости может быть поставлена
кровяно-капельная реакция, которая позволяет выдать ответ в течение 5
мин. и может быть поставлена с сухой каплей крови.
Кровь для исследования у больного (или вакцинированного) берут из
локтевой вены в количестве 3 - 5 мл (для макроагглютинации) или из
пальца руки (для кровяно-капельной реакции).
Антигеном для РА и кровяно-капельной реакции служит туляремийный
диагностикум, представляющий собой убитую формалином взвесь
туляремийных бактерий вакцинного штамма. В 1 мл препарата содержится
25 млрд. туляремийных бактерий.
Обе реакции ставят в соответствии с инструкцией по применению
диагностикума туляремийного жидкого для объемной и кровяно-капельной
реакции агглютинации.
При серологической диагностике туляремии у человека
диагностическим считается титр 1:100 и выше, однако обязательно должно
быть прослежено его нарастание. При отрицательной или сомнительной
реакции, а также при положительной реакции в низких разведениях
сыворотки у подозрительных на туляремию больных рекомендуют повторить
исследование сыворотки через 7 - 10 дней. Нарастание титра сыворотки в
2 - 4 и выше раза свидетельствует о свежем случае туляремии и
подтверждении диагноза.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) является чувствительным
методом серологической диагностики и используется как для ранней, так
и ретроспективной диагностики, а также для определения
иммунологического состояния привитых. У больных туляремией антитела
обычно обнаруживаются в конце 1-й или на 2-й неделе заболевания, через
1 - 1,5 месяца титры РНГА достигают максимальных показателей (1:10000
- 1:20000, реже выше), после чего снижаются и на уровне 1:100 - 1:200
сохраняются длительное время.
У привитых антитела также обнаруживаются постоянно, однако в
более низких титрах, не превышающих 1:2000 - 1:5000 через 1 - 1,5
месяца после вакцинации, сохраняются в течение нескольких лет на
низком уровне 1:20 - 1:80.
Антигеном для постановки РНГА служит туляремийный эритроцитарный
диагностикум (антигенный). Препарат представляет собой
формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные
туляремийным антигеном, выпускается в жидком и сухом виде. Жидкий
препарат - 10%-ная взвесь эритроцитов в растворе формалина 10%-ной
концентрации. Сухой лиофилизированный препарат - высушенная в вакууме
10%-ная взвесь эритроцитов без консерванта. Перед употреблением его
разводят в соответствии с указаниями на этикетке. Для постановки
реакции в полистироловых пластинах оба препарата применяют в 2,5%-ной
концентрации, а при постановке реакции в микрообъемах - в 0,5%-ной
концентрации.
Техника постановки РНГА описана в инструкции по применению
диагностикума туляремийного эритроцитарного антигенного.
РНГА при туляремии является достаточно специфичной и обнаруживает
некоторые перекрестные реакции только с бруцеллезными сыворотками.
Дифференциальная диагностика возможна по высоте титров в РНГА, которые
значительно выше с гомологичным антигеном.
РНГА может быть выполнена в микрообъемах с помощью микротитратора
типа Такачи (или круглодонных микропланшетах с микропипетками),
который позволяет осуществлять титрование материала в объемах 25 и 50
мкл. Техника постановки реакций, последовательность всех операций
такая же, как и при исследовании в полистироловых пластинах. Следует,
однако, иметь в виду, что чувствительность микрометода обычно на одно
разведение (т.е. в 2 раза) ниже, чем макрометода.
Специфичность положительного результата, полученного в РНГА,
может быть проверена с помощью трехкомпонентной реакции - реакции
торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА).
Иммуноферментный анализ на твердом носителе (ИФА) используют для
диагностики туляремии у больных и переболевших людей, определения
иммунитета у вакцинированных против туляремии. У больных туляремией
специфические антитела обнаруживаются в ИФА между 6 - 10 днями,
достигают максимальных показателей к 4 - 7 неделям, затем уровень их
снижается, но они продолжают длительно (более 10 лет) выявляться после
перенесенного заболевания. ИФА обеспечивает более раннюю (в сравнении
с РА и РНГА) и эффективную иммунологическую диагностику. Титры антител
у больных и вакцинированных колеблются в значительных пределах от
1:400 до 1:40000 и выше и, как правило, в 10 - 20 раз превышают
таковые в РА и РНГА.
Для постановки ИФА используют диагностическую иммуноферментную
тест-систему для определения туляремийных антител. Выявление
туляремийных антител в сыворотках людей происходит за счет
специфического взаимодействия антигена туляремийного микроба,
адсорбированного на планшете, с туляремийными антителами в исследуемой
сыворотке. Образовавшийся комплекс "антиген - антитело" определяют с
помощью антител против иммуноглобулинов человека, меченных
пероксидазой.
В соответствии с назначением тест-система представляет собой
набор ингредиентов для проведения иммуноферментного анализа на
твердофазном носителе и включает в себя: туляремийный липополисахарид;
антитела против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой;
контрольную положительную сыворотку; контрольную отрицательную
сыворотку; набор солей, необходимых для приготовления буферных
растворов; субстрат - О-фенилендиамин (ОФД); твин-20; бычий
сывороточный альбумин (БСА); планшеты для ИФА однократного применения.
Пробы рекомендуется первоначально исследовать параллельно в двух
лунках в разведении 1:200 с последующей раститровкой положительных
сывороток для определения титра антител, используя 2-кратные
разведения сывороток.
При постановке ИФА предусматривают следующие контроли (на каждом
планшете):
- отрицательная сыворотка в разведении 1:200 и выше - отсутствие
окрашивания раствора;
- положительная сыворотка в разведении 1:200 и выше - выраженное
окрашивание раствора (при инструментальной оценке ОП не менее чем в 2
раза выше ОП отрицательной сыворотки);
- контроль конъюгата (вместо сыворотки вносят раствор ФСБ-твин) -
отсутствие окрашивания раствора;
- контроль субстратной смеси (вместо конъюгата вносят раствор
ФСБ-твин) - отсутствие окрашивания раствора.
В сомнительных случаях для подтверждения специфичности
результатов рекомендуется постановка реакции торможения специфическим
антигеном. Диагностическим титром в ИФА считают разведение сыворотки
1:400 и выше. Более подробно методика ИФА отражена в инструкции по
применению тест-системы иммуноферментной для определения туляремийных
антител.
В последние годы для диагностики туляремии разработаны и
некоторые другие методы, в частности основанные на использовании
синтетических носителей для сенсибилизации антигена, с успехом
используемые в отдельных регионах и учреждениях.
Применение непрямого иммунофлуоресцентного (ИФМ) метода для
обнаружения туляремийных антител. При применении непрямого ИФМ для
обнаружения антител к туляремийному микробу заранее готовят мазки из 1
- 2-суточной агаровой культуры возбудителя (1 млрд. взвесь). При этом
на одном предметном стекле делают 8 мазков, фиксируют их в этиловом
спирте в течение 30 мин., не обжигая, высушивают на воздухе и помещают
во влажную камеру. Исследуемую сыворотку разводят 2-кратно с
разведения 1:10 до 1:640 - 1:1280 и наносят пастеровской пипеткой на
мазки, начиная с большего разведения. Влажную камеру с препаратом
помещают в термостат (37 ёС на 30 мин.). Мазок отмывают от
несвязавшихся антител и после подсыхания его вновь помещают во влажную
камеру, докрашивая антивидовой люминесцирующей сывороткой в рабочем
разведении. Дальнейшую обработку препарата ведут, как при прямом
иммунолюминесцентном методе. После просмотра препарата под
люминесцентным микроскопом устанавливают титр антител в исследуемой
сыворотке.
В качестве контролей служат препараты, в которых туляремийные
бактерии обработаны туляремийной сывороткой (положительный контроль) и
сывороткой, не содержащей антитела к возбудителю туляремии
(отрицательный контроль). При исследовании сыворотки больного с
подозрением на туляремию диагностическим считают титр не менее 1:40.
5.2. Бактериологический метод исследования
Бактериологические методы диагностики туляремии имеют
дополнительное значение и не всегда эффективны, что определяется
особенностями течения инфекции у человека с малой обсемененностью
органов и тканей возбудителем. Следует учитывать, что не в любом
материале, взятом от больного, содержатся живые туляремийные бактерии.
Кроме того, выделение возбудителя наиболее вероятно в течение первых 2
- 3 недель от начала заболевания и реже в более поздние сроки.
Выделение и идентификация возбудителя туляремии могут быть
произведены только в лабораториях, имеющих разрешение на работу с
культурой микроорганизмов I или II групп патогенности. Забор и
доставку патологического материала в лабораторию производят с
соблюдением предосторожностей и в соответствии с СП 1.3.1285-03
"Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности
(опасности)".
Использование бактериологического метода при диагностике
туляремии возможно, но, по сравнению с биологическим методом,
малоэффективно, т.к. в организме больного туляремийные бактерии
содержатся в малом количестве. Лишь в редких случаях удавалось
высевать возбудитель туляремии из патологического материала от больных
людей (содержимое язвы на коже, содержимое бубона и т.д.).
Патологический материал от больных может быть исследован методом
посева лишь в первые 2 - 3 недели от начала заболевания. Для этого
используют специальные среды, применяемые для культивирования
туляремийного микроба, разрешенные к применению в Российской Федерации
в установленном порядке. Наиболее чувствительными являются свернутая
желточная среда, желточно-агаровая среда, различные варианты агаровых
сред, содержащих цистин, глюкозу, кровь, другие факторы роста, а также
специальные среды для культивирования туляремийного микроба (раздел
настоящих методических указаний). Скорость появления роста культуры
зависит от количества микробов в исследуемом материале: при посеве
слабо инфицированного материала рост отдельных колоний возможен в
отдаленные сроки, поэтому посевы следует выдерживать в термостате при
37 ёС в течение не менее 10 суток.
5.3. Биологический метод исследования
Биологическая проба является самым чувствительным способом
обнаружения туляремийных бактерий в любом исследуемом материале, в
т.ч. и при исследовании материала от больных людей, т.к. биопробные
животные (белые мыши, морские свинки) заболевают туляремией со
смертельным исходом при подкожном введении единичных бактерий. Однако
при обследовании больных людей даже биологический метод не всегда
надежен, т.к. не в любом образце материала, взятом от больного,
имеются жизнеспособные туляремийные бактерии. В отделяемом кожной язвы
и в пунктате из пораженного лимфатического узла возбудитель туляремии
может быть обнаружен в течение 3 недель от начала заболевания, редко
позднее. Известны случаи выделения возбудителя из мокроты, материала,
взятого из зева (с миндалин) или конъюнктивы глаза. В редких случаях
удается выделить возбудитель из крови, но обычно не позднее первой
декады болезни.
Патологический материал (отделяемое кожной язвы, конъюнктивы
глаза, миндалин или мокроту, пунктат из бубона и др.) смешивают с
небольшим количеством 0,9%-ного раствора натрия хлорида (0,3 - 0,5 мл)
и вводят подкожно белой мыши или внутрибрюшинно морской свинке. Кровь
для исследования (3 - 5 мл) берут из локтевой вены, разводят пополам
тем же раствором и вводят подкожно белым мышам (по 0,5 - 1,0 мл) или
внутрибрюшинно морским свинкам (5 - 7 мл). Сроки гибели биопробных
животных зависят от степени инфицированности патологического материала
и составляют 4 - 9 и более суток (до 15) для белых мышей и 6 - 15 (до
20) для морских свинок. Культуру туляремийных бактерий от биопробных
животных выделяют посевом на специальные питательные среды (см. выше).
5.4. Иммунофлуоресцентный метод
При исследовании патологического материала от больных может быть
эффективен прямой иммунофлуоресцентный метод, позволяющий выявлять как
живые, так и нежизнеспособные бактерии по свечению в них
специфического антигена. Имеются данные, когда методом РИФ у больного
туляремией через 2 месяца от начала заболевания в мазках - отпечатках
из бубона были обнаружены туляремийные бактерии, тогда как выделение
возбудителя бактериологическими (биологическими) методами оказалось
безуспешным. В качестве объектов, подвергающихся исследованию в РИФ,
могут быть мазки, приготовленные из патологического материала
больного: содержимого кожного аффекта, пунктата бубона, отделяемого
слизистой глаза, смывы с зева, миндалин и др.
Метод выполняется согласно инструкции по применению на препарат
"Иммуноглобулины диагностические флюоресцирующие туляремийные сухие".
Учет и оценка РИФ. Мазки просматривают в падающем свете
люминесцентного микроскопа с лампой ДРШ-250 и системой светофильтров.
Используют иммерсионный объектив 90х (1,26) и окуляры 5х или 7х. При
микроскопировании используют нефлуоресцирующее иммерсионное масло.
В положительных случаях, т.е. когда исследуемый материал содержит
туляремийные бактерии, в люминесцентном микроскопе обнаруживается
специфическое изумрудно-зеленое свечение туляремийных бактерий.
Удается обнаружить более яркое свечение периферии бактериальной клетки
и более слабое - в ее центральной части. Посторонние микроорганизмы,
клетки ткани и прочие органические частицы приобретают
оранжево-красную (различных оттенков) флуоресценцию. Для оценки
интенсивности специфического свечения используют четырехкрестовую
систему регистрации результатов. Положительным результатом считается
флуоресценция, оцениваемая на ++++ или +++ при достаточном количестве
(2 - 5 клеток в нескольких полях зрения микроскопа) специфически
флуоресцирующих бактерий. При оценке исследуемого препарата необходимо
учитывать не только интенсивность специфического свечения, но и
обращать особое внимание на характерную морфологию бактерий и
учитывать расположение клеток относительно друг друга.
При исследовании различных препаратов необходимо иметь
контрольный мазок, приготовленный из взвеси туляремийных бактерий и
обработанный подобно опытным образцам.
5.5. Молекулярно-генетический метод
В качестве дополнительного теста диагностики туляремии у человека
может быть рекомендовано обнаружение специфической ДНК в
патологическом материале методом ПЦР. Постановку и учет результатов
реакции осуществляют согласно инструкции по применению препарата.
5.6. Идентификация выделенной культуры
Идентификацию свежевыделенной туляремийной культуры осуществляют
на основании совокупности следующих признаков:
- морфологии клеток и грамотрицательной их окраски в мазках;
- характера роста на желточной среде или специальных средах;
- отсутствие роста на простых мясопептонных средах;
- агглютинация туляремийной сывороткой;
- специфическим свечением в реакции иммунофлуоресценции;
- способностью вызывать гибель белых мышей и морских свинок при
их заражении испытуемой культурой с характерными для туляремии
патолого-анатомическими изменениями в органах и выделением чистой
культуры возбудителя.
5.7. Значение лабораторных исследований при диагностике туляремии
Диагноз туляремии устанавливают на основании сопоставления
результатов аллергического и серологического исследований. Для
серологической диагностики применяют обычно РА или РНГА. Другие
серологические методы, например ИФА, применяют в сомнительных случаях
и для подтверждения достоверности результатов, достигнутых другими
методами (РА и РНГА). Выделение возбудителя от больного, как указано
выше, не всегда эффективно и доступно только специально оснащенным
лабораториям, имеющим разрешение на работу с возбудителем туляремии
(II группа патогенности микроорганизмов) в установленном порядке.
Кожная туляриновая проба может служить методом ранней диагностики
туляремии, т.к. становится положительной уже с 3 - 5 суток болезни.
Однако в случаях, когда имеются противопоказания к применению
накожного тулярина (повышенная сенсибилизация), прибегают к методу
аллергодиагностики in vitro - реакции лейкоцитолиза. Следует иметь в
виду, что методы аллергодиагностики не позволяют дифференцировать
свежие случаи заболевания от анамнестических реакций, т.к.
специфическая клеточная реактивность у переболевших и привитых
сохраняется многие годы.
В этой связи нецелесообразно основывать диагностику туляремии
только на результатах аллергических методов, а использовать и
различные серологические методы диагностики. Выявление антител к
туляремийному микробу при первом обследовании больного в титрах 1:50 -
1:100 при отсутствии нарастания титра сыворотки при последующем
исследовании также не дает основания для диагноза свежего случая
туляремии. Поэтому кровь больного исследуют, по крайней мере, дважды:
первый раз немедленно после обращения больного за медицинской помощью
и второй раз - спустя неделю после первого исследования. Если при
повторном обследовании антитела не обнаружены или титр сыворотки
остался без изменений, то кровь больного нужно исследовать третий раз,
спустя неделю после второго обследования. Нарастание титра антител в
РА и РНГА подтверждает диагноз туляремии, а его отсутствие указывает
на анамнестический характер реакции.
Следует также учитывать, что раннее начало лечения больного
антибиотиками (на 1-й неделе болезни) приводит к снижению титра
антител. У лиц, вакцинированных против туляремии или ранее перенесших
это заболевание, основанием для диагностики свежего случая туляремии
может служить лишь выраженное (в 2 - 4 и более раза) нарастание титров
антител в сыворотке, а также наличие характерных клинических
проявлений заболевания.
Окончательный диагноз туляремии обеспечивают сопоставлением
результатов сероаллергического обследования больного с
клинико-эпидемиологическими данными.
6. Профилактика туляремии
Основу профилактики туляремии составляют вакцинация контингентов
риска населения высокоэффективной живой противотуляремийной вакциной,
а также профилактические мероприятия, квалифицируемые как средства и
методы неспецифической профилактики.
6.1. Специфическая профилактика
Необходимость проведения профилактической вакцинации и ее объемы
определяют территориальные управления (территориальные отделы
территориальных управлений) на основании многолетнего анализа
эпизоотической и эпидемиологической обстановки на территории,
энзоотичной по туляремии.
Основой профилактических мероприятий против туляремии, в первую
очередь вакцинации населения, являются данные эпизоотологического и
эпидемиологического обследования, а также составленные по их
результатам научно обоснованные прогнозы.
6.1.1. Планирование и организация вакцинопрофилактики туляремии.
Вакцинацию против туляремии проводят населению, проживающему на
энзоотичных по туляремии территориях, а также контингентам,
подвергающимся риску заражения этой инфекцией. Планирование и подбор
контингентов, подлежащих вакцинации против туляремии, осуществляют
территориальные управления (территориальные отделы территориальных
управлений) с учетом степени эпизоотической активности природных
очагов, а также экономических и хозяйственных связей с сопредельными
территориями.
Вакцинацию (и ревакцинацию) против туляремии проводят с
применением живой туляремийной вакцины в соответствии с инструкцией по
ее применению в любое время года, учитывая календарь профилактических
прививок. Допускается одновременная накожная вакцинация взрослых
против туляремии и бруцеллеза, туляремии и чумы на разных участках
наружной поверхности средней трети плеча. Интервал между вакцинацией
против туляремии и другими прививками должен быть не менее одного
месяца, а в отношении детских контингентов - не менее двух месяцев.
Вакцинацию осуществляют медицинские работники лечебно-профилактических
учреждений.
Различают плановую и внеплановую (по эпидемиологическим
показаниям) вакцинацию против туляремии.
6.1.2. Плановыми прививками охватывают население, проживающее
(или работающее) на территории с наличием активных природных очагов
луго-полевого, степного, пойменно-болотного (и его вариантов),
предгорно-ручьевого типов при 100%-ном охвате прививками лиц, за
исключением детей до 7 лет и лиц, имеющих противопоказания к
прививкам.
В очагах луго-полевого типа не прививают детей в возрасте до 14
лет, а также лиц, не занимающихся сельскохозяйственными работами и не
имеющих скота в личном пользовании, на котором могут находиться
инфицированные возбудителем туляремии клещи.
В природных очагах тундрового, лесного типов, а также в
пойменно-болотных очагах при отсутствии водяной полевки (где основным
источником инфекции является ондатра) вакцинацию проводят только лицам
с профессиональным риском инфицирования: охотники, рыболовы (и члены
их семей), пастухи, полеводы, мелиораторы, оленеводы, а также лицам,
направляемым на временную работу: геологи, строители и т.п.
На территориях с малоактивными природными очагами туляремии, а
также в городах, прилегающих к природным очагам, вакцинируют только
группы риска, а именно:
- работников зерно- и овощехранилищ, сахарных заводов,
элеваторов, мельниц, мясокомбинатов, комбикормовых заводов,
спиртозаводов, предприятий по переработке сельскохозяйственных
продуктов и сырья животноводческих и птицеводческих ферм, работающих с
зерном, фуражом, сахарной свеклой и другим, а также скотом,
поступающим на переработку из энзоотичных по туляремии степных и
луго-полевых очагов;
- лиц, принимающих и обрабатывающих шкурки промысловых зверьков,
поступающих из энзоотичных по туляремии территорий.
Вакцинации подлежит персонал отделов особо опасных инфекций
территориальных управлений и территориальных отделов территориальных
управлений, центров гигиены и эпидемиологии и филиалов центров гигиены
и эпидемиологии, противочумных и научно-исследовательских учреждений,
лабораторий и эпидемиологических отрядов, работающих с возбудителем
туляремии или осуществляющих сбор и исследование мелких млекопитающих,
членистоногих, объектов внешней среды из энзоотичных по туляремии
территорий, а также подразделений учреждений, проводящих
дератизационные и дезинсекционные мероприятия.
Ревакцинацию проводят через 5 лет контингентам, подлежащим
плановой вакцинации.
Принимая во внимание стойкость природных очагов туляремии и их
длительное существование, отмена плановых прививок допускается только
на основании представленных территориальными управлениями
(территориальными отделами территориальных управлений) материалов,
свидетельствующих об отсутствии циркуляции возбудителя в биоценозе.
6.1.3. Внеплановую по эпидемиологическим показаниям вакцинацию
против туляремии проводят:
- в населенных пунктах, расположенных на территориях, ранее
считавшихся благополучными по туляремии, при выделении возбудителя
туляремии из каких-либо объектов или заболевании людей (даже единичные
случаи);
- в населенных пунктах, расположенных на территориях активных
природных очагов туляремии, при выявлении низкой иммунной прослойки
(менее 70% в луго-полевых очагах и менее 90% в пойменно-болотных
очагах);
- в городах, непосредственно прилегающих к активным природным
очагам туляремии, контингентам, подвергающимся риску заражения -
членам садоводческих кооперативов, владельцам (и членам их семей)
личного водного и автотранспорта, работникам водного транспорта и
т.п.;
- лицам, выезжающим для постоянных или временных работ на
территории активных природных очагов туляремии: охотникам, лесникам,
мелиораторам, геодезистам, заготовщикам шкурок промысловых зверьков
(водяных полевок, зайцев, ондатр), геологам, членам научных
экспедиций, лицам, направляемым на сельскохозяйственные, строительные,
изыскательские или иные работы, туристам и др.
Вакцинацию вышеуказанных лиц и групп организуют и проводят
организации здравоохранения в местах их формирования.
6.1.4. Контроль за состоянием противотуляремийного иммунитета.
Контроль за своевременностью и качеством вакцинации против
туляремии, а также за состоянием иммунитета осуществляют
территориальные управления (территориальные отделы территориальных
управлений) и центры гигиены и эпидемиологии (филиалы центров гигиены
и эпидемиологии). Состояние иммунитета у вакцинированных проверяют
через 5 лет после вакцинации и в последующем - 1 раз в 2 года.
Ревакцинацию проводят в случае отрицательных результатов
иммунологических показателей (аллергические или серологические
реакции).
Иммунную структуру населения определяют путем выборочной проверки
взрослого работоспособного населения также с помощью аллергического
(туляриновая проба) или одного из серологических методов исследования
(реакция агглютинации, реакция пассивной гемагглютинации,
иммуноферментный анализ). При этом предпочтительнее использовать
серологические методы исследования. Общее число проверяемых людей в
конкретном административном районе должно составлять не менее 1% к
общему числу проживающих (или не менее 10% в отдельном населенном
пункте). Ревакцинацию проводят при выявлении уровня иммунной прослойки
ниже 70% в луго-полевых очагах и ниже 90% - в пойменно-болотных
очагах. Отбор контингентов для проверки иммунной структуры населения,
оценки результатов иммунологических реакций осуществляют при
обязательном участии специалистов территориальных управлений
(территориальных отделов территориальных управлений) и (или) центров
гигиены и эпидемиологии (филиалов центров гигиены и эпидемиологии):
отделов особо опасных инфекций, врачей - эпидемиологов и др.
У персонала отделов особо опасных инфекций территориальных
управлений (территориальных отделов территориальных управлений) и
центров гигиены и эпидемиологии (филиалов центров гигиены и
эпидемиологии), противочумных, научно-исследовательских учреждений,
эпидемиологических отрядов, проводящих работу с возбудителем туляремии
и привитых с положительным результатом, состояние иммунитета проверяют
1 раз в 2 года. К работе допускаются лица с наличием
противотуляремийного иммунитета, определяемого с помощью аллергических
(туляриновая проба или реакция лейкоцитолиза) или одного из
серологических методов (реакция агглютинации, реакция пассивной
гемагглютинации, иммуноферментный анализ). Ревакцинацию проводят
только в случае получения отрицательных иммунологических показателей
при очередной проверке иммунитета.
6.2. Неспецифическая профилактика туляремии
Неспецифической профилактике туляремии предшествует организация
поиска эпизоотий в природных очагах этой инфекции. На основании
результатов эпизоотологического обследования планируют и реализуют
комплекс профилактических мероприятий.
Неспецифическую профилактику туляремии проводят по двум основным
направлениям:
- устранение условий заражения людей
(санитарно-противоэпидемические (профилактические) мероприятия,
гигиеническое воспитание и обучение населения, в т.ч. разъяснение
значения профилактических прививок против туляремии для населения,
выезжающего в природные очаги туляремии);
- снижение лоймопотенциала природных очагов (мероприятия по
дератизации и дезинсекции).
Неспецифические мероприятия имеют свои особенности при различных
типах заболеваемости.
При трансмиссивных заражениях через кровососущих двукрылых
рекомендуется применение репеллентов, защитной одежды, ограничение
доступа непривитого населения на неблагополучные территории, а в
редких случаях - дезинсекция водоемов.
При промысловых заражениях проводят комплекс регулирующих
численность носителей и (или) ограничительных
санитарно-противоэпидемических мероприятий в местах промысла зверьков,
а также мероприятия по дезинсекции и дезинфекции на складах хранения
шкурок. На охоте рекомендуется дезинфицировать руки после снятия
шкурок и потрошения зайцев, ондатр, кротов и водяных полевок.
Необходима тщательная термическая обработка заячьего мяса перед
употреблением его в пищу. Употребление в пищу малосольной зайчатины
может вызвать заболевание туляремией.
При вспышках, связанных с контактом населения с зараженным
водоемом, необходимо прекратить купание и водопользование,
использовать для питья только кипяченую воду, а при заражении
колодезной воды - принять меры по очистке колодца от трупов грызунов и
дезинфицировать воду.
При заражении во время зимних сельскохозяйственных работ в
природных очагах туляремии недопустимо привлечение к ним непривитого
населения. Подвергающихся риску заражения лиц обеспечивают защитной
одеждой, респираторами, перчатками. Инфицированное зерно, корм и
другие субстраты либо уничтожают, либо обеззараживают.
При бытовых заражениях обеспечивают, по возможности,
грызунонепроницаемость жилых и подсобных помещений, дератизацию и
влажную уборку с применением дезинфицирующих средств, разрешенных к
применению в Российской Федерации в установленном порядке.
При производственных и продуктовых заражениях осуществляют
санитарно-противоэпидемические мероприятия на предприятиях или на
складах, включающие обеззараживание инфицированного сырья и продуктов.
На мясокомбинатах производят дезинсекцию скота, поступившего для
переработки.
При посещении леса, сборе ягод и т.п. следует проводить
взаимоосмотры, удаляя и уничтожая (но не раздавливанием) всех
наползших или прикрепившихся иксодовых клещей. Место их прикрепления
обрабатывают, например, настойкой йода или бриллиантовой зелени и др.
Это же делают при обнаружении ссадин на коже и других повреждениях.
При подозрении на попадание инфекции в глаза следует промыть их
кипяченой водой, а затем закапать в глаза, например, раствор
протаргола или др.
Лоймопотенциал природных очагов туляремии может быть уменьшен за
счет проведения комплексных мероприятий, направленных на сокращение
численности основных носителей и переносчиков инфекции, а также в
результате антропогенной трансформации ландшафта.
Снижение численности клещей достигается: изменением сроков
(позднее начало) весеннего выпаса скота, когда заканчивается период
активизации клещей, сокращением площади естественных лугов, выпасом
скота на искусственных и культурных пастбищах, плановой или экстренной
обработкой заклещевленного скота. В случае массового заклещевления
обработку скота проводят регулярно с интервалами 7 - 10 дней для
наиболее полного уничтожения взрослых клещей и через 12 - 15 дней
против личинок и нимф. Уничтожение клещей на скоте проводят
дезинсекционными средствами (акарицидами), разрешенными к применению
для этих целей в установленном порядке, или механическим путем.
Дератизационные мероприятия включают как собственно уничтожение
грызунов разными методами, так и агротехнические приемы,
препятствующие повышению численности млекопитающих. Хорошие результаты
дает прессование сена в тюки, качественная обработка стогов сена и
ометов соломы аммиачной водой, складирование кормов после уборки
урожая в хорошо оборудованные, грызунонепроницаемые хранилища. Не
рекомендуется устанавливать стога сена и ометы соломы по краям оврагов
или опушкам леса. Из этих стаций зверьки активно заселяют стога и
ометы. В некоторых хозяйствах практикуют зимнюю буксировку сена
волоком при помощи тракторов непосредственно к фермам. При этом
доставляют и всех обитающих в стогах и ометах грызунов, и повышается
риск заражения работников фермы. Полевую дератизацию следует проводить
в зимний и ранневесенний (сразу после схода снежного покрова) периоды.
Миграция мышевидных грызунов из естественных мест обитания в
населенные пункты начинается с уборкой урожая и вывозом
сельскохозяйственных продуктов с полей, а с наступлением осенних
холодов этот процесс становится массовым, особенно в годы высокой
численности грызунов. Таким образом, к грызунам, обитающим в
населенных пунктах, присоединяются грызуны из естественных мест
обитания. Во время осенних миграций в населенный пункт дикими
грызунами может быть занесен возбудитель туляремии и, вследствие
этого, развиться эпизоотия этой инфекции среди синантропных грызунов.
Поэтому планомерное уничтожение грызунов позволяет предупредить
развитие эпизоотии.
Борьба с грызунами в населенных пунктах включает в себя
обеспечение грызунонепроницаемости зерно- и овощехранилищ, фуражных
складов, других хозяйственных и жилых построек, водоисточников.
Истребление грызунов осуществляют при помощи разнообразных орудий
лова, отравленных приманок, в т.ч. с созданием точек долговременного
отравления грызунов, химических средств, бактериальных препаратов.
Важным условием качественного проведения дератизации является
координация усилий всех заинтересованных организаций.
Дезинфекцию, дезинсекцию и дератизацию планируют и проводят на
основании результатов эпизоотологического обследования и обязательно
оценивают эффективность проводимых мероприятий.
6.3. Специальная подготовка медицинских и других работников на
территории, энзоотичной по туляремии
На территории, энзоотичной по туляремии, все медицинские
работники, а также лица, ответственные за организацию работы и
массовые мероприятия на неблагополучных участках территории, должны
быть осведомлены по вопросам клиники, дифференциальной диагностики
туляремии, а также о характерных признаках болезни и обучены правилам
по проведению профилактических и противоэпидемических мероприятий,
снижающих риск заражения человека.
Мероприятия по подготовке организовывают и осуществляют
специалисты по особо опасным инфекциям территориальных управлений
(территориальных отделов территориальных управлений) или центров
гигиены и эпидемиологии (филиалов центров гигиены и эпидемиологии) и
противочумных станций.
6.4. Гигиеническое обучение и воспитание населения
6.4.1. При использовании средств массовой информации (местная
печать, радио, телевидение, лекции, беседы и др.) специалисты
территориальных управлений (территориальных отделов территориальных
управлений) и центров гигиены и эпидемиологии (филиалов центров
гигиены и эпидемиологии) информируют население об особенностях
заболевания и мерах по его предупреждению: указывают на возможные
источники инфекции, пути заражения, разнообразие клинических
проявлений и необходимость раннего обращения к врачу при появлении
первых признаков заболевания, разъясняют значение профилактических
прививок против туляремии для населения, выезжающего в природные очаги
туляремии, а также знакомят с мерами личной защиты.
6.4.2. Гигиеническое воспитание и обучение проводят с работниками
ферм, сахарных заводов, мясо- и льнокомбинатов, рыболовных и
охотничьих хозяйств - контингента, наиболее подверженного риску
заражения возбудителем туляремии.
7. Библиографические данные
1. "Основы законодательства Российской Федерации об охране
здоровья граждан" от 22 июля 1993 г.
2. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии
населения" от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ.
3. Федеральный закон "Об охране окружающей среды" от 14 июля 1993
г. N 133.
4. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II
групп патогенности (опасности)".
5. СП 1.2.1318-03 "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического
заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных
заболеваний человека I - IV групп патогенности (опасности),
генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами
биологического происхождения и гельминтами".
6. Сборник санитарных и ветеринарных правил "Профилактика и
борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных". М.,
1996 г.
7. МУ 3.1.1029-01 "Методические указания по отлову, учету и
прогнозу численности мелких млекопитающих и птиц в природных очагах
зоонозов".
8. МУ 3.1.1027-01 "Методические указания по сбору, учету и
подготовке к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих -
переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций".
9. МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом
ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп
патогенности".
10. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации "Об
усилении мероприятий по профилактике туляремии" от 14 апреля 1999 г. N
125.
11. Приказ Минздрава России "О повышении готовности органов и
учреждений госсанэпидслужбы России к работе в чрезвычайных ситуациях"
от 29 июля 1998 г. N 230.
12. Приказ Минздрава России "О взаимодействии по вопросам
обеспечения санитарной охраны территории Российской Федерации и
проведения мероприятий по профилактике карантинных и других особо
опасных инфекций" от 5 февраля 2004 г. N 37.
Приложение 1
(справочное)
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ ТУЛЯРЕМИИ
НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Ареал возбудителя туляремии охватывает страны северного
полушария, а в Российской Федерации эта инфекция обнаружена
практически во всех регионах (краях, областях, автономных
республиках). Природные очаги туляремии распространены в различных
природно-климатических зонах и приурочены к разнообразным ландшафтам.
В настоящее время на территории Российской Федерации выделяют 6
основных ландшафтных типов природных очагов туляремии: луго-полевой,
степной, пойменно-болотный, предгорно-(горно)-ручьевой, лесной,
тундровый.
Отдельно выделяют синантропные (или урбанические) очаги.
- Луго-полевой тип очага. Инфекция поддерживается в популяциях
всех видов полевок, зайца-русака и других млекопитающих 1-й группы.
Резервуарами и переносчиками инфекции часто служат иксодовые клещи
Dermacentor reticulatus и D. pictus. Очаги расположены в лесной и
лесостепной зонах. Первичными биоценозами служат кустарниковые и
кочкарниковые луга, опушки леса, поляны; вторичными - поля, агроценозы
с находящимися в них скирдами и ометами, а также расположенные по
соседству населенные пункты.
- Степной (овражно-балочный) тип очага. Циркуляция возбудителя
происходит в популяциях видов - двойников обыкновенной полевки,
степной пеструшки и домовой мыши. Активно вовлекаются в этот процесс
заяц-русак, хомяк, общественная полевка и другие виды млекопитающих.
Резервуарами и источниками инфекции служат также многочисленные виды
пастбищных иксодовых клещей Dermacentor reticulatus и D. pictus. Этот
тип очага распространен в степной зоне Европейской части Российской
Федерации, степях Западной Сибири и Забайкалья.
- Пойменно-болотный тип очага. Имеет многочисленные варианты:
озерно-займищный, лиманно-плавневый и т.п. Очаг поддерживается водяной
полевкой, ондатрой и другими околоводными млекопитающими 1-й группы.
Хранителями инфекции выступают норовые клещи Ixodes apronophorus и
некоторые другие виды. Большую роль в циркуляции возбудителя играет
вода, особенно в Северном, Северо-Западном районах Восточной Сибири и
других регионах России. Возникновению разлитых эпизоотий способствует
концентрация зверьков во время паводков. Существенную роль в передаче
инфекции от зверька к зверьку, а также человеку, играют слепни и
комары. Характерным является интразональное распространение очагов.
- Предгорно-(горно)-ручьевой тип очага. Очаг поддерживается на
водяных полевках и других мелких зверьках. Вода инфицируется
выделениями и трупами мелких млекопитающих (ММ), а ее низкая
температура способствует длительному сохранению возбудителя. Очаги
локализуются по берегам ручьев и речек в предгорьях Саян, Кузнецкого
Алатау, Кавказа, Алтая и других горных систем.
Эти 4 типа природных очагов туляремии эпидемиологически наиболее
опасны.
- Лесной тип очага. Инфекция поддерживается в основном среди
рыжих полевок, лесных и желтогорлых мышей, а местами - зайцами.
Хранителями инфекции служат клещи I. ricinus, I. persulcatus и I.
trianguliceps. Распространен в зоне широколиственных и смешанных
лесов, реже - в таежной зоне.
- Тундровый тип очага. Поддерживается за счет разных видов
леммингов и других мелких грызунов 1-ой группы. Инфекция сохраняется
годами в подстилках гнезд леммингов (на вечной мерзлоте) и во льду.
Распространен в тундровой зоне.
- Синантропный (урбанический) тип очага. Очаги находятся на
территории городов, поселков или их окраинах. Основными носителями
возбудителя туляремии являются синантропные грызуны - домовая мышь и
серая крыса. Эпизоотии могут возникать в результате "заноса"
возбудителя мигрирующими грызунами из природных биотопов в строения,
обычно осенью и в начале зимы, а к весне - затухать. В циркуляцию
возбудителя туляремии включаются восточно-европейские обыкновенные
полевки, часто заселяющие стога и ометы, расположенные вблизи построек
и жилищ человека.
Туляремийные очаги устойчивы, непрерывное существование некоторых
из них прослежено более 60 лет, но они могут трансформироваться в
результате хозяйственной деятельности человека и изменять свой
лоймопотенциал.
Природные очаги туляремии полигостальны и поливекторны.
Циркуляция возбудителя осуществляется в них среди фоновых видов ММ и
иксодовых клещей, однако и другие сочлены паразитарной системы
вовлекаются в этот процесс.
Всех млекопитающих по отношению к туляремийной инфекции и их роли
в эпизоотическом процессе разделяют на 3 группы.
Первая группа. Высоковосприимчивые и высокочувствительные
млекопитающие (заражаются при попадании в организм единичных
туляремийных бактерий, остро болеют и быстро погибают с интенсивным
обсеменением органов и тканей возбудителем). К этой группе относятся
все виды мелких мышевидных грызунов, кроме полевой мыши, зайцеобразные
и насекомоядные, за исключением ежей, куторы, выхухоли.
Вторая группа. Высоковосприимчивые, но малочувствительные
млекопитающие (заражаются при попадании в организм единичных бактерий,
болеют тяжело, но быстро освобождаются от возбудителя, приобретая
устойчивый иммунитет). К этой группе относятся полевая мышь, все виды
крыс и сусликов, белки, бурундуки, бобры, ежи, выхухоль, куторы,
белозубки и некоторые другие виды млекопитающих.
Третья группа. Маловосприимчивые и практически нечувствительные
млекопитающие. К ним относятся большинство хищных млекопитающих и
сельскохозяйственных животных.
Наибольшее эпизоотологическое и эпидемиологическое значение имеют
животные 1-й группы, поэтому тактика эпизоотологического обследования
строится с учетом того, к какой группе относятся обитающие в очаге
животные.Страницы: 1 2 |