Страницы: 1 2
ШТАММА ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА 15 НИИЭГ
------------------------------------------------------------------
| Признак | Наличие|
| |признака|
|-------------------------------------------------------|--------|
|Морфология - мелкие кокки |+ |
|-------------------------------------------------------|--------|
|Подвижность |- |
|-------------------------------------------------------|--------|
|Окраска по Граму - грамнегативные |+ |
|-------------------------------------------------------|--------|
|Рост на питательной среде с 5 - 10% крови белых в |Не менее|
|SR-форме колоний (% к числу выросших) |80 |
|-------------------------------------------------------|--------|
|Агглютинабельность сывороткой диагностической |До титра|
|туляремийной | |
|-------------------------------------------------------|--------|
|Ферментация глюкозы с образованием кислоты без газа |+ |
|-------------------------------------------------------|--------|
|Ферментация мальтозы с образованием кислоты без газа |+ |
|-------------------------------------------------------|--------|
|Ферментация маннозы с образованием кислоты без газа |+ |
|-------------------------------------------------------|--------|
|Ферментация левулезы с образованием кислоты без газа |+ |
|-------------------------------------------------------|--------|
|Ферментация глицерина |- |
|-------------------------------------------------------|--------|
|Образование сероводорода |+ |
|-------------------------------------------------------|--------|
|Выделение индола |- |
|-------------------------------------------------------|--------|
|Чувствительность к эритромицину |- |
------------------------------------------------------------------
Приложение 2
(обязательное)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНОЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ ИСПЫТУЕМОГО
ВАКЦИННОГО ШТАММА НА БЕЛЫХ МЫШАХ
Определение остаточной вирулентности проводят параллельно для
испытуемого и контрольного вакцинных штаммов. Для этого 140 белых
мышей массой 18 - 20 г делят на 2 группы методом случайной выборки по
70 животных, 1 группа - для испытуемого штамма, 2 - для контрольного.
Используют двухсуточную агаровую культуру каждого штамма 2
пассажа, выращенную на питательной среде Мак-Коя или на FT - агаре.
9
Готовят взвесь культуры концентрацией 1 х 10 м. к. / мл. Затем
последовательно десятикратно разводят в 0,9 % растворе натрия
-1 -8 8
хлорида с 10 до 10 , что соответствует от 1 х 10 до 10
м.к./мл, и вводят животным подкожно в заднюю правую лапку по 0,5
6 5
мл приготовленных взвесей, что соответствует 5 х 10 , 5 х 10 , 5 х
4 3 2
10 , 5 х 10 , 5 х 10 , 50 и 5 м.к. Каждую дозу каждого штамма
вводят 10 животным. Для подсчета LD и расчета вводимых доз
50
-6
производят высев культуры из разведения 10 по 0,1 мл на 5 чашек,
содержащих FT-агар. Гибель мышей учитывают в сроки до 21 сут. после
введения культуры. Животных, павших на 5 - 10 сут., вскрывают,
обращают внимание на патоморфологические изменения, производят посев
селезенки методом отпечатка на питательную среду Мак-Коя или FT-агар
(посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) град.С в течение 10
сут., ежедневно просматривая). Если в посевах обнаруживается рост
культуры, ее идентифицируют в РИФ (реакции прямой иммунофлуоресценции)
с иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими туляремийными
(ФСП 42-0180-5315-04). Гибель мышей от испытуемого штамма
устанавливают на основании патологоанатомических данных вскрытия
(плотный инфильтрат на месте введения, гиперемия сосудов подкожной
клетчатки и паховых лимфатических узлов, увеличение и уплотнение
селезенки) и выделения из посевов туляремийного микроба.
Вакцинный штамм туляремийного микроба должен обладать
остаточной вирулентностью для белых мышей, LD его должна быть в
50
2 6
пределах от 10 до 2 х 10 м.к.
Величину LD вычисляют по формуле:
50
lg LD = lg D - l (SUM L - 0,5),
50 i
где:
D - максимальная из испытанных доз;
L - отношение числа животных, погибших при введении данной дозы,
i
к общему числу животных, которым эта доза была введена;
SUM L - сумма значений L , вычисленных для всех испытанных доз.
i i
Если величина LD для контрольного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ
50
окажется выше или ниже лимита, контроль повторяют по той же методике;
если величина LD для испытуемого штамма не удовлетворяет требованиям
50
лимита, а контрольного штамма - удовлетворяет, испытуемый штамм не
соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам по
степени остаточной вирулентности.
Приложение 3
(обязательное)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНОЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ И БЕЗВРЕДНОСТИ
ИСПЫТУЕМОГО ВАКЦИННОГО ШТАММА НА МОРСКИХ СВИНКАХ
Оценку безвредности вакцинного штамма туляремийного микроба
проводят на здоровом поголовье морских свинок массой 400 - 500 г.
3.1. Перед началом опыта состояние здоровья животных оценивают
совместно ветеринарный врач и член комиссии по изучению нового
вакцинного штамма туляремийного микроба.
Поступивших животных выдерживают под наблюдением в течение 10
сут. обсервации. Оценку здоровья поголовья морских свинок начинают
проводить с клинического осмотра, взвешивания, измерения ректальной
температуры (не должна превышать 38 град.С). Повторное обследование
животных (взвешивание, термометрирование, клинический осмотр) проводят
накануне эксперимента (за сутки). Перед подкожным введением культур
изучаемого и контрольного штаммов туляремийного микроба животных с
учетом показателей массы тела распределяют на равнозначные группы для
каждого штамма и каждой группы. На каждый штамм берут по 150 морских
свинок - 4 равнозначные группы по 30 животных в каждой и 30 - для
контроля. В оценку состояния здоровья морских свинок входят данные
патологоанатомического и гистологического исследований. Для этого из
каждой группы по 10 животных вскрывают и исследуют в 3 этапа: в начале
обсервации, в день начала опыта и через 30 сут. после постановки
опыта.
3.2. Распространенность, приживаемость, безвредность и
реактогенность культуры испытуемого вакцинного штамма F. tularensis, а
также вызываемые им морфологические изменения в органах и тканях
животных (морские свинки).
Данные характеристики исследуемого штамма определяют в одном
опыте на одной и той же группе животных в сравнении с контрольным
штаммом.
В опыте используют двухсуточные агаровые культуры 2 пассажа с
питательной среды Мак-Коя или FT-агара испытуемого и контрольного
3 5 7 9
штаммов. Каждую дозу 5 х 10 , 5 х 10 , 5 х 10 и 5 х 10 м. к.
(дозы определяют по отраслевому стандартному образцу мутности ОСО
42-28-85П соответствующего года выпуска) вводят подкожно в правую
паховую область 30 морским свинкам в объеме 1 мл. Для подсчета LD и
50
-7
расчета вводимых доз производят высев культуры из разведения 10 по
0,1 мл на 5 чашек, содержащих FT-агар.
3.3. Для определения распространенности, приживаемости микробов в
органах и тканях, характера патоморфологических изменений, возникающих
после введения культур, животных по 3 на каждую дозу поочередно
умерщвляют хлороформом на 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28 сутки, оставшихся в
живых животных умерщвляют на 45-е сут. после введения испытуемых
культур. Сразу после умерщвления животных проводят их вскрытие и
описание видимых патологоанатомических изменений и бактериологическое
исследование внутренних органов, а также забирают органы для
патогистологического исследования.
3.4. Вскрытие животных производят общепринятым методом. Для
каждого животного берут отдельную банку емкостью 300 - 500 мл с
притертой или резиновой пробкой, на 2/3 заполненную 10%-м раствором
нейтрального формалина. В банку помещают бумажную этикетку, на которой
графитовым карандашом четко и крупно написаны с обеих сторон: номер
животного, шифр испытуемой культуры, дата взятия материала и день
наблюдения. На бумажных этикетках пишут названия органов, которые
после вскрытия помещают на них. Затем в банку для каждого животного
помещают лимфатические узлы, кусочки органов и тканей вскрытого
животного. Результаты патологоанатомического исследования записывают в
протокол вскрытия (см. в конце Приложения).
При вскрытии морских свинок отмечают состояние кожи, подкожной
клетчатки, подлежащих мышц в месте введения микробной культуры,
характер и распространенность отмечаемых в них изменений. Особое
внимание обращают на степень инъекции сосудов подкожной клетчатки,
величину отека, на развитие геморрагических, гнойных и некротических
изменений. Указывают размеры (в мм) регионарных к месту введения
культуры паховых лимфатических узлов, их цвет, плотность, спаянность с
окружающими тканями и состояние отдаленных (контрлатеральных)
подмышечных узлов. После высева методом отпечатков на плотную
питательную среду кусочки ткани с места введения погружают в раствор
формалина, а лимфатические узлы помещают на отдельную этикетку (см.
выше) и опускают в фиксатор. Затем вскрывают брюшную и грудную
полости. Отмечают полнокровие внутренних органов, состояние
плевральных полостей, сальника, висцеральной брюшины, кишечника. Из
всех внутренних органов (печень, селезенка, легкие, сердце) методом
отпечатков производят посевы на поверхность питательного агара. При
описании внутренних органов обращают внимание на наличие в легких
мелких серовато-розовых очажков или тяжей, расположенных по ходу
сосудов и бронхов, в печени и селезенке - узелков и очагов некроза,
отмечая их количество, размеры и внешний вид. Увеличение селезенки
лучше регистрировать указанием ее размеров (длины, ширины, толщины).
Кусочки органов берут обязательно на границе с измененными участками
(если они обнаружены) и помещают в банку с фиксатором. После
исследования легких, сердца, селезенки, печени и взятия из них
кусочков размером 1 х 1 х 1 см тонкий кишечник отодвигают в правую
сторону (по отношению к свинке), пинцетом берут почку, надрезая ее,
кроме этого для исследования берут надпочечник и подвздошные
лимфатические узлы. Отмечают размеры, консистенцию, цвет, а также
состояние окружающей клетчатки. Наконец, выделяют мезентериальные
лимфатические узлы, расположенные ближе к корню брыжейки, и
характеризуют их по схеме, приведенной выше. В последнюю очередь берут
костный мозг вместе с кусочком диафиза бедренной кости. При этом кость
надо расщепить, т.к. она может препятствовать проникновению фиксатора.
Собранный материал помещают в формалин на 14 сут. при температуре 18 -
25 град.С. После чего проводят его контроль на специфическую
стерильность, затем подвергают дальнейшему гистологическому
исследованию.
3.5. Во время вскрытия проводят высевы из органов, тканей и
лимфатических узлов на агаровые пластины в чашках Петри с питательными
средами FT-агаром, с агаром с 1%-й кровью и агаром Эндо. На агар для
выделения туляремийного микроба делают высев из места введения
культуры, правого подвздошного лимфатического узла, костного мозга
(первая чашка), из лимфатических узлов - правого пахового
(регионарного) и левого пахового, правого и левого подмышечного
(вторая чашка), из печени и селезенки (третья чашка), из легких и
сердца (четвертая чашка). На агар с 1 - 2%-й кровью делают высев из
легких и крови, на агар Эндо - из печени и селезенки. Высевы из
органов проводят методом множественных отпечатков, костный мозг берут
и сеют бактериологической петлей из бедренной кости, посев крови
производят мазком - отпечатком отсеченной верхушкой сердца. Все посевы
помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) град.С на 5 - 7 сут.
Погибших в ходе опыта животных исследуют так же, как и умерщвленных.
Кроме того, при вскрытии погибших морских свинок дополнительно делают
посевы на агар Эндо из тонкого, толстого кишечника и мезентериальных
лимфатических узлов. Все посевы просматривают ежедневно, начиная со 2
до 7 сут. инкубирования.
В зависимости от результатов бактериологического исследования
могут быть приняты следующие решения по дальнейшему ведению испытаний:
1) Культура туляремийного микроба выделена из всех внутренних
органов. Штамм не может быть признан безвредным. Дальнейшие испытания
вакцинного штамма следует прекратить.
2) Выделяемая из органов подопытных животных культура испытуемого
штамма туляремийного микроба контаминирована посторонней микрофлорой.
В этом случае вопрос может быть решен следующим образом:
а) если контаминированная посторонней микрофлорой культура
испытуемого вакцинного штамма выделена из органов только нескольких
(от 1 - 2 морских свинок из всей группы), то этих животных не
учитывают при анализе результатов испытаний и опыт продолжают;
б) если контаминированная посторонней микрофлорой культура
испытуемого вакцинного штамма выделена от большого числа опытных
морских свинок, то следует считать, что опыт поставлен на
неполноценных животных и его необходимо повторить с использованием
здоровых морских свинок.
3) Культуру испытуемого штамма из органов подопытных животных
выделить не удалось, но на агаровых средах выявлен рост посторонней
микрофлоры. Если такой результат получен в высевах из нескольких
подопытных животных (1 - 2 морских свинок), то этих животных не
учитывают. В том случае, когда посторонняя микрофлора выделена от
большого числа животных, опыт повторяют на новой партии здоровых
животных.
4) Если штамм удовлетворяет перечисленным требованиям, то он
признается вакцинным.
3.6. Методика определения реактогенности вакцинного штамма для
морских свинок. Реактогенность испытуемого и контрольного штаммов
для морских свинок определяют по характеру прижизненных изменений
3 5 7 9
в месте введения 5 х 10 , 5 х 10 , 5 х 10 и 5 х 10 м. к. и в
регионарном лимфатическом узле, по изменению температуры и массы тела
свинок. Наблюдения проводят за животными из опыта по изучению
безвредности, которые согласно плану должны умерщвляться на 30-е сут.
после введения культур. Животных осматривают через 1 - 2; 3 - 4; 7 - 8
и 10 - 11 сут. после введения им испытуемого штамма. Реакцию на месте
введения определяют путем пальпации и измерения участков уплотнения,
инфильтратов, путем определения размеров лимфатических узлов, их
подвижности, болезненности.
Измерение температуры тела проводят ректально или орально с
помощью медицинского термометра или другого, подобного ему по
технической характеристике.
Массу тела животного определяют с точностью до одного грамма.
3.7. Морфологические изменения у морских свинок изучают
макроскопически и гистологически в динамике после однократного
подкожного введения в правую паховую область культуры испытуемого
3 5 7
штамма в малой (5 х 10 м. к.), средних (5 х 10 и 5 х 10 м. к.) и
9
максимальной (5 х 10 м.к.) дозах двухсуточной агаровой культуры.
Протокол вскрытия
от ----------- г.
N животного ---- вид ---------- пол ----------- масса ----------------
температура тела ----- доза -------- Название культуры ---------------
срок наблюдения ------------- Метод и место введения -----------------
Дата: введения ---------- гибели -------- умерщвления ----------------
Результаты вскрытия
Упитанность ----------------------------------------------------------
Состояние подкожных сосудов ------------------------------------------
Место введения -------------------------------------------------------
Лимфатические узлы:
Правый паховый -------------------------------------------------------
Левый паховый --------------------------------------------------------
Правый подмыш. -------------------------------------------------------
Левый подмыш. --------------------------------------------------------
Подвздошные ----------------------------------------------------------
Паратрахеальные ------------------------------------------------------
Бифуркационные -------------------------------------------------------
Легкие ---------------------------------------------------------------
Селезенка ------------------------------------------------------------
Печень ---------------------------------------------------------------
Почки ----------------------------------------------------------------
Надпочечники ---------------------------------------------------------
Другие органы --------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------
Костный мозг ---------------------------------------------------------
Подпись Дата
Статистический анализ всех полученных результатов осуществляют с
определением средних величин показателей и их доверительных интервалов
для уровня вероятности 95% (И.П. Ашмарин и А.А. Воробьев, 1962).
Приложение 4
(обязательное)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ИСПЫТУЕМОГО ВАКЦИННОГО ШТАММА НА МОРСКИХ СВИНКАХ
Стабильность биологических свойств культуры испытуемого
вакцинного штамма туляремийного микроба определяют после 10-кратных
пассажей ее на морских свинках массой 400 - 450 г при подкожном
способе введения.
Для первого пассажа используют двухсуточную агаровую культуру
испытуемого штамма второй генерации, выращенную на среде Мак-Коя или
9
на FT-агаре. Готовят взвесь культуры концентрацией 1 х 10 м.к./мл (как
описано в Прилож. 1) и шприцем объемом 5 мл вводят по 1 мл в правую
паховую область 2 морским свинкам. Через 4 сут. животных умерщвляют
хлороформом и вскрывают. Для последующего пассажа у умерщвленных
животных забирают регионарные (паховые) лимфатические узлы и селезенку
(400 - 500 мг), помещают их в фарфоровую ступку с 1 - 2 г стерильного
мелкого речного песка и растирают пестиком до гомогенного состояния.
Затем в ступку вносят 5 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия и
суспендируют гомогенат; дают осесть крупным кусочкам тканей и песку на
дно ступки, надосадочную жидкость забирают шприцем и вводят подкожно в
правую паховую область по 0,5 мл 2 морским свинкам (второй пассаж).
Параллельно делают посев суспензии на скошенную питательную среду в
пробирках Мак-Коя или FT-агар для подтверждения наличия культуры
испытуемого штамма F. tularensis. Посевы помещают в термостат и
инкубируют при температуре (37 +/- 1) град.С в течение 2 сут.
Аналогично второму пассажу проводят пассажи с третьего по десятый,
каждый раз на двух свинках и с параллельным высевом на питательную
среду. Если в каком-либо из пассажей культура не выделяется, в
дальнейшем используют культуру, полученную на питательной среде от
предыдущего пассажа.
Субкультуру, выделенную после десятого пассажа, а также все
субкультуры, выделенные от погибших животных и умерщвленных с
явлениями генерализации, параллельно с культурой контрольного штамма
F. tularensis 15 НИИЭГ изучают: по культурально-морфологическим,
биохимическим, серологическим свойствам, безвредности (по методике,
описанной в Прилож. 1).
Безвредность определяют по укороченной схеме для морских свинок
5 9
(дозы - 5 х 10 и 5 х 10 м.к.) и по полной схеме для белых мышей;
вскрытие и исследование животных проводят на 7, 14 и 21-е сут. после
введения. Методика исследования - в соответствии с Прилож. 3. Культура
испытуемого вакцинного штамма F. tularensis после 10 пассажа должна
быть стабильной и типичной по вышеперечисленным признакам в
соответствии с Прилож. 1 и 2.
Приложение 5
(обязательное)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИСПЫТУЕМОГО ВАКЦИННОГО
ШТАММА НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ МОРСКИХ СВИНОК
Методика подготовки испытуемого штамма для данных определений
аналогична описанной в Прилож. 1.
Влияние испытуемого штамма на иммунную систему определяют на
морских свинках массой 300 - 400 г. Экспериментальных животных
3
иммунизируют однократно подкожно согласно Прилож. 3 дозами 5 х 10 м.к.
4
и 5 х 10 м.к. односуточной агаровой культурой испытуемого и
контрольного вакцинных штаммов туляремийного микроба 15 НИИЭГ. Для
проведения исследований по нижеперечисленным тестам каждую дозу
испытуемого и контрольного штаммов вводят 10 животным.
Одновременно 10 морским свинкам вводят плацебо - 0,9%-й раствор
натрия хлорида.
Группы животных формируются методом случайной выборки
равнозначных по полу и массе. Иммунологические исследования проводят
через 1, 3, 7, 14 и 28 сут. после введения испытуемого штамма. При
обнаружении изменений в показателях необходимо срок наблюдения
продлить до восстановления изучаемых показателей до исходного уровня и
(или) уровня в контрольных группах.
Проводят следующие виды исследований в соответствии с РД
42-28-10-90 и "Медицинскими лабораторными технологиями" (Справочник,
2002). Животных для данных опытов используют тех же, что и для
определения безвредности, реактогенности и приживаемости штамма
(Прилож. 3).
5.1. Определение количества лейкоцитов в крови
Готовят 3%-й раствор уксусной кислоты, подкрашенный для окраски
ядер лейкоцитов несколькими каплями раствора метиленового синего.
Раствор имеет голубой цвет, длительно хранится. В пробирку с 1,9 мл
раствора уксусной кислоты вносят 0,1 мл крови (можно использовать
стабилизированную антикоагулянтами венозную кровь) и перемешивают.
Каплю содержимого пробирки помещают в счетную камеру Горяева.
Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин. для
оседания лейкоцитов. Затем помещают ее на столик микроскопа и при
малом увеличении (окуляр 10х, объектив 8х) подсчитывают лейкоциты в
100 больших квадратах. Расчет лейкоцитов проводят по формуле:
а х 250 х 20
Х = ------------ = а х 50,
100
где:
Х - число лейкоцитов в 1 мкл крови;
а - число лейкоцитов в 100 больших квадратах;
20 - разведение крови;
100 - число больших квадратов;
250 - коэффициент пересчета на 1 мкл, т.к. объем одного большого
квадрата равен 1/250 мкл (сторона квадрата - 1/5 мм, высота - 1/10
мм).
Практически для расчета количества лейкоцитов в 1 мкл крови их
число в 100 больших квадратах умножают на 50, а в 1 л - полученную
6
величину умножают еще на 10 .
5.2. Определение лейкоцитарной формулы
Лейкоцитарной формулой называется процентное соотношение
различных видов лейкоцитов, определяемое при подсчете их в мазке
крови.
Для приготовления мазка на чистое, сухое, обезжиренное предметное
стекло ближе к короткой стороне наносят стеклянной палочкой (или
непосредственно из места прокола) небольшую каплю крови, оставляя
стекло в горизонтальном положении каплей вверх. Влево от капли
прикладывают плотно ребром шлифованное стекло под углом 45 град. и
соединяют его с каплей. Ждут несколько секунд, пока капля не
расплывется полностью вдоль ребра шлифованного стекла. После этого
быстрым равномерным движением, не сильно надавливая, проводят по
стеклу полосу в сторону, противоположную от капли. Мазки высушивают на
воздухе. Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого
цвета, занимать почти всю длину стекла и заканчиваться неровными
зигзагами в виде "метелочки". Фиксацию проводят в этиловом (10 мин.)
или метиловом (4 мин.) спирте, окрашивают по Романовскому-Гимзе. В
качестве красителя используют готовый раствор Романовского-Гимзы,
который перед употреблением разводят из расчета 1 капля краски на 1 мл
нейтральной (рН 7,0) дистиллированной воды. Время окраски
устанавливают опытным путем для каждой партии красителя (25 - 40
мин.).
Мазки просматривают в световом микроскопе (иммерсионная система,
объектив 90х, окуляр 7х или 10х). На каждом стекле суммарно
просчитывают не менее 200 клеток, учитывая отдельные виды лейкоцитов.
Исходя из полученных результатов вычисляют процентное содержание
нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов и других клеток белой крови. Чтобы
определить содержание отдельных видов лейкоцитов в 1 мкл крови в
абсолютных числах, необходимо сначала подсчитать общее количество
лейкоцитов в 1 мкл крови и, отбросив две последние цифры, умножить на
процент содержания отдельного вида. Например: количество лейкоцитов в
1 мкл крови равно 5000, процент лимфоцитов равен 30. Следовательно,
абсолютное количество лимфоцитов в 1 мкл крови будет 50 х 30 = 1500.
5.3. Выделение лимфоцитов из крови морских свинок
Кровь у морских свинок берут из сердца в объеме 2 мл в пробирку
со средой 199 или раствором Хенкса с (25 +/- 0,5) ед./мл гепарина в
соотношении 1 часть крови и 3 части среды. После перемешивания
разведенную кровь наслаивают в пробирке на водный раствор верографина
плотностью (1,077 +/- 0,002) г/мл, не допуская смешивания слоев.
Соотношение объемов 2:1. Затем центрифугируют (15 +/- 1) мин. при (450
+/- 25) g. Пастеровской пипеткой с тонко оттянутым капилляром собирают
образовавшееся над слоем верографина беловатое кольцо лимфоцитов.
Полученная взвесь содержит примесь градиента плотности и тромбоцитов,
которые удаляют путем 2-кратного отмывания клеток в охлажденном
растворе Хенкса без ионов магния и кальция. Режим центрифугирования -
(10 +/- 1) мин. при (280 +/- 20) g. По завершении процесса отмывания
клеток осадок ресуспендируют в среде 199 или среде Игла. Необходимая
для дальнейших исследований концентрация клеток должна составлять 2 х
6
10 клеток в 1 мл.
5.4. Определение количества лимфоцитов во взвеси
Из полученного 1 мл клеточной взвеси после ресуспендирования
отбирают 0,02 мл и переносят в пробирку с 0,38 мл 3%-го раствора
уксусной кислоты, подсиненной раствором метиленового синего, затем
перемешивают. Каплю содержимого пробирки помещают в счетную камеру
Горяева. Клетки считают под микроскопом при малом увеличении (окуляр
10х, объектив 8х) в 100 больших квадратах и умножают полученное число
4
на 5,0 х 10 (коэффициент пересчета количества клеток, подсчитанных в
камере Горяева, в количество клеток, содержащихся в 1 мл взвеси).
Необходимая для дальнейших исследований рабочая концентрация клеток
6
должна составлять 2,0 х 10 клеток в 1 мл.
5.5. Определение жизнеспособности лимфоцитов
К 0,1 мл взвеси лимфоцитов в рабочей концентрации добавляют 1
каплю 0,2%-го раствора трипанового синего (или 0,1 мл 0,2%-го эозина
БА в 0,9%-м растворе натрия хлорида, рН 7,2). Суспензию оставляют на
30 с при температуре (20 +/- 2) град.С, а затем под микроскопом в
камере Горяева учитывают результат. Живые лимфоциты остаются
бесцветными, а погибшие клетки окрашиваются. При правильном выделении
лимфоцитов живых клеток должно быть не менее 98%.
5.6. Определение количества Т-лимфоцитов
цитотоксическим тестом
Цитотоксический тест - это иммунологическая реакция, позволяющая
выявить антигены, расположенные на поверхности жизнеспособных
лимфоцитов. Основной принцип метода заключается в том, что антитела,
направленные против различных лимфоцитарных антигенов, фиксируются
специфически на клетках, содержащих эти антигены, и в присутствии
комплемента нарушают целостность клеточной мембраны. Образование
"отверстия" в мембране лимфоцитов позволяет прибавленному к взвеси
красителю (трипановый синий) проникать внутрь клетки и окрашивать ее.
Жизнеспособные с интактной мембраной клетки этим красителем не
окрашиваются.
Коммерческую поликлональную сыворотку против Т-лимфоцитов
разводят средой 199 до рабочей концентрации, указанной на этикетке. В
центрифужной пробирке или в лунке панели смешать 60 мкл сыворотки, 20
7
мкл исследуемой взвеси лимфоцитов (концентрация 10 кл./мл) и 20 мкл
комплемента морской свинки в разведении 1:3. В контрольные пробирки
7
или лунки вносят 20 мкл взвеси лимфоцитов (концентрация 10 кл./мл), 20
мкл взвеси комплемента и 60 мкл среды 199. Смеси перемешивают и
инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 2) град.С в течение 25
- 30 мин. В каждую пробирку или лунку добавляют по 1200 мкл 0,5%
раствора трипанового синего (500 мг красителя растворяют в 100 мл
горячего 80 - 90 град.С 0,9%-го раствора хлорида натрия; перемешивают
10 мин. на магнитной мешалке и фильтруют через фильтровальную бумагу).
Через 30 - 60 с взвесь из лунки помещают в счетную камеру. Определяют
число погибших клеток, вычисляют их процент от общего количества
клеток в препарате, подсчитывают цитотоксический индекс (ЦТИ) по
формуле:
% убитых клеток в опыте - % убитых клеток в контроле
ЦТИ = 100 х ----------------------------------------------------.
100 - % убитых клеток в контроле
ЦТИ указывает, какой процент клеток среди исследуемой взвеси
несет соответствующий антигенный маркер и, следовательно, принадлежит
к данной популяции.
5.7. Определение количества В-лимфоцитов
цитотоксическим тестом
Общее количество В-лимфоцитов определяют в цитотоксическом тесте
с поликлональной специфической сывороткой против В-лимфоцитов.
Постановка теста аналогична постановке цитотоксического теста с
анти-Т-сывороткой.
5.8. Определение количества В-лимфоцитов
иммунофлюоресцентным методом
Принцип метода основан на том, что В-лимфоциты несут
поверхностные иммуноглобулины, которые выявляются в реакции
иммунофлюоресценции с помощью антииммуноглобулиновых антител, меченных
флюорохромом.
В пробирки, помещенные на ледяную баню, вносят 0,1 - 0,25 мл
6
суспензии лимфоцитов (5 х 10 лимф./мл) в растворе Хенкса с 1 - 5%
раствором бычьего сывороточного альбумина. Затем добавляют равный
объем иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих антивидовых
против иммуноглобулинов морской свинки в рабочем разведении (раствор
антител готовят в забуференном 0,9% растворе натрия хлорида). Смесь
инкубируют и помешивают в течение 30 мин. при (4 +/- 0,5) град.С в
присутствии 0,25% раствора азида натрия, после чего суспензию клеток 3
раза отмывают, добавляя к осадку раствор Хенкса и центрифугируя (10
+/- 1) мин. при (450 +/- 20) g. Последнее (третье) отмывание проводят
охлажденным до 4 град.С забуференным 0,9% раствором натрия хлорида,
так как раствор Хенкса и среда 199 обладают оптической активностью и
могут искажать результаты микроскопии. Осадок ресуспендируют в 0,05 мл
забуференного 0,9% раствора натрия хлорида и наносят на тщательно
вымытое и обезжиренное предметное стекло (из нефлуоресцирующего
стекла) с проведенными парафиновым стеклографом окружностями,
ограничивающими исследуемый материал. Накрывают покровным стеклом,
окантовывают вазелином и микроскопируют с помощью люминесцентного
микроскопа, используя светофильтры, рекомендованные инструкцией для
ФИТЦ, и масляную иммерсионную систему. При микроскопии учитывают
клетки, имеющие кольцевое или точечное (гранулярное) свечение.
Диффузно окрашенные клетки не учитываются. Параллельно с помощью
фазово-контрастного устройства проводят подсчет количества клеток в
каждом поле зрения. Относительное процентное содержание В-лимфоцитов
определяют после подсчета 200 - 300 клеток в препарате по формуле:
Х = В х 100 / А,
где:
А - общее количество клеток;
В - количество клеток со специфическим свечением.
Для подсчета абсолютного содержания В-лимфоцитов используют
следующую формулу:
Д = А х Б х В / 10000,
где:
Д - абсолютное содержание В-лимфоцитов в 1 л крови;
А - количество лейкоцитов в 1 л крови;
Б - процентное содержание лимфоцитов в пуле лейкоцитов крови;
В - процент В-лимфоцитов в пуле лимфоцитов крови.
Результаты исследований отражают в таблице:
------------------------------------------------------------------
| Сутки | Абсолютное содержание |Относительное содержание |
| исследования | | (%) |
| |-----------------------|-------------------------|
| |В-лимфоциты| р с К |В-лимфоциты | р с К |
|--------------|-----------|-----------|------------|------------|
|Контроль (К) | | | | |
|--------------|-----------|-----------|------------|------------|
|1 | | | | |
|--------------|-----------|-----------|------------|------------|
|3 | | | | |
|--------------|-----------|-----------|------------|------------|
|7 | | | | |
|--------------|-----------|-----------|------------|------------|
|14 | | | | |
|--------------|-----------|-----------|------------|------------|
|28 | | | | |
------------------------------------------------------------------
5.9. Определение фагоцитарной активности макрофагов
Фагоцитарная активность (ФА) определяется процентом
фагоцитирующих клеток и количеством захваченных частиц на один фагоцит
(фагоцитарное число - ФЧ).
Клетки перитонеального экссудата (КПЭ) выделяют асептически от
морских свинок опытной и контрольной групп. Делают разрез по срединной
линии передней брюшной стенки и осторожно отсепаровывают кожный
лоскут, не нарушая целостности брюшины. Через прокол иглой,
соединенной со шприцом, в брюшную полость вводят 20 мл среды 199,
содержащей 5 МЕ гепарина в 1 мл. Осторожно массируют переднюю брюшную
стенку. Через 3 - 5 мин. через надрез в брюшине пастеровской пипеткой,
соединенной с резиновой грушей, собирают содержимое и сливают через
нейлоновый фильтр в пробирки, стоящие на льду. Не используют
экссудаты, содержащие примесь эритроцитов. Затем клетки осаждают
центрифугированием (280 +/- 20) g при температуре (4 +/- 0,5) град.С в
течение (10 +/- 1) мин., ресуспендируют в среде 199 с 10% сывороткой
крупного рогатого скота и антибиотиками (100 ед./мл) до конечной
6
концентрации 2 х 10 кл./мл. Полученную суспензию клеток разливают по 2
мл в чашки Петри диаметром 40 мм, которые инкубируют при температуре
(37 +/- 0,5) град.С в атмосфере с 5% CO . Через 60 мин. смывают
2
неприлипшие клетки раствором Хенкса, добавляют 2 мл свежей среды 199 и
инкубируют в течение следующих 18 ч при температуре (37 +/- 0,5)
град.С в атмосфере с 5% CO .
2
Клетки для исследования фагоцитоза можно получить также на
половинках покровных стекол, помещенных в пробирки с 1,5 - 2 мл КПЭ.
Объектом фагоцитоза могут служить эритроциты барана,
дрожжеподобные грибы Candida albicans или лабораторный штамм
Staphilococcus (9198) или любые другие микробные клетки. Суточные
культуры живых или убитых прогреванием при температуре 90 град.С
микроорганизмов отмывают не менее 3 раз 0,9%-м раствором натрия
хлорида, ресуспендируют в нем и определяют концентрацию суспензии по
стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85П 10 единиц. Взвесь разводят
средой 199 до концентрации, соответствующей соотношению 1,0 - 2,0 х
9
10 м.к./мл.
Эритроциты барана (ЭБ) трижды отмывают 0,9%-м раствором натрия
хлорида рН 7,2, осаждая центрифугированием при (400 +/- 20) g в
течение 5 мин. Готовят 0,5%-ю взвесь ЭБ на среде 199.
В чашки Петри, содержащие КПЭ, наливают 1 мл свежей среды 199 и
вносят по 1 мл 0,5%-й взвеси ЭБ или соответствующих микроорганизмов и
инкубируют при температуре (37 +/- 0,5) град.С в атмосфере с 5% СО .
2
Через 30 - 60 мин. чашки споласкивают холодным раствором Хенкса,
высушивают при комнатной температуре, фиксируют в метаноле (или в
смеси Никифорова) или парами 10%-го раствора формалина (5 - 10 мин.),
окрашивают по Романовскому-Гимзе.
При микроскопии препаратов учитывают не менее 200 клеток,
подсчитывая фагоцитирующие клетки и количество содержащихся в них ЭБ
или микробов.
Результаты выражают процентом фагоцитирующих клеток (ФА) и
фагоцитарным числом (ФЧ), которое определяется средним числом
поглощенных ЭБ или микробов на один фагоцит.
Процент фагоцитирующих клеток (ФА) рассчитывается по формуле:
ФА = В х 100 / А,
где:
А - общее количество клеток;
В - количество фагоцитирующих клеток с поглощенными ЭБ или
микробами.
Результаты исследований представляют для каждой дозы в таблице:
------------------------------------------------------------------
| Сутки | ФА |р с контролем| ФЧ |р с контролем|
|исследования| | | | |
|------------|----------|-------------|------------|-------------|
|Контроль | | | | |
|------------|----------|-------------|------------|-------------|
|1 | | | | |
|------------|----------|-------------|------------|-------------|
|3 | | | | |
|------------|----------|-------------|------------|-------------|
|7 | | | | |
|------------|----------|-------------|------------|-------------|
|14 | | | | |
|------------|----------|-------------|------------|-------------|
|28 | | | | |
------------------------------------------------------------------
5.10. Получение взвеси клеток селезенки
Животных умерщвляют и извлекают селезенку. Селезенку освобождают
от прилежащих тканей, капсулы, измельчают в охлажденном растворе
Хенкса без ионов кальция и магния и продавливают через стальное сито с
диаметром пор 1 мм (или селезенку взвешивают на торсионных весах и
осторожным раздавливанием в стеклянном гомогенизаторе готовят взвесь
клеток из расчета 1 мл среды 199 на 50 мг ткани селезенки). Полученную
суспензию фильтруют через нейлоновый фильтр. Содержание ядросодержащих
клеток селезенки определяют с использованием раствора трипанового
синего. На основании полученной цифры и веса селезенки можно
рассчитать абсолютное количество ядросодержащих клеток в селезенке.
0,5 мл взвеси спленоцитов отмывают 5 мл среды 199 путем
центрифугирования в течение 10 мин. при 150 g, надосадок удаляют,
осадок разводят средой 199 с 10%-ми сыворотки крупного рогатого скота
и антибиотиками (100 ед./мл) до исходной концентрации.
5.11. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ)
спонтанная и под влиянием Т- и В-клеточных митогенов
6
Для спонтанной РБТЛ суспензию спленоцитов (5 х 10 кл./мл) на
"среде культивирования" (среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной
-5
телячьей сыворотки, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 5 х 10 М
2-меркаптоэтанола, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина)
разливают в 96-луночную пластиковую панель по 200 мкл в лунку (по три
лунки на каждый образец) и инкубируют в СО -инкубаторе (5% СО ) при
2 2
3
температуре 37 град.С в течение 72 ч. Затем добавляют Н-тимидин в
объеме 25 - 50 мкл в среде RPMI-1640 на лунку и инкубируют в тех же
условиях еще 16 - 24 ч. По окончании инкубации клетки переносят на
фильтры с помощью прибора "Cell Harwestr", фильтры после сушки в
термостате при температуре 37 град.С помещают во флаконы, содержащие
по 3 мл сцинтилляционной жидкости (на 1 л толуола 0,2 г РОРОР и 5 г
РРО).
Реакция бласттрансформации лимфоцитов под влиянием Т- и
В-клеточных митогенов служит для оценки функциональной активности
лимфоцитов. Специфическое распознавание митогена индуцирует в клетках
пролиферацию, т.е. деление клеток. Некоторые митогены селективно
стимулируют различные субпопуляции лимфоцитов. Например, КонА
стимулирует тимоциты, зрелые и незрелые Т-клетки, ФГА стимулирует
пролиферацию только зрелых Т-клеток. Такие митогены, как
липополисахарид и бактериальный липопротеин, стимулируют пролиферацию
В-клеток. Благодаря этой селективности митогены могут использоваться
для характеристики функционального состояния различных субпопуляций
иммунокомпетентных клеток.
Постановку РБТЛ под влиянием митогенов осуществляют так же, как
спонтанную, только в опытные лунки добавляют Т- или В-клеточные
митогены (не менее 3 лунок на каждый митоген) в оптимальной
стимулирующей дозе (КонА 1 - 15 мкг/мл, ФГА 10 - 15 мкг/мл, ЛПС 15 -
100 мкг/мл). Контролем служат лунки с взвесью лимфоцитов без
добавления митогенов.
Учет результатов.
Радиоактивность (имп./мин.) образцов измерить с помощью
бета-счетчика. Учет реакции можно проводить визуально, определяя
процент бластных форм лимфоцитов. Результаты представляют в виде
индексов стимуляции клеток (ИСК), которые подсчитывают по формуле:
имп./мин. в культуре с митогеном
ИСК = ---------------------------------.
имп./мин. в культуре без митогена
Результаты определений отражают в таблице:
-----------------------------------------------------------------------
| Сутки | N | Стимуляция Т-системы | Стимуляция |
| | животного | | В-системы |
| | |----------------------------|------------|
| | | ФГА |р с К |Con А |р с К | ЛПС |р с К|
|---------------|-----------|-------|------|------|------|------|-----|
|7 | | | | | | | |
|---------------|-----------|-------|------|------|------|------|-----|
|14 | | | | | | | |
|---------------|-----------|-------|------|------|------|------|-----|
|28 | | | | | | | |
|---------------|-----------|-------|------|------|------|------|-----|
|Контроль (К) | | | | | | | |
-----------------------------------------------------------------------
5.12. Определение поликлональной активности В-лимфоцитов
Для получения этого показателя определяют число клеток,
продуцирующих антитела к эритроцитам барана (АОК). Необходимо
подчеркнуть, что иммунизация морских свинок эритроцитами барана в этих
опытах не проводится, а определяют количество спонтанных "фоновых" АОК
в селезенке. Увеличение их количества после введения вакцины является
показателем поликлональной активации В-лимфоцитов. Число АОК в
селезенке определяют методом локального гемолиза в геле.
Выявление антителообразующих клеток методом локального гемолиза в
геле производят следующим образом.
Эритроциты барана (ЭБ) трижды отмывают 0,9%-м раствором натрия
хлорида рН 7,2, осаждая центрифугированием при (400 +/- 20) g в
течение 7 мин., добавляют к 0,9%-му раствору агарозы <*> из расчета 2
7
- 3 х 10 эритроцитов в 1 мл. Полученную рабочую смесь разливают по 2,5
мл в пробирки, помещенные в водяную баню при температуре 43 - 44
град.С. В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл взвеси исследуемых
7
клеток селезенки (концентрация 10 кл./мл), перемешивают и выливают на
чашку Петри, равномерно распределяя по дну. Через 5 мин. чашки
помещают в термостат при температуре (37 +/- 0,5) град.С на 1 ч. Затем
в каждую чашку вносят путем наслаивания по 2,5 мл разведенного в 5 раз
средой 199 комплемента морской свинки, сухого или разведенного в 10
раз свежезамороженного комплемента. После 30 мин. инкубации при
температуре (37 +/- 0,5) град.С подсчитывают число зон гемолиза на
6
каждой чашке. Рассчитывают число АОК на 1 х 10 ядросодержащих клеток
селезенки. Рассчитывают индекс поликлональной стимуляции (ИПС) по
формуле:
6
число АОК на 1 х 10 ядросодержащих клеток в опыте
ИПС = --------------------------------------------------.
6
число АОК на 10 ядросодержащих клеток в контроле
--------------------------------
<*> Приготовление 0,9%-го раствора агарозы: навеску сухой агарозы
(см. табл.) смешивают с дистиллированной водой, смесь кипятят на
водяной бане до полного растворения агарозы; емкость с раствором
переносят в водяную баню с температурой 43 - 44 град.С, добавляют
10-кратный раствор Хенкса, рН раствора доводят до 7,2 1%-м раствором
KH PO или NaOH (по цвету индикатора, присутствующего в растворе Хенкса
2 4
и имеющего при значениях рН 6,8 - 7,0 желтовато-оранжевый цвет, 7,2 -
7,4 - розовато-красный цвет, при значениях рН выше 7,4 - малиновый
цвет).
------------------------------------------------------------------
|Количество| Масса | Объем |Объем концентрата раствора|
| чашек |агарозы| дистиллированной | Хенкса (10-кратный) |
| | | воды | |
|----------|-------|------------------|--------------------------|
|10 |225 мг |22,5 мл |2,5 мл |
------------------------------------------------------------------
Результаты исследований для морских свинок, иммунизированных
3 4
дозами 5 х 10 и 5 х 10 м.к., отражают в таблице:
------------------------------------------------------------------
| | 6 | | |
| Сутки | Число АОК на 10 | Р с К | Индекс поликлональной|
| | | | стимуляции |
|------------|------------------|---------|----------------------|
|Контроль (К)| | | |
|------------|------------------|---------|----------------------|
|3 | | | |
|------------|------------------|---------|----------------------|
|7 | | | |
|------------|------------------|---------|----------------------|
|14 | | | |
|------------|------------------|---------|----------------------|
|28 | | | |
------------------------------------------------------------------
5.13. Исследование иммунореактивности
на гетерологичный антиген
Исследуют влияние испытуемого штамма на развитие иммунного ответа
морских свинок на гетерологичный антиген (эритроциты барана) по
формированию АОК к эритроцитам барана (ЭБ).
Для проведения этих экспериментов морских свинок разделяют на 2
группы по 8 штук в каждой. Морских свинок первой группы иммунизируют
изучаемым штаммом, морские свинки второй группы - интактные
(контрольные). Морским свинкам обеих групп вводят внутривенно по 1 мл
50% взвеси отмытых эритроцитов барана. Иммунный ответ на
гетерологичный антиген оценивают по количеству АОК (5.10) через 4 сут.
после введения эритроцитов. Рассчитывают индекс поликлональной
стимуляции (ИПС) по формуле:
6
число АОК на 10 ядросодержащих клеток селезенки в опыте
ИПС = -----------------------------------------------------------.
6
число АОК на 10 ядросодержащих клеток селезенки в контроле
Результаты исследований отражают в таблице:
------------------------------------------------------------------
| Группа свинок | АОК к ЭБ |Индекс стимуляции|р с интактными |
|-----------------|------------|-----------------|---------------|
|Иммунизированные | | | |
|-----------------|------------|-----------------|---------------|
|Интактные | | | |
------------------------------------------------------------------
Приложение 6
(обязательное)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИВИВАЕМОСТИ ИСПЫТУЕМОГО ВАКЦИННОГО ШТАММА
Прививаемость вакцинных штаммов туляремийного микроба проверяют
накожно на морских свинках массой 300 - 400 г со светлой кожей.
Накануне прививки у 20 морских свинок на боку выщипывают шерсть в зоне
светлой (белой) кожи.
Для определения прививаемости используют двухсуточную агаровую
культуру испытуемого и контрольного вакцинных штаммов второй
генерации, выращенную на питательной среде Мак-Коя или на FT-агаре.
9
Готовят взвесь культуры концентрацией 5 х 10 м.к./мл туляремийного
микроба в 0,9%-м растворе натрия хлорида по стандартному образцу
мутности ОСО 42-28-85П 10 единиц, затем делают последовательные
-1 -3
десятикратные разведения этой взвеси от 10 до 10 . Культурой из двух
-2 7 -3 6
последних разведений 10 (5 х 10 м.к./мл) и 10 (5 х 10 м. к./мл)
прививают накожно по 5
морских свинок каждой дозой каждого штамма. Перед прививкой кожу
обрабатывают спиртом или эфиром. После испарения спирта или эфира на
-2 -3
кожу наносят по 2 капли взвесей из разведений 10 и 10 на расстоянии
2 - 3 см одна от другой. Через каждую каплю оспопрививательным пером
делают по 2 параллельные насечки длиной в 1 см. Взвесь, нанесенную на
кожу, тщательно втирают в течение 1 мин. плоской стороной пера.
Насечки следует делать таким образом, чтобы они излишне не
кровоточили; кровь должна выступать только мелкими росинками при
втирании взвеси микробов. Поверхностное нанесение на кожу царапин без
появления росинок крови снижает эффективность прививки. Наблюдение за
животными в опытной и контрольной группах ведут в течение 10 сут.;
отмечают кожные реакции на месте прививки культур вакцинных штаммов:
диаметр гиперемии (в мм), отека, наличие или отсутствие инфильтрата.
У всех привитых контрольным и испытуемым штаммами туляремийного
микроба на вторые - пятые сутки после прививки должен появиться
инфильтрат и гиперемия вокруг насечек размером 0,5 - 1,5 см.
Приложение 7
(обязательное)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ
ИСПЫТУЕМОГО ВАКЦИННОГО ШТАММА
7.1. Определение иммуногенности при подкожном
способе иммунизации морских свинок
Перед испытанием штамма на иммуногенность распределяют 66 морских
свинок массой 300 - 400 г методом случайной выборки на три группы: 1
группа - 30 животных - для иммунизации контрольным вакцинным штаммом
F. tularensis 15 НИИЭГ, 2 группа - 30 животных - для иммунизации
испытуемым штаммом, 3 группа - 6 животных - контроль.
Для определения иммуногенности используют двухсуточные агаровые
культуры испытуемого и контрольного вакцинных штаммов второй
генерации, выращенные на питательной среде Мак-Коя или на FT-агаре.
9
Готовят взвеси культур концентрацией 5 х 10 м.к./мл в 0,9% растворе
натрия хлорида по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85П 10
единиц соответствующего года выпуска. Затем делают последовательные
-9
десятикратные разведения этих взвесей до разведения 10 (5 м.к./мл).
Морских свинок иммунизируют подкожно в область верхней трети правого
бедра испытуемым и контрольным вакцинными штаммами по 6 животных на
4 3 2 1
каждую дозу: 5 х 10 м.к., 5 х 10 м.к., 5 х 10 м.к., 5 х 10 м.к.
и 5 м.к. Культуру вводят одним шприцем в объеме 1 мл, начиная с
меньшей дозы. Для подсчета ED или расчета количества фактически
50 -7
введенных туляремийных бактерий производят высев из разведения 10 по
0,1 мл на 5 чашек с FT-агаром.
Тест - заражающий штамм F. tularensis 503/840 (голарктического
подвида) должен обладать типичными культурально-морфологическими и
биохимическими свойствами. Должен быть высоковирулентным - 1 Dcl
(Dosis certa letalis) для морских свинок при подкожном заражении не
должна превышать 5 м.к./мл. Для заражения используют двухсуточную
агаровую культуру заражающего тест-штамма 2 пассажа, выращенную на
питательной среде Мак-Коя или на FT-агаре. Готовят взвесь культуры
9
концентрацией 5 х 10 м.к./мл в 0,9% растворе натрия хлорида по
стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85П 10 единиц, затем делают
последовательные десятикратные разведения этой взвеси до разведения
-9
10 (5 м.к./мл), что соответствует 1 Dcl. Для подсчета ED или расчета
50
количества фактически введенных туляремийных бактерий производят высев
-7
из разведения 10 по 0,1 мл на 5 чашек, содержащих питательную среду
(кровяную, гемоглобиновую или FT-агар), по обычной методике.
Через 25 - 30 сут. после иммунизации морских свинок (30
иммунизированных контрольным штаммом и 30 испытуемым) заражают
подкожно в область верхней трети левого бедра в дозе, соответствующей
1000 Dcl вирулентного штамма туляремийного микроба. Вирулентную
культуру животным вводят в объеме 1 мл. Одновременно заражают по 3
контрольне морские свинки дозами 1 Dcl и 1000 Dcl. Наблюдение за
зараженными животными ведут в течение 30 сут. Все контрольные морские
свинки должны погибнуть в срок до 16 сут. Погибших животных
регистрируют и вскрывают общепринятым методом, а органы и ткани
(селезенку, печень, лимфатический узел из места введения, кровь)
подвергают бактериологическому исследованию, высевая их методом
отпечатков на питательную среду Мак-Коя или FT-агар.
Учет результатов посевов производят через 3 - 7 суток. Морских
свинок с типичными для туляремии изменениями и выделением культуры
туляремийного микроба считают погибшими от туляремии. Животных,
погибших от неспецифических причин, исключают из числа взятых в опыт.
В случае выживания контрольных свинок опыт следует повторить с
использованием более вирулентного заражающего штамма.
Величину ED испытуемого и контрольного вакцинных штаммов
50
вычисляют по методу Кербера, описанному И.П. Ашмариным и А.А.
Воробьевым (1962):
lg ED = lg D - l (SUM L - 0,5),
50 i
где:
D - максимальная из испытанных доз;
L - отношение числа животных, иммунизированных данной дозой и
i
выживших после заражения, к общему числу животных, которых
иммунизировали этой дозой;
SUM L - сумма значений L , найденных для всех испытанных доз.
i i
ED вакцинного штамма для морских свинок должна составлять не
50
более 1000 м.к.
7.2. Определение сроков формирования специфического
иммунитета у морских свинок, привитых испытуемым
вакцинным штаммом
Для оценки иммуногенных свойств испытуемого вакцинного штамма
важно определить сроки наступления иммунитета. Испытание проводят в
сравнении с контрольным вакцинным штаммом туляремийного микроба 15
НИИЭГ. Культурой каждого штамма иммунизируют подкожно по 40 морских
4
свинок дозой 5 х 10 м.к./мл. Заражение животных проводят двухсуточной
культурой вирулентного штамма в дозе, соответствующей 1000 Dcl в
объеме 1 мл на 3, 5, 7 и 14-е сут. после иммунизации (в каждый срок по
10 свинок). Одновременно с иммунизированными в каждый срок заражают по
3 контрольные (неиммунизированные) морские свинки в дозах,
соответствующих 1 Dcl и 1000 Dcl. Наблюдение за зараженными животными
проводят в течение 30 сут. Все контрольные морские свинки должны
погибнуть в срок до 16 сут. Погибших животных вскрывают и исследуют
бактериологически. Полученные данные обрабатывают, определяя сутки, на
которые штамм защищает опытных животных.
7.3. Определение напряженности иммунитета
у морских свинок
Для определения напряженности иммунитета морских свинок массой
300 - 400 г иммунизируют подкожно двухсуточными агаровыми культурами
4
испытуемого и контрольного штаммов дозой 5 х 10 м.к./мл. Культурой
каждого штамма иммунизируют по 40 свинок. На 30-е сут. после
иммунизации животных заражают подкожно культурой вирулентного штамма
туляремийного микроба дозами 100, 500, 2500 и 12500 м.к./мл. На каждую
заражающую дозу берут по 10 животных. Одновременно заражают 12
контрольных животных в дозах, соответствующих 1, 5, 25 и 125 м.к./мл
(по 3 морские свинки на каждую дозу).
Наблюдения за зараженными животными проводят в течение 30 сут.
Погибших животных вскрывают и исследуют бактериологическим методом.
Результаты обрабатывают статистически - рассчитывают величину Dcl
вирулентного штамма, полученную на иммунизированных и контрольных
животных, определяют величину LD , от которой выжило 50%
50
иммунизированных и контрольных животных.
Затем вычисляют индекс иммунитета для морских свинок, привитых
испытуемым и контрольным вакцинными штаммами туляремийного микроба.
Индекс иммунитета (ИИ) - это отношение величины LD для
50
вакцинированных животных к величине LD для контрольных животных.
50
LD заражающего вирулентного штамма, при которой выжило 50% морских
50
свинок, и величина индекса иммунитета для испытуемого штамма должна
быть не меньше, чем таковые для контрольного вакцинного штамма.
7.4. Определение длительности иммунитета
на морских свинках
Для определения сроков сохранения (длительности) иммунитета
используют культуры испытуемого и контрольного вакцинных штаммов. По
40 морских свинок для испытуемого и контрольного штаммов иммунизируют
4
подкожно дозой 5 х 10 м.к./мл. Заражение животных проводят 1000 Dcl
вирулентного штамма туляремийного микроба через 3, 6 и 9 мес. после
иммунизации (по 10 животных через 3 и 6 мес., а оставшихся живыми -
через 9 мес.). Одновременно с введением вирулентной культуры
иммунизированным животным в каждый срок заражают по 6 контрольных
морских свинок (3 - 1 Dcl и 3 - 1000 Dcl). О длительности иммунитета
судят по количеству животных, выживших в каждый срок заражения.
Длительность иммунитета, обеспечиваемого испытуемым штаммом, не
должна быть меньше, чем для контрольного вакцинного штамма
туляремийного микроба 15 НИИЭГ.Страницы: 1 2 |