Страницы: 1 2
течение 20 мин. Экстракцию белков проводят добавлением к лизату 6 мл
смеси фенола и хлороформа в соотношении 1:1. Суспензию осторожно
перемешивают, а затем центрифугируют 10 мин. при 10 тыс. об./мин.
Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, используют для
электрофоретического анализа. Электрофорез ДНК проводят в
горизонтальных пластинках 0,7%-ного агарозного геля при силе тока 70 -
90 мА. Гель окрашивают в течение 20 мин. бромистым этидием в
концентрации 0,5 мкг/мл, отмывают в дистиллированной воде и
фотографируют в ультрафиолетовом свете на фотопленку "Фото-65". На
фотографии агарозного геля у испытуемого и эталонного вакцинного СТИ-1
штаммов сибиреязвенного микробов должна быть полоска, соответствующая
по размеру ДНК плазмиды рХО1 (110 МД).
4. Определение наличия pag-гена проводится в соответствии с
Инструкцией по применению тест-системы для обнаружения В. anthracis
рХО1+ методом полимеразной цепной реакции (ФСП 42-...).
Приложение 2
(обязательное)
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЗВРЕДНОСТИ ВАКЦИННЫХ
ШТАММОВ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА
1. Подготовка к проведению исследований лабораторных животных
(мышей, свинок, кроликов, овец и коз).
Поступивших в лабораторию морских свинок выдерживают перед
началом исследований в карантине не менее 10 сут. Проводят оценку
поголовья животных путем взвешивания, термометрирования и ежедневного
клинического наблюдения. Состояние здоровья поголовья морских свинок
определяют также по данным патолого-анатомического и гистологического
исследований. Для этого по 10 животных вскрывают и исследуют в три
этапа: в начале карантина, в день начала опыта и через 30 дней после
постановки опыта. Повторное взвешивание и термометрирование свинок
проводят накануне введения им испытуемого штамма. Животные могут быть
использованы для определения безвредности аттенуированного штамма
сибиреязвенного микроба в том случае, если большинство из них в
виварии клинически здорово, за время карантина не снизили или
прибавили в массе, ректальная (или оральная) температура максимально
не превысила 38,5 град.С.
При общем благополучном состоянии поголовья могут быть отдельные
случаи потери массы, заболевания и даже гибели животных. Эти случаи не
должны превышать 1,5% от общего числа животных вивария.
2. Определение степени остаточной вирулентности и реактогенности
для морских свинок.
Оценку безвредности штамма в опытах на морских свинках проводят
по клиническим проявлениям на подкожное введение испытуемой культуры,
летальности, распространенности и приживаемости микробов в органах и
тканях по результатам бактериологических, а также патоморфологических
исследований животных, забитых и вскрытых в разные сроки после
однократного введения споровой культуры.
2.1. Распространяемость, приживаемость и реактогенность штамма
определяют в одном опыте на одной и той же группе животных.
Накануне опыта морских свинок (масса 350 - 400 г) с учетом
показателей массы распределяют на равноценные группы для каждого
штамма и каждой дозы. На каждый штамм берут по 160 морских свинок,
распределяют их по массе на 4 равноценные группы: две - по 50 и две
группы - по 30 животных. Испытуемый и эталонный вакцинный штаммы
сибиреязвенного микроба в споровой форме (не менее 90% жизнеспособных
спор по методу микрокультуры) вводят морским свинкам под кожу бедра в
7
паховой области в объеме 1 мл, содержащим по 5 х 10 (50 свинок на
6 4 2
штамм), 10 (50 свинок), 10 (30 свинок) и 10 (30 свинок) спор.
2.2. Методика вскрытия, патолого-анатомические и
бактериологические исследования лабораторных животных при определении
безвредности штаммов.
Для определения распространяемости и приживаемости микробов и
патоморфологических изменений в органах и тканях, вызываемых в разные
сроки, животных по 3 для каждой культуры и каждой дозы умерщвляют
поочередно хлороформом на 1, 3, 5, 8, 15, 21 и 30-е сутки после
введения испытуемых культур. Как можно быстрее, не позднее 20 - 30
мин. после смерти, проводят их вскрытие, перед вскрытием тушки
смачивают мыльным раствором, проводят тщательное описание
патолого-анатомических изменений и их бактериологическое исследование,
берут органы для патогистологического исследования. Кусочки органов,
тканей и лимфатические узлы фиксируют в 10%-ном растворе нейтрального
формалина. Для каждого животного берут отдельную банку емкостью 300 -
500 мл с притертой или резиновой пробкой, на 2/3 заполненную
формалином. В банку помещают бумажную этикетку, на которой простым
карандашом крупно с обеих сторон написаны номер животного, шифр
культуры, дата взятия материала и день наблюдения. На другой этикетке
пишут название лимфатических узлов. Результаты патолого-анатомического
исследования записывают в протокол вскрытия. Вскрытие животных
производят на доске, размещенной в кювете из нержавеющего металла. На
доску кладут лист пергаментной бумаги. После вскрытия бумагу осторожно
свертывают и помещают в бачок для вскрытых животных. Корнцангом со
смоченным спиртом горящим ватным тампоном обжигают вскрывочную доску и
края кювета. В кювет наливают 5%-ный раствор перекиси водорода с 1%
моющего средства.
При вскрытии кожных покровов описывают состояние подкожной
клетчатки, отмечая степень инъекции ее сосудов, возможные очаги
гиперемии, геморрагии или отека. Отмечают состояние кожи, клетчатки,
подлежащих мышц в месте введения культуры, характер изменений в них,
распространенность. Особое внимание обращают на развитие
геморрагических, гнойных и некротических изменений. Указывают размеры
(в мм) регионарных к месту введения культуры паховых лимфатических
узлов, их цвет, плотность, спаянность с окружающей клетчаткой и
состояние других лимфоузлов. После посевов кусочки с места введения
погружают в 10%-ный раствор нейтрального формалина, а лимфатические
узлы помещают на этикетку против соответствующих названий и после
подсушивания тоже опускают в фиксатор.
После этого вскрывают брюшную и грудную полости. Отмечают
полнокровие органов, состояние плевральных полостей, сальника,
висцеральной брюшины, кишечника, проводят посевы и описывают состояние
внутренних органов. Обращают внимание на развитие интерстициальной
реакции в легких (макроскопически она определяется в виде мелких
серовато-розовых очагов или тяжей, расположенных главным образом по
ходу сосудов и бронхов), а также наличие узелков, очагов некроза в
печени и селезенке, отмечая особо их количество, размеры (длина,
ширина, толщина) и внешний вид. Кусочки органов берут обязательно с
измененными участками. После исследования легких, сердца, селезенки и
печени и взятия из них кусочков размером 1 х 1 см тонкий кишечник
отодвигают в правую сторону (по отношению к свинке), берут почку,
надрезают ее с надпочечником и подвздошные лимфатические узлы,
отмечают их размеры, консистенцию, цвет и состояние окружающей
клетчатки. В последнюю очередь берут костный мозг вместе с кусочком
диафиза бедренной кости. Кость надо расщепить, т.к. она может
препятствовать проникновению фиксатора. Собранный материал оставляют
на 14 сут. в комнате для инфицированных животных, после чего его
выносят для гистологической обработки.
После посева ткани каждого органа тщательно обрабатывают
инструменты: пинцеты и ножницы вытирают ватным тампоном, смоченным
5%-ным раствором перекиси водорода, опускают в стакан со спиртом и
перед очередным использованием обжигают.
Результаты патолого-анатомического исследования записывают в
протокол.
Протокол вскрытия
от ------------ 200- г.
N животного ------------ вид животного ------------ пол --------------
Масса ------------------
Название культуры -----------------------------; доза ----------------
срок наблюдения -----------------------
Метод и место введения -----------------------------------------------
Дата заражения ---------- падежа ---------- умерщвления --------------
Упитанность ----------------------------------------------------------
Состояние подкожных сосудов ------------------------------------------
Место введения -------------------------------------------------------
Лимфатические узлы
Правый пахов. --------------------------------------------------------
Левый пахов. ---------------------------------------------------------
Правый подмыш. -------------------------------------------------------
Подвздошные ----------------------------------------------------------
Паратрахеальные ------------------------------------------------------
Бифуркационные <*> ---------------------------------------------------
Легкие ---------------------------------------------------------------
Селезенка ------------------------------------------------------------
Печень ---------------------------------------------------------------
Почки ----------------------------------------------------------------
Надпочечники ---------------------------------------------------------
Др. органы -----------------------------------------------------------
Костный мозг ---------------------------------------------------------
Вскрывал ---------------------------------------------------------
--------------------------------
<*> Берутся для гистологии при аэрогенном введении.
2.3. Во время вскрытия животных проводят и бактериологическое
исследование. Посевы органов и тканей проводят на заранее проверенный
на ростовые качества агар Хоттингера (рН 7,0 - 7,2, аминный азот 200 -
250 мг/%), используют питательную среду, обеспечивающую рост колоний
из 10 засеянных спор. На агаровые пластинки в чашках Петри засевают
место введения культуры, правый подвздошный лимфоузел, костный мозг
(одна чашка), лимфатические узлы правый (регионарный) и левый паховые,
правый и левый подмышечные (вторая чашка), печень и селезенку (третья
чашка); легкие и кровь (четвертая чашка); на агар с 3 - 5% крови
засевают легкие и кровь, на агар Эндо - печень и селезенку. Посевы
органов проводят методом многочисленных отпечатков, костный мозг берут
и сеют петлей из бедренной кости, посев крови проводят мазком -
отпечатком отсеченной верхушкой сердца. Среды с посевами органов на
агар Хоттингера помещают в термостат при температуре 28 град.С, на
агар с 3 - 5% крови и агар Эндо при 37 град. С на 2 сут. Просматривают
посевы через 1 сут., окончательно через 2 сут. Погибших животных
исследуют так же, как и умерщвленных. Кроме того, у погибших морских
свинок делают дополнительные посевы из тонкого, толстого кишечника и
мезентериальных лимфатических узлов на агар Эндо. Аналогичным образом
исследуют поголовье животных.
2.4. Определение "остаточной" вирулентности штамма для мышей.
"Остаточную" вирулентность новых вакцинных сибиреязвенных штаммов
проверяют на белых мышах или черных инбредных мышах (С57BL) массой 18
- 20 г. Испытуемый и эталонный вакцинный штаммы сибиреязвенного
микроба вводят подкожно белым или черным мышам в объеме 0,5 мл в дозе
8 7 6 5 4
10 , 10 , 10 , 10 , 10 живых спор. На каждую дозу берут по 6 животных.
За животными наблюдают в течение 10 сут. после введения культур.
Значительное число мышей (до 80%) может погибнуть в сроки 2 - 7 сут.
Воспалительный отек у мышей на месте введения культуры имеет
геморрагический характер. Образование отеков в ответ на инъекцию
культуры свидетельствует об остаточной вирулентности штамма и является
косвенным показателем ее иммуногенности. Павших мышей вскрывают,
делают посевы из внутренних органов, крови, мазки-отпечатки.
Определяют LD испытуемого и контрольного штаммов по методу Кербера.
50
3. Реактогенность испытуемого и эталонного сибиреязвенных
вакцинных штаммов оценивают на морских свинках по клиническим
наблюдениям за животными, которых в первые две недели не забивают.
Сроки наблюдения: 2, 4, 6, 8, 10 и 12-е сутки после введения культур.
У каждого животного (по 15 для каждой дозы) осматривают и пальпируют
место введения, измеряют ректальную температуру термометром,
определяют массу тела.
4. Оценку безвредности испытуемого штамма в опытах на кроликах
проводят по клиническим проявлениям поствакцинальной реакции, по
данным бактериологического и патоморфологического исследований
кроликов, забитых и вскрытых в разные сроки после однократного
подкожного введения испытуемой сибиреязвенной споровой культуры. В
опыт берут на эталонный и испытуемый штаммы по 25 кроликов,
предпочтительно породы "шиншилла" с массой тела 2 - 2,5 кг.
8
Культуры вводят в дозе 2,5 х 10 живых спор в объеме 1 мл под
кожу внешней поверхности бедра. По 2 кролика умерщвляют через 1, 3, 8,
15 и 21 сут. после вакцинации для бактериологического и
патогистологического изучения. Одновременно с посевами из тех же
органов готовят мазки-отпечатки, фиксируют их метиловым спиртом с 10%
формалина и окрашивают метиленовым синим по Леффлеру. 10 кроликов на
каждый штамм оставляют для клинических наблюдений и последующей
проверки иммуногенности штаммов для этого вида животных.
4.1. Определение реактогенности по клиническим наблюдениям.
У 10 кроликов, оставленных для проверки иммунитета, проводят на
3, 4, 6, 8 и 10-е сутки после введения культуры следующие клинические
наблюдения: осмотр места введения, взвешивание, измерение ректальной
температуры.
5. Определение безвредности штаммов для овец и коз.
Безвредность культур испытуемого и эталонного вакцинного
сибиреязвенных штаммов в опытах на овцах и козах оценивают по
клиническим проявлениям поствакцинальной реакции, по данным
бактериологического и патоморфологического исследования животных,
забитых и вскрытых в разные сроки после введения культуры.
В опыт берут на каждый штамм по 14 здоровых овец и 2 козы в
возрасте 1 - 1,5 года, не подвергавшихся ранее вакцинации против
сибирской язвы. На 10 овцах впоследствии оценивают иммуногенность
штамма. Испытуемую и контрольную культуры вводят овцам под кожу
6
внутренней поверхности бедра в дозе 2 х 10 спор в объеме 1 мл. После
введения культур проводят ежедневно термометрирование утром и вечером
и осмотр животных.
Для проведения патолого-анатомического и бактериологического
исследования умерщвляют по 1 козе на 5 и 7-е сутки, по 1 овце на 1, 3,
5 и 7-е сутки после введения культур на каждый штамм и срок.
Приложение 3
(обязательное)
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЛИЯНИЯ ИСПЫТУЕМОГО
ШТАММА НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ
1. Для изучения отсутствия повреждающего действия штаммов на
6
иммунную систему иммунизируют по 6 кроликов 10 спор в объеме 1 мл
испытуемого и эталонного вакцинного штамма, контрольных животных
0,9%-ным раствором хлорида натрия. У привитых и интактных животных
проводят следующие исследования в соответствии с РД 42-28-10-90.
Группы животных формируются методом случайной выборки
равнозначных по полу и массе.
2. Выделение лимфоцитов из крови кроликов.
Кровь у кроликов берут из ушной вены в объеме 2 мл в пробирку со
средой 199 или раствором Хенкса с (25 +/- 0,5) ед./мл гепарина в
соотношении 1 часть крови и 3 части среды. После перемешивания
разведенную кровь наливают в пробирку на водный раствор верографина
плотностью в (1,08 +/- 0,002) г/мл в соотношении 2:1, центрифугируют
(15 +/- 1) мин. при (450 +/- 25) g, затем пастеровской пипеткой
собирают образовавшиеся над слоем верографина беловатое кольцо
лимфоцитов. Количество Т- и В-лимфоцитов определяют одним из
приведенных ниже методов.
3. Определение пролиферативной активности лимфоцитов.
3.1. Реакция бласттрансформации лимфоцитов.
6
3.1.1. Спонтанная. Суспензию лимфоцитов (5 х 10 кл./мл) от
иммунных и контрольных животных на "среде культивирования" (среда
RPM1-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ
5
буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 5 х 10 -М 2-меркаптоэтанола, 100
ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) разливают в 96-луночную
пластиковую панель по 200 мкл в лунку (по три лунки на каждый образец)
и инкубируют в СО -инкубаторе (5% СО ) при температуре 37 град.С в
2 2
течение 72 ч. Затем добавляют 3Н-тимидин в объеме 25 - 50 мкл (1 - 2
мкКИ) в среде RPM1-1640 на лунку и инкубируют в тех же условиях еще 16
- 24 ч. По окончании инкубации клетки переносят на фильтры с помощью
прибора "Cell Harwestr", фильтры после сушки в термостате при
температуре 37 град.С помещают во флаконы, содержащие по 3 мл
сцинтилляционной жидкости (на 1 л толуола 0,2 г РОРОР и 5 г РРО).
3.1.2. Реакция бласттрансформации лимфоцитов под влиянием Т- и
В-клеточных митогенов служит для оценки функциональной активности
лимфоцитов. Специфическое распознавание митогена индуцирует в клетках
пролиферацию, т.е. деление клеток. Некоторые митогены селективно
стимулируют различные субпопуляции лимфоцитов. Например, КонА
стимулирует тимоциты, зрелые и незрелые Т-клетки, ФГА стимулирует
пролиферацию только зрелых Т-клеток. Такие митогены как
липополисахарид и бактериальный липопротеин, стимулируют пролиферацию
В-клеток. Благодаря этой селективности митогены могут использоваться
для характеристики функционального состояния различных субпопуляций
иммунокомпетентных клеток.
Постановку реакции осуществляют, как указано в п. 4.1, только в
опытные лунки добавляют Т- и В-клеточные митогены (не менее 3 лунок на
каждый митоген) в оптимальной стимулирующей дозе (КонА 1 - 15 мкг/мл,
ФГА 10 - 15 мкг/мл, ЛПС 15 - 100 мкг/мл). Контролем служат лунки со
взвесью лимфоцитов без добавления митогенов.
Результаты представляют в виде индексов стимуляции РБТЛ (ИС
РБТЛ), которые подсчитывают по формуле:
имп./мин. в культуре без митогена
ИС РБТЛ = ---------------------------------.
имп./мин. в культуре с митогеном
3.2. Определение пролиферативной активности лимфоцитов
цитофлуориметрическим методом.
Принцип метода основан на вторичной флуоресценции, которая
возникает в результате окрашивания ДНК лимфоцитов специфическим
флуорохромом и измерением ее содержания в лимфоцитах в различных фазах
клеточного деления.
3.2.1. Приготовление растворов флуорохромов.
Раствор А. Готовят 0,0025%-ный раствор этидиум бромида в 0,1 М
растворе трис-буфера рН 7,4, содержащем 0,6% хлорида натрия. Величина
рН 7,4 достигается добавлением 1 н раствора хлористого натрия.
Раствор Б. Готовят 0,005%-ный раствор митрамицина в 12,5%-ном
растворе этилового спирта, содержащем 7,5 мМ хлористого магния
6-водного. Величина рН 5,5 достигается добавлением 0,01 н раствора
хлорида натрия. Приготовленные растворы хранят при температуре (4 +/-
2) град.С не более месяца.
3.2.2. Фиксация лимфоцитов.
6
Полученные клеточные суспензии с концентрацией 10 лимфоцитов в 1
мл фиксируют путем добавления (70 +/- 1)град. этилового спирта
(использование другого фиксатора недопустимо), охлажденного до (4 +/-
2) град.С, из расчета 4,5 мл на 0,5 мл клеточной суспензии, выделенной
от вакцинированных испытуемым и контрольным штаммами животных. Смеси
перемешивают на вибрационной мешалке, выдерживают при температуре (4
+/- 2) град.С не менее 30 мин. Фиксированные клетки можно хранить при
температуре (4 +/- 2) град.С до 10 сут.
3.2.3. Окраска ДНК лимфоцитов флуорохромами.
Фиксированные этиловым спиртом лимфоциты (5 мл) осаждают путем
центрифугирования на центрифуге в течение (3 +/- 1) мин. при (1000 +/-
25) g, удаляют надосадочную жидкость. Затем к осадку добавляют 0,5 мл
раствора флуорохрома А, перемешивают на вибрационной мешалке 30 - 40 с
и выдерживают при температуре (22 +/- 2) град. С 10 мин. К смеси
лимфоцитов и флуорохрома А добавляют 0,5 мл флуорохрома Б, также
перемешивают и выдерживают при температуре (22 +/- 2) град.С 5 мин.
Пробирки необходимо закрывать парафиновыми бумажками. После окраски
суспензии лимфоцитов готовы к анализу на приборе и должны быть
использованы в течение 2 ч.
3.2.4. Подготовка окрашенных клеток к исследованию.
Суспензии окрашенных лимфоцитов в пробирках помещают в
ультразвуковую ванну и подвергают обработке 15 с для разрушения
агломератов, образовавшихся при центрифугировании, затем фильтруют
через фильтры с размером пор от 45 до 50 мкм.
Процентное соотношение лимфоцитов в фазах клеточного деления
регистрируют с помощью проточного цитофлуориметра PHY WE JCPP 22 или
другой марки.
Определение процентного соотношения пролиферирующих (фазы S и
G + М) и непролиферирующих (фазы G /G ) лимфоцитов проводят путем
2 0 1
расчета гистограмм, высвечивающихся в процессе эксперимента на экране
дисплея многоканального анализатора импульсов с помощью математической
модели. Методика расчетов изложена в методических рекомендациях
"Определение синтезирующих клеток ДНК и делящихся лимфоидных клеток
методом проточной цитофлуориметрии". Саратов, 1989.
Общее количество клеток, зарегистрированное анализатором,
определяется суммарным количеством клеток, набранных в каждом из
каналов:
Х
5
N = SUM N х ДЕЛЬТА х
общ. Х =Х Х
i 1 i
В свою очередь количество клеток в фазах клеточного цикла G /G ,
0
S и G + М определяется площадью, ограниченной соответствующей кривой.
1 2
Количество клеток в S-фазе определяется площадью трапеции и может
быть вычислено путем умножения основания этой трапеции на высоту:
N = N(Х ) (Х - Х ) = N(X ) Х.
s 3 4 2 3 2
----------------------------------------------------------------------
|N| |
| | /|\ G /G | |
| | / | \ 0 1 /|\ G + М |
| | / | \ / | \ 2 |
| | / | \ / | \ |
| |---------------------------------------------------------- |
| |Х |Х | Х Х |
| | 1 | 2 S | 4 5 |
| | |-------------------------| |
| | /| |\ |
| | / | | \ |
| |---------------------------------------------------------- |
| | G /G /|\ Х Х | Х Х |
| | 0 1 / | \ 2 3 /|\ 4 5 |
| | / |--\--------------------/-| \ G + М |
| | / /| \ | / |\ \ 6 |
| L--------------------------------------------------------- |
| Х Х Х Х Х |
| 1 2 3 4 5 |
----------------------------------------------------------------------
Рис. 1. Определение количества клеток в S-фазе.
Условные обозначения: N - количество сигналов (клеток); Х -
количество ДНК в относительных единицах (каналах), выражается через
интенсивность флуоресценции, а затем через амплитуду электрического
импульсного сигнала на выходе ФЭУ; соответственно амплитуде сигнала
ставят определенный канал анализатора импульсов, сигнал отсчитывается
анализатором; Х - номер произвольного канала до начала распределения
1
(выбирается одинаково для опытной и контрольной пробы); Х - номер
2
канала максимума пика G /G , определяется на гистограмме при помощи
0 1
светящейся метки (курсора) и корректируется, исходя из значения
коэффициента вариации гауссовского распределения G /G ; Х - номер
0 1
канала по середине S-фазы, Х - номер канала максимума пика G + М.
3 4 2
Х - Х Х
4 2 2
Х + ------- = Х + --.
2 2 2 2
Эти клетки содержат количество ДНК вдвое больше чем
диплоидные, поэтому Х - 2Х ; Х - номер произвольного канала
4 2 5
после распределения (выбирается одинаково в опыте и контроле).
Поскольку в различных точках S-фазы регистрируется неодинаковое
число клеток, необходимо заменить число N(Х ) на усредненную величину
3
по нескольким каналам (К) и выбрать К равным от 10 до 20, тогда:
Х Х +К/2
2 3
N = ----- SUM N х .
S К + 1 Х =Х -К/2 i
i 3
Поскольку распределения G /G и S перекрываются, число клеток
0 1
в фазе G /G может быть определено путем вычитания половины
0 1
площади, занятой фазой S, из общей площади до канала Х :
3
-- Х --
| 3 |
N = | SUM N х ДЕЛЬТА Х| - N .
G /G |Х =Х i | S/2
0 1 --i 1 --
Количество клеток в фазах G + М определяется так:
2
N = N - (N + N ).
G +М общ. S G /G
2 0 1
Процент клеток в фазах S, G + М и G /G определяют путем
2 0 1
деления соответствующих площадей на общую площадь гистограммы и
умножения на 100%:
N
G /G
0 1
N % = ------- х 100%.
G /G N
0 1 общ.
Все операции расчета сводятся к определению с помощью курсора
номера каналов Х , Х , Х , Х - К / 2, Х + К / 2, Х и вычислению
1 2 3 3 3 5
с помощью этого же курсора ограниченных ими площадей:
N
S
N % = ---- 100%.
S N
общ.
N
G +М
2
N % = ------ х 100% = 100% - N % - N .
G +М N S G /G
2 общ. 0 1
Х Х Х +К/2
5 3 3
SUM N хi ДЕЛЬТА Х SUM N хi ДЕЛЬТА Х SUM N х .
Х =Х Х =Х Х =Х -К/2 i
i 1 i 1 i 3
Для этого не требуется длительного суммирования значительного
числа клеток в каждом из каналов. Достаточно последовательно поместить
курсор в начальную и конечную точки гистограммы, ограничивающие
требуемый участок, и нажатием специальной кнопки, указанной в
инструкции к любому анализатору, определить площадь этого участка.
4. Определение количества Т- и В-лимфоцитов цитотоксическим
тестом.
4.1. Цитотоксический тест - это иммунологическая реакция,
позволяющая выявить антигены, расположенные на поверхности
жизнеспособных лимфоцитов. Основной принцип метода заключается в том,
что антитела, направленные против различных лимфоцитарных антигенов,
фиксируются специфически на клетках, содержащих эти антигены, и в
присутствии комплемента нарушают целостность клеточной мембраны.
Образование "отверстия" в мембране лимфоцитов позволяет прибавленному
к взвеси красителю (трипановый синий) проникать внутрь клетки и
окрашивать ее. Жизнеспособные с интактной мембраной клетки этим
красителем не окрашиваются.
4.1.1. Определение количества Т-лимфоцитов.
Коммерческую поликлональную сыворотку против Т-лимфоцитов
(институт им. Габричевского) разводят средой 199 до рабочей
концентрации, указанной на этикетке. В центрифужной пробирке или в
лунке панели смешать 60 мкл сыворотки, 20 мкл исследуемой взвеси
7
лимфоцитов (концентрация 10 кл./мл) и 20 мкл комплемента кролика в
разведении 1:3. В контрольные пробирки или лунки вносят 20 мкл взвеси
7
лимфоцитов (концентрация 10 кл./мл), 20 мкл взвеси комплемента и 60
мкл среды 199. Смеси перемешивают и инкубируют в термостате при
температуре (37 +/- 2) град.С 25 - 30 мин. В каждую пробирку или лунку
добавить по 1200 мкл 0,5%-ного раствора трипанового синего (500 мг
красителя растворить в 100 мл горячего 80 - 90 град.С 0,9%-ного
раствора хлорида натрия; перемешать 10 мин. на магнитной мешалке и
профильтровать через фильтровальную бумагу). Через 30 - 60 с поместить
взвесь из лунки в счетную камеру. Определяют число погибших клеток,
вычисляют их процент от общего количества клеток в препарате,
подсчитывают цитотоксический индекс (ЦТИ) по формуле:
% убитых клеток в опыте - % убитых клеток в контроле
ЦТИ = 100 х ----------------------------------------------------.
100 - % убитых клеток в контроле
ЦТИ указывает, какой процент клеток среди исследуемой взвеси
несет соответствующий антигенный маркер и, следовательно, принадлежит
к данной популяции.
4.1.2. Определение количества В-лимфоцитов.
Общее количество В-лимфоцитов определяют в цитотоксическом тесте
с коммерческой поликлональной специфической сывороткой против
В-лимфоцитов мыши. Постановка теста аналогична постановке
цитотоксического теста с антиТ-сывороткой.
5. Определение фагоцитарной активности макрофагов.
Фагоцитарная активность определяется процентом фагоцитирующих
клеток и количеством захваченных частиц на один фагоцит.
Внутрибрюшинно уколом по средней линии живота кролику вводят 50
мл среды 199 с гепарином (10 ед./мл). Брюшко массируют для смыва
клеток, не вынимая иглы, и экссудат отсасывают шприцем.
Клетки перитонеального экссудата (КПЭ) выделяют асептически от
кроликов опытной и контрольной групп и помещают в среду 199,
содержащую 5 МЕ гепарина в 1 мл, в пробирки, стоящие на льду. Не
используют экссудаты, содержащие эритроциты. После осаждения
центрифугированием при 150 g, в течение 10 мин. клетки ресуспендируют
в среде 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками
(по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина). Концентрацию клеток
6
доводят до 1 - 2 х 10 кл./мл и суспензию разливают по 2 мл в чашки
Петри диаметром 40 мм. Чашки помещают в термостат с содержанием 5 %
СО . Через 60 мин. суспензию сливают, смывают неприлипшие клетки
2
раствором Хенкса, добавляют 2 мл свежей среды 199 и оставляют на 18 -
24 ч в термостате с 5 - 7% СО при температуре 37 град.С. Клетки для
2
исследования фагоцитоза можно получить также на половинках покровных
стекол, помещенных в пробирки с 1,5 - 2 мл КПЭ.
Объектом фагоцитоза могут служить эритроциты барана и В.
anthracis СТИ-1. Суточную культуру В. anthracis СТИ-1, убитую
кипячением в 2%-ном растворе соды в течение 60 мин. с момента
закипания, отмывают не менее 3 раз 0,9%-ным раствором хлорида натрия,
ресуспендируют в нем и определяют концентрацию суспензии по стандарту
оптической мутности. Взвесь разводят средой 199 до концентрации,
9
соответствующей соотношению 10 - 20 х 10 кл./мл.
Эритроциты барана (ЭБ) трижды отмыть 0,9%-ным раствором хлорида
натрия, осаждая на центрифуге при 800 g в течение 5 мин. Готовят
0,5%-ную взвесь ЭБ на среде 199.
В чашки Петри, содержащие КПЭ, наливают 1 мл свежей среды 199 и
вносят по 1 мл взвеси ЭБ или соответствующих микроорганизмов. Через 30
- 60 мин. чашки споласкивают холодным раствором Хенкса, просушивают и
фиксируют 10 мин. метанолом. Окрашивают азур-эозином по Романовскому.
Просматривают не менее 200 клеток, подсчитывая фагоцитирующие
клетки и количество содержащихся в них ЭБ или микробов.
Результаты выражают процентом фагоцитирующих клеток (ПФ) и
фагоцитарным числом (ФЧ), которое определяется количеством частиц на
один фагоцит, абсолютным фагоцитарным показателем (АФП) - суммарным
показателем активности полиморфноядерных лейкоцитов, которое
рассчитывают по формуле:
АФП = количество фагоцитирующих клеток в 1 мкл крови ФЧ
Пример:
а) общее количество лейкоцитов в 1 мкл крови - 500, содержание
полиморфноядерных лейкоцитов - 60%, ПФ - 80%, ФЧ - 5.
500 х 60
Количество полиморфноядерных лейкоцитов = -------- = 300;
100
б) полиморфноядерных лейкоцитов 300 - 100%, фагоцитирующих (ПФ) -
80%, т.е. количество фагоцитирующих полиморфноядерных лейкоцитов:
300 х 80
-------- = 240;
100
в) АФП = 240 х 5= 1200.
6. Определение влияния вакцинного штамма на развитие клеточного и
гуморального иммунного ответа на гетерологичный антиген.
6.1. Определение влияния вакцинного штамма на развитие клеточного
иммунного ответа на гетерологичный антиген по реакции
гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана
(ЭБ).
Мышей разделить на три группы. Мышей первой группы иммунизировать
исследуемой вакциной, мыши второй группы - интактные (положительный
контроль), мыши третьей группы - интактные с введением только
разрешающей дозы ЭБ (контроль). Мышам 1-ой и 2-ой групп вводят ЭБ без
7
адьюванта Фрейнда в дозе 10 кл./ на мышь в объеме 0,1 мл в
межлопаточную область подкожно, параллельно внутрибрюшинно (возможны и
другие способы введения - - перорально, внутривенно, подкожно) ввести
8
исследуемую вакцину. Разрешающую дозу ЭБ (10 кл./на мышь) ввести на
5-й день в объеме 0,02 мл в подушечку задней лапы, в контрлатеральную
- 0,9%-ный раствор хлорида натрия всем трем группам животных.
Учет результатов - местную реакцию на введение разрешающей дозы
ЭБ оценивать через 18 - 20 часов путем определения веса опытной (Р ) и
о
контрольных (Р ) лапок. Интенсивность местной реакции определяют по
к
индексу (ИР), рассчитываемой по формуле:
Р - Р
о к
ИР = ------- 100%.
Р
к
Оценка результатов. Значение ИР в опытной (1-ой) группе выше двух
его значений в положительном контроле (2-я группа) следует оценивать
как выраженный иммуностимулирующий эффект вакцины. При значении ИР,
равного контролю (3-я группа) или менее положительного контроля, - как
выраженный иммуносупрессирующий эффект вакцинации.
6.2. Влияние вакцинного штамма на развитие гуморального ответа на
гетерологичный антиген.
Определение поликлональной активности В-лимфоцитов.
Для получения этого показателя определить число клеток,
продуцирующих антитела к эритроцитам барана (АОК). Необходимо
подчеркнуть, что иммунизация мышей эритроцитами барана в этих опытах
не производится, а определяется количество спонтанных "фоновых" АОК в
селезенке. Увеличение их количества после введения вакцины является
показателем поликлональной активации В-лимфоцитов. Число АОК в
селезенке определяют методом локального гемолиза в геле.
6.2.1. Выявление антителообразующих клеток методом локального
гемолиза в геле.
Эритроциты барана отмыть 0,9%-ным раствором хлорида натрия путем
центрифугирования 7 мин. при 400 g 3 раза, к 0,9%-ному раствору
7
агарозы <*> добавить из расчета 2 - 3 х 10 эритроцитов барана в 1 мл.
Полученную рабочую смесь разлить по 2,5 мл в пробирки, помещенные в
водяную баню при температуре 43 - 44 град.С. В каждую пробирку
добавить по 0,2 мл взвеси исследуемых клеток селезенки (концентрация
7
10 кл./мл), перемешать и вылить на чашку Петри, равномерно распределяя
ее по дну. Через 5 мин. чашки поместить в термостат при температуре
(37 +/- 2) град.С на 1 час. Затем в каждую чашку вылить по 2,5 мл
разведенного в 5 раз средой 199 комплемента морской свинки сухого или
разведенного в 10 раз свежезамороженного комплемента. После 30 мин.
инкубации подсчитать число зон гемолиза на каждой чашке.
--------------------------------
<*> Приготовление 0,9%-ного раствора агарозы: навеску сухой
агарозы (см. табл.) смешать с дистиллированной водой, смесь кипятить
на водяной бане до полного растворения агарозы; перенести емкость с
раствором в водяную баню с температурой 43 - 44 град.С, добавить
10-кратный раствор Хенкса, рН раствора довести до 7,2 1%-ным раствором
КН РО или NaОН (по цвету индикатора, присутствующего в растворе
2 4
Хенкса).
Учет результатов. Рассчитать число антителообразующих клеток на
селезенку и на 1 млн. ядросодержащих клеток (ЯСК) селезенки. Пример
результатов опыта этого типа представлен в таблице:
------------------------------------------------------------------
| N |Вакцинация| Срок после | Число АОК | Р | Индекс |
|группы| | вакцинации |на селезенку| |поликлональной|
| | | (сут.) | | | стимуляции |
|------|----------|------------|------------|-----|--------------|
|1 |(контр.) |- |120 +/- 24 |- |1 |
|------|----------|------------|------------|-----|--------------|
|2 |+ |3 |198 +/- 39 |0,05 |1,65 |
|------|----------|------------|------------|-----|--------------|
|3 |+ |7 |246 +/- 36 |0,05 |2,05 |
|------|----------|------------|------------|-----|--------------|
|4 |+ |10 |154 +/- 40 |0,05 |1,28 |
|------|----------|------------|------------|-----|--------------|
|5 |+ |15 |105 +/- 27 |0,05 |0,87 |
|------|----------|------------|------------|-----|--------------|
|6 |+ |20 |116 +/- 17 |0,05 |0,96 |
------------------------------------------------------------------
Оценка результатов.
В этом опыте обнаружено на 3 - 7 день после прививки выраженное
стимулирующее действие вакцины на функциональное состояние
В-лимфоцитов.
-----------------------------------------------------------------------
| Кол-во чашек |Масса агарозы|Объем дистиллированной|Объем 10-кратного|
| | |воды | раствора Хенкса |
|--------------|-------------|----------------------|-----------------|
|10 |225 мг |22,5 мл |2,5 мл |
-----------------------------------------------------------------------
6.2.2. Определение функциональной активности регуляторных
Т-лимфоцитов.
Метод оценки активности Т-супрессоров и Т-хелперов основан на
исследовании их способности соответственно угнетать или стимулировать
in vitro зрелые клетки, продуцирующие антитела к эритроцитам барана.
Тест-объектом служат клетки селезенки от 3 мышей,
8
иммунизированных внутривенно эритроцитами барана (2 х 10 клеток-на
мышь). Для иммунизации необходимо использовать сингенных мышей,
иммунизированных испытуемым и контрольным штаммом.
Иммунизированных ЭБ мышей убить хлороформом, из их селезенок
7
приготовить общую клеточную взвесь (концентрация 10 кл./мл) по
описанному выше методу (п. 2.2). Клетки отмыть 1 раз средой 199 путем
центрифугирования в течение 7 мин. при 400 g. Довести концентрацию до
7
10 кл./мл, 0,2 мл этой взвеси смешать в центрифужной пробирке с 0,2 мл
взвеси спленоцитов той же концентрации от иммунизированных испытуемой
вакциной животных. В контрольной пробирке к 0,2 мл первой взвеси
добавить 0,2 мл среды 199. Все пробирки инкубировать в течение 30 мин.
при температуре (37 +/- 2) град.С, затем их центрифугировать 7 мин.
при 400 g. Надосадок слить, в каждую пробирку добавить по 2,5 мл
рабочей смеси агарозы с эритроцитами барана (см. п. 2.8). Содержимое
пробирки перемешать осторожным встряхиванием и немедленно вылить в
чашку Петри, равномерно распределяя смесь по дну. Чашку оставить при
температуре 18 - 20 град.С на 5 мин., затем инкубировать 90 мин. при
температуре (37 +/- 2) град.С. Далее в каждую чашку налить по 2,5 мл
разведенного комплемента морской свинки (сухой комплемент разводят
средой 199 в 5 раз, свежезамороженный - в 10 раз) и продолжить
инкубацию при температуре (37 +/- 2) град.С еще в течение 30 мин.,
после чего в проходящем электрическом свете подсчитать число зон
гемолиза в каждой чашке.
Учет результатов.
Подсчитать индекс эффективности (ИЭ) по формуле:
число АОК в опыте
ИЭ = --------------------.
число АОК в контроле
Примеры результатов опытов этого типа представлены в таблице:
------------------------------------------------------------------
|N опыта| Число АОК на чашку | Р |Индекс эффективности|
| |---------------------------| | |
| | В контроле | В опыте | | |
|-------|-------------|-------------|-------|--------------------|
|1 |148 +/- 36 |81 +/- 30 |< 0,05 |0,55 |
|-------|-------------|-------------|-------|--------------------|
|2 |132 +/- 40 |186 +/- 24 |< 0,05 |1,41 |
------------------------------------------------------------------
Оценка результатов.
В эксперименте N 1 число АОК на чашку в опыте было меньше чем в
контроле; индекс эффективности составил 0,55, что указывает на высокую
активность Т-супрессоров в исследуемой селезенке. В эксперименте N 2
число АОК в опыте было больше чем в контроле; индекс эффективности
составил 1,41. Это указывает на повышенную активность Т-хелперов в
исследуемой селезенке.
6.2.3. Исследование влияния испытуемого штамма на
иммунореактивность - развитие гуморального иммунного ответа на
гетерологичный антиген.
Определение АОК к эритроцитам барана (ЭБ) гетерологичному
Т-зависимому антигену.
Для проведения этих экспериментов мышей разделить на 2 группы по
10 штук в каждой. Мыши 1-ой группы иммунизированы изучаемым вакцинным
препаратом, мыши 2-ой группы интактные (контрольные). Мышам обеих
7
групп ввести внутривенно по 2 х 10 эритроцитов барана. Иммунный ответ
на гетерологичный антиген оценивать через 4 суток после введения
эритроцитов. Методика определения числа АОК - см. п. 2.8.
Учет результатов.
Пример анализа результатов опыта приведен в таблице:
------------------------------------------------------------------
| Группы мышей | Число АОК на селезенку к эритроцитам барана |
|----------------|-----------------------------------------------|
|1 |1568026 +/- 70 <*> |
|----------------|-----------------------------------------------|
|2 |24400 +/- 4390 |
|----------------------------------------------------------------|
| <*> Отличие значимо (р < 0,05). |
------------------------------------------------------------------
Оценка результатов.
Приведенные в таблице результаты показывают, что у
вакцинированных животных иммунный ответ на гетерологичный антиген
угнетен. Это является признаком временного иммунодефицита,
обусловленного увеличением количества и функциональной активности
Т-супрессоров и (или) снижением количества и функциональной активности
Т-хелперов.
Приложение 4
(обязательное)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ СВОЙСТВ ВАКЦИННОГО ШТАММА
СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА
1. Испытуемую и эталонную культуры засевают в 3 пробирки под
резиновыми пробками со средой ПКИ. Через 16 - 18 ч инкубации при
температуре 37 град.С делают пересев на 3 пробирки с такой же средой.
Таких пересевов делают не менее 20 раз. При каждом пассаже делают
мазки из культуры, фиксируют их метиловым спиртом с 10% формалина и
окрашивают метиленовым синим по Леффлеру в течение часа. При
микроскопии не менее 5 мазков из культур каждого пассажа не должны
обнаруживаться даже единичные капсульные бациллы. После проведения 20
пассажей, при отсутствии капсулообразования в этих условиях,
пассированную культуру изучают более детально. Ее высевают на чашку
Петри со средой Шефера или 1%-ный бикарбонатный агар и инкубируют 48 ч
при температуре 37 град.С в атмосфере с повышенным содержанием СО (10
2
- 50%). После 48-часовой инкубации просматривают характер выросших
колоний (см. п. 4.7.2). В мазках из колоний не должно быть даже
единичных капсульных бацилл. После 20-кратного пассирования культур на
среде ГКИ проверяют их остаточную вирулентность для белых и черных
мышей в соответствии с Прилож. 2, она должна соответствовать п. 5.2.
2. Испытуемую культуру пассируют 10 раз на белых мышах массой 16
- 18 г с предварительным введением кортизона для повышения
чувствительности животных к испытуемой культуре. Для этого пяти белым
мышам вводят подкожно кортизон в дозе по 5 мг, а через 3 ч -
внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл испытуемую культуру с концентрацией
бактериальной взвеси 10 единиц по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.
Тарасевича. Погибших или умерщвленных через 2 сут. мышей вскрывают,
делают посевы из селезенки, печени и крови. Посевы инкубируют при
температуре 37 град.С одни сутки. Из выросших, типичных для штамма
колоний готовят взвесь в 0,9%-ном растворе хлорида натрия, которую
вводят новой группе белых мышей. Таких пассажей на мышах проводят не
менее 10. При каждом пассаже контролируют отсутствие в мазках из
органов даже единичных капсульных бацилл. После завершения 10 пассажей
на мышах, подвергнутых действию кортизона, пассированную культуру
испытуемого штамма проверяют высевом в среду ГКИ (отсутствие
капсулообразования), на остаточную вирулентность для мышей (п. 5.2) и
на безвредность для морских свинок (п. 5.3 - 5.5) и кроликов (п. 5.6).
3. Для пассажа испытуемого штамма на морских свинках в опыт берут
молодых животных массой 150 - 200 г; 2 - 3 животным испытуемую
8
культуру вводят подкожно в дозе 10 микробов в 1 мл (10 единиц по
стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Через 2 сут. морских
свинок умерщвляют, делают посевы из места введения и ткани селезенки
на агар Хоттингера (аминный азот 200 - 250 мг/%). Выросшую культуру
суспендируют в 0,9%-ном растворе хлористого натрия и далее ведут
пассажи на морских свинках аналогично пассажам на белых мышах, но без
применения кортизона. При вакцинном штамме пассажи часто прерываются
из-за того, что культура от забитых животных не выделяется. В случае
невыделения культуры испытуемого штамма после 3-кратного повторения
предыдущего пассажа опыты прекращают и считают, что штамм стабилен, в
организме морских свинок не реверсирует в вирулентное состояние. В
случае завершения пассажей культуру 10-го пассажа проверяют на
отсутствие капсулообразования на среде ГКИ (п. 6.1), на остаточную
вирулентность для мышей (п. 3.3) и безвредность для морских свинок и
кроликов (п. 3.4 и п. 3.5).
Приложение 5
(обязательное)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИННОГО
ШТАММА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА
1. Определение индекса иммунитета (ИИ) для морских свинок.
Количественная оценка иммуногенности испытуемого штамма в опытах
на морских свинках проводится в сравнении с эталонным вакцинным
штаммом СТИ-1 по индексу иммунитета.
Индекс иммунитета представляет собой частное от деления величины
LD заражающей культуры для вакцинированных свинок на величину
50
LD такой же культуры для контрольных свинок.
50
Для определения индекса иммунитета по 60 морских свинок
вакцинируют однократно подкожно испытуемой и эталонной культурами
7
в дозе 5 х 10 спор однократно подкожно в объеме 1 мл. Через 21
день вакцинированных морских свинок заражают подкожно введением
тест-заражающей культуры сибиреязвенного микроба 71 / 12 в дозах
9 8 7 6
10 , 10 , 10 , 10 спор и вирулентным штаммом сибиреязвенного
2 3 4
микроба в дозах 10, 10 , 10 , 10 по 5 - 6 вакцинированных морских
свинок на каждую заражающую дозу каждого штамма. Одновременно
равноценные группы свинок, не подвергшихся вакцинации, заражают
5 4 3
теми же заражающими штаммами. Штамм 71/12 в дозах 10 , 10 , 10 и
2
10 спор, также по 5 - 6 животных на дозу. Наблюдения за зараженными
животными ведут 10 дней. Затем определяют величины LD заражающей
50
культуры для группы вакцинированных и для группы контрольных морских
свинок раздельно.
2. В опытах на кроликах иммуногенность испытуемого
сибиреязвенного штамма оценивают путем заражения вакцинированных
животных только высоковирулентным штаммом возбудителя сибирской язвы.
По 10 кроликов массой 2 - 2,5 кг, породы "шиншилла", иммунизируют
7
подкожно по 5 х 10 спор в объеме 1 мл испытуемого и эталонного
вакцинного штаммов. Спустя 3 недели кроликов заражают. Заражающая доза
для вакцинированных кроликов и для 3 контрольных невакцинированных
должна составлять 50 LD тест-заражающей вирулентной споровой
50
культуры. Вирулентную культуру титруют непосредственно перед
заражением на той же партии животных. За зараженными кроликами
наблюдают 10 дней.
3. Количественную оценку иммуногенности испытуемого штамма в
опытах на кроликах проводят путем определения величины
среднеэффективной дозы - ЕД . 4 группы кроликов, по 4 животных в
50
каждой группе, вакцинируют подкожно споровой культурой испытуемого
8 7 6
и контрольного штаммов дозами 2,5 х 10 ; 2,5 х 10 ; 2,5 х 10 ;
5
2,5 х 10 спор. Через 3 недели после вакцинации всех кроликов,
включая 3 контрольных кроликов, заражают высоковирулентной споровой
культурой возбудителя сибирской язвы подкожно, в дозе 10 смертельных
доз (Dcl). Результаты опыта учитывают через 10 дней после заражения.
По выживаемости вакцинированных кроликов вычисляют величины
ЕД испытуемого штамма и контрольного вакцинного штаммов СТИ-1.
50
Опыт учитывают при условии гибели всех контрольных кроликов в
сроки до 4 суток после заражения.
4. Для оценки иммуногенности испытуемого штамма в опытах на овцах
берут животных в возрасте 1 - 1,5 года из стада, не подвергавшегося
7
вакцинации против сибирской язвы. Не менее чем 10 овцам вводят под
кожу испытуемый штамм в дозе 1 - 1,5 х 10 спор в объеме 1 мл. Для
этого опыта могут быть использованы овцы из опыта по оценке
безвредности вакцинного штамма. Такую же группу овец иммунизируют
эталонным вакцинным штаммом СТИ в тех же дозах.
Через 20 - 30 дней вакцинированных овец и трех контрольных
непривитых заражают внутрикожно 10 Dcl высоковирулентной
сибиреязвенной споровой культуры в объеме 0,2 мл. Смертельную дозу
споровой сибиреязвенной культуры определяют непосредственно перед
опытом титрованием споровой взвеси на 6 - 9 овцах из того же
невакцинированного стада, что и подопытные животные. Наблюдение за
зараженными животными ведут 10 дней. После заражения все контрольные,
невакцинированные овцы должны погибнуть от сибирской язвы.
Специфический характер гибели невакцинированных и вакцинированных овец
должен быть подтвержден положительной бактериоскопией мазков и
положительным результатом посева крови, взятой из надреза уха трупа.Страницы: 1 2 |