4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ
ПОКАЗАТЕЛЕЙ КАЧЕСТВА ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ, ВОДЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ
И ПОДЗЕМНЫХ ИСТОЧНИКОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МЕТОДИКА
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ
18 января 1999 г.
N 1100/83-99-23
(Д)
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Департамента
госсанэпиднадзора
Минздрава России
А.А.МОНИСОВ
18 января 1999 года
N 1100/83-99-23
Дата введения:
с момента утверждения
Методические указания разработаны творческим коллективом в
составе: Военная академия химической защиты Ишутин В.А., Стехин А.А.,
Яковлева Г.В., Корякин Ю.Н., ВЦМК "Защита" Зубарев А.Ф., НИИ экологии
человека и гигиены окружающей среды имени А.Н. Сысина РАМН Доскина
Т.В., Рахманин Ю.А., Недачин А.Е., Михайлова Р.И., Федеральный центр
госсанэпиднадзора Минздрава России Стреляева Н.Е., Кривопалова Н.С.,
Подунова Л.Г., Скачков В.Б.
Утверждены и введены в действие.
Введены впервые.
1. Область применения
Настоящие методические рекомендации являются первым опытом
методического обеспечения экспресс-контроля качества питьевой воды и
воды источников хозяйственно-питьевого водоснабжения по
микробиологическим показателям, введенным:
СанПиНом "Требования к качеству воды централизованных систем
питьевого водоснабжения. Контроль качества" 2.1.4.559;
ГОСТом 2761 "Контроль качества воды поверхностных и подземных
водоисточников", и предназначены для микробиологов городских,
районных, областных, краевых и республиканских центров
госсанэпиднадзора и специалистов ведомственных лабораторий,
осуществляющих контроль качества воды. Методики регламентируют
проведение микробиологического экспресс-контроля загрязнения воды.
Экспресс-метод определения общего микробного
числа хемилюминесцентным методом
Настоящие методические рекомендации устанавливают методику
хемилюминесцентного количественного определения в 1 куб. см воды
централизованного хозяйственного питьевого водоснабжения и в
поверхностных водоисточниках клеток мезофильных и мезотрофных бактерий
в вегетативной форме.
1. Принцип методики
Количественное определение клеток бактерий в вегетативной форме в
воде основано на их способности инициировать хемилюминесценцию
люминола в щелочной среде, интенсивность которой пропорциональна числу
клеток, находящихся в анализируемой пробе.
2. Чувствительность и сущность метода
Бактериальные клетки в вегетативной форме могут быть обнаружены
хемилюминесцентным методом в количестве 2 КОЕ/куб. см. Определению не
мешают продукты метаболизма бактериальных клеток, их отмершие
фрагменты, катионы металлов с переменной валентностью в концентрациях
до одного ПДК. Определение проводят на хемилюминометре ЛИК,
концентрирование клеток на мембранный фильтр не проводят.
3. Средства измерений, материалы и реактивы
----------------------------------------------------------------------
| 3.1. Средства измерений | |
| Хемилюминометр ЛИК | ТУ 000.000.АЖП |
|-----------------------------------------------|--------------------|
| 3.2. Вспомогательные устройства | |
|-----------------------------------------------|--------------------|
| Дозатор пипеточный | ТУ 64-1-3329 |
|-----------------------------------------------|--------------------|
| Пробоотборник для отбора проб воды | |
|-----------------------------------------------|--------------------|
| Пинцет | |
|-----------------------------------------------|--------------------|
| Стерильный флакон с притертой пробкой | |
| вместимостью 0,5 куб. дм | |
|-----------------------------------------------|--------------------|
| 3.3. Материалы | |
|-----------------------------------------------|--------------------|
| Бумага фильтровальная | ГОСТ 12026 |
|-----------------------------------------------|--------------------|
| Мембранный фильтр "Владисарт" | |
| для ОМЧ SM-13806, поры 0,45 мкм | БГКП-SM-13906 |
|-----------------------------------------------|--------------------|
| 3.4. Реактивы | |
|-----------------------------------------------|--------------------|
| Натрий серноватистокислый | СТ СЭВ 223 |
|-----------------------------------------------|--------------------|
| Реактив на основе люминола | |
| 3%-ный водный раствор перекиси водорода | |
|-----------------------------------------------|--------------------|
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
|-----------------------------------------------|--------------------|
| Спирт этиловый реактификованный | ГОСТ 5962 |
----------------------------------------------------------------------
4. Требования по безопасности
4.1. При работе с реактивом и спиртом соблюдаются требования
безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и
легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005.
4.2. При работе на приборе ЛИК соблюдают правила
электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по
эксплуатации прибора.
5. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию
лаборант с опытом работы на приборе ЛИК и прошедшие обучение в ФЦ ГСЭН
МЗ РФ.
6. Условия проведения измерений
Измерения проводятся при атмосферном давлении 730 - 760 мм рт.
ст., температуре окружающего воздуха (20 +/- 15 град.С) в лабораторных или
полевых условиях при отсутствии атмосферных осадков.
7. Подготовка к выполнению измерений
7.1. Прибор ЛИК готовят к работе в соответствии с инструкцией по
эксплуатации.
7.2. Приготовление рабочего реактива.
В чистую пробирку пипеточным дозатором наливают 0,2 куб. см
3%-ной водной перекиси водорода и прибавляют к ней 6,0 +/- 0,1 куб. см
реактива.
Приготовленный рабочий реактив годен для анализа в течение 24
часов с момента его приготовления.
7.3. Приготовление исходных разведений чистых культур E.coli или
Вас. subtilis (Вас. cereus) для построения градуировочного графика в
диапазоне концентраций клеток от 10 до 100 КОЕ/куб. см.
С косячка или из чашки Петри с помощью петли (крючка) переносят
колонию чистой культуры в стерильную пробирку с соблюдением мер
стерильности и добавляют в нее стерильный физраствор объемом 10,0 куб.
см. Содержимое тщательно перемешивают до исчезновения видимых сгустков
и фильтруют через 3-слойный марлевый стерильный фильтр.
После фильтрации исходного разведения с помощью стандартов
мутности или камеры Горяева-Тома определяют исходную концентрацию
бактериальных клеток.
Готовят серию разведений с соблюдением мер стерильности следующим
образом. От исходного разведения отбирают 2,0 +/- 0,1 куб. см,
помещают в стерильную пробирку и добавляют в нее 2,0 +/- 0,1 куб. см
стерильного физраствора. Пробирку закрывают пробкой и содержимое
перемешивают встряхиванием в течение 3-х минут. Аналогичным образом
готовят все остальные разведения до конечной концентрации, равной 10
+/- 5 КОЕ/куб. см.
7.4. Построение градуировочного графика.
7.4.1. Определение фона (сигнала) от стерильного раствора.
Передвигают крышку прибора ЛИК до упора вперед, снимают
крышку-дозатор, наливают в кювету из стекла 0,3 куб. см рабочего
реактива, устанавливают кювету с реактивом в реакционную камеру
прибора и закрывают ее крышкой-дозатором.
В полость крышки-дозатора наливают 0,1 куб. см стерильного
физраствора, крышку прибора передвигают до упора назад и нажимают на
нее рукой.
С индикатора прибора снимают показания и записывают их в рабочий
блокнот. Операцию повторяют 3 раза, вычисляют среднее значение и
записывают полученный результат в рабочий журнал.
7.4.2. Анализ разведения бактериальной культуры.
Анализ приготовленного разведения бактериальной культуры начинают
с разведения, содержащего 10 +/- 5 КОЕ/куб. см, и проводят в той же
последовательности, как указано в п. 7.4.1.
Внимание!!!
Реактив и разведения бактериальной культуры отбирать разными
наконечниками дозатора пипеточного во избежание загрязнения реактива.
По окончании анализа разведения культуры из вычисленных средних
значений показаний прибора вычитают показания фона от физраствора и
получают истинные значения хемилюминесцентного анализа.
7.4.3. Построение градуировочного графика.
Градуировочный график строят на миллимитровой бумаге в
координатах: величина измеренного сигнала - концентрация клеток
бактерий в анализируемом разведении. В последующем график уточняют
после поверки (ремонта) прибора или по усмотрению (желанию)
специалиста-микробиолога.
8. Определение общего микробного числа в пробах воды
8.1. Отбор проб воды.
8.1.1. Вода из сети централизованного водоснабжения отбирается во
флаконы объемом 0,5 куб. дм.
Для этого во флаконы вносят по 10 г серноватистокислого натрия и
стерилизуют их установленным образом. После стерилизации в них
отбирают пробу хлорированной воды объемом 490 +/- 5 куб. см.
8.1.2. Вода из водоисточников децентрализованного водоснабжения.
Пробы воды отбирают в стерильные флаконы объемом 0,5 куб. дм
батометром с соблюдением мер стерильности.
8.2. Определение фона (сигнала) воды.
Флакон с пробой воды вскрывают, отбирают стерильной пипеткой 5
куб. см воды, фильтруют ее через 2-слойный бумажный фильтр и
определяют фон (сигнал), как указано в п. 7.4.1.
8.3. Определение числа клеток бактерий в анализируемой пробе в
вегетативной форме.
Содержимое флакона тщательно перемешивают встряхиванием в течение
3-х минут и анализируют на приборе, как указано в п. 7.4.1. Из
полученной средней величины сигнала вычитают величину фона воды,
полученную по п. 8.2, и по градуировочному графику определяют искомую
концентрацию бактерий в воде.
8.4. Определение бактерий в воде в споровой форме.
8.4.1. Приготовление жидкой питательной среды.
На аналитических весах взвешивают 5 г пептона, 5 г натрия
хлористого, 5 г глюкозы и растворяют их в 1 куб. дм стерильной
дистиллированной воды.
5
Полученную смесь стерилизуют при 112 град.С (0,49 х 10 Па) 12
минут.
8.4.2. Отобранную пробу воды тщательно перемешивают в течение 3
минут встряхиванием, отбирают от нее 8 +/- 0,1 куб. см в стерильную
чистую пробирку, куда добавляют 2 +/- 0,1 куб. см приготовленной
жидкой питательной среды. Содержимое флакона тщательно перемешивают
встряхиванием в течение 1 минуты и помещают на 4 часа в термостат при
температуре (37 +/- 0,5 град.С).
8.4. По истечении 4 часов термостатирования пробы содержимое
пробирки перемешивают встряхиванием в течение 1 минуты и анализируют
на приборе, как указано в п. 7.4.1. Из полученного среднего значения
показания прибора вычитают величину показания (сигнала), полученную по
п. 8.3, и по градуировочному графику определяют концентрацию бактерий
в споровой форме.
8.5. Общее содержание клеток мезофильных и мезотрофных бактерий в
анализируемой пробе будет равно сумме клеток, полученных по п. 8.3 и
п. 8.4.
Экспресс-метод определения колифагов
хемилюминесцентным методом
Настоящие методические указания устанавливают методику
определения колифагов в 100 куб. см воды в системах централизованного
и децентрализованного хозяйственно-питьевого водоснабжения.
1. Принцип метода
Определение колифагов в воде основано на контроле изменения
интенсивности хемилюминесценции люминола в щелочной среде,
инициируемой лизисными и нелизисными клетками E.coli.
2. Чувствительность и сущность метода определения
Чувствительность метода составляет 2 КОЕ/куб. см. Сущность метода
состоит в сравнении изменения интенсивности хемилюминесценции
люминола, инициируемой в щелочной среде клетками E.coli, до и после
контаминации их с колифагами в течение определенного времени.
Определению не мешают продукты метаболизма, отмершие клетки и
питательная среда.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства,
материалы и реактивы
-----------------------------------------------------------------------
| 3.1. Средства измерений | |
| Хемилюминометр ЛИК | ТУ 000.000.АЖП |
|-------------------------------------------------|-------------------|
| 3.2. Вспомогательные устройства | |
|-------------------------------------------------|-------------------|
| Дозатор пипеточный | ТУ 64-1-33-29 |
|-------------------------------------------------|-------------------|
| Батометр | |
|-------------------------------------------------|-------------------|
| Пробирки микробиологические | |
|-------------------------------------------------|-------------------|
| Термостат электрический с автоматическим | |
| терморегулятором до 50 град.С | |
| Флакон объемом 150 куб. см | |
|-------------------------------------------------|-------------------|
| 3.3. Материалы | |
|-------------------------------------------------|-------------------|
| Бумага фильтровальная | ГОСТ 12026 |
|-------------------------------------------------|-------------------|
| 3.4. Реактивы | |
|-------------------------------------------------|-------------------|
| Реактив на основе люминола | |
| 3% водный раствор перекиси водорода | |
|-------------------------------------------------|-------------------|
| Спирт этиловый ректификованный, | |
| мясопептонный бульон | ГОСТ 5962 |
-----------------------------------------------------------------------
4. Требования по безопасности
4.1. При работе с реактивами и этиловым спиртом соблюдаются
правила безопасности по ГОСТ 1.005.
4.2. При выполнении измерений с использованием прибора ЛИК
соблюдают правила по ГОСТ 12.1.019 и инструкции по эксплуатации
прибора.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию
лаборант и опыт работы на приборе ЛИК и прошедшие обучение в ФЦ ГСЭН
МЗ РФ.
6. Условия измерения
Измерения проводят при атмосферном давлении 730 - 760 мм рт. ст.,
температуре окружающей среды (20 +/- 15) град.С в лабораторных и полевых
условиях.
7. Подготовка и выполнение определений
7.1. Прибор ЛИК готовят к работе в соответствии с инструкцией по
эксплуатации.
7.2. Приготовление рабочего реактива.
В чистую пробирку дозатором пипеточным наливают 0,3 куб. см 3%
водной перекиси водорода и прибавляют к ней 6,0 +/- 0,1 куб. см
реактива.
Рабочий реактив годен для анализа в течение 24 часов с момента
его приготовления.
7.3. Подготовка проб к анализу.
Отобранную для анализа пробу воды разливают в три стерильных
флакона по 100 куб. см в каждой и добавляют в них по 0,5 куб. см
9
суспензии E.coli концентрации 10 (стандарт мутности 10 ед.), 1 куб.см
концентрированного мясопептонного бульона. Содержимое перемешивают
встряхиванием в течение 1 минуты и закрывают крышками.
Параллельно в стерильный флакон наливают 100 куб. см стерильной
дистиллированной воды (водопроводная вода не используется!!!),
9
добавляют в нее 0,5 куб.см суспензии E.coli концентрацией 10 КОЕ/куб.
см, 0,1 куб. см мясопептонного бульона и содержимое перемешивают
встряхиванием в течение 1 минуты. Флакон закрывают крышкой и его
содержимое используют для контроля (контрольная проба).
8. Определение колифагов в пробе воды
Приготовленные контрольную пробу и пробы анализируемой воды
поочередно анализируют на приборе. Для этого крышку прибора
передвигают до упора вперед, снимают крышку-дозатор, в кювету из
стекла наливают 0,3 куб. см рабочего реактива и устанавливают его в
реакционную камеру.
Камеру закрывают крышкой дозатором и в ее полость, сменив
наконечник пипеточного дозатора на чистый, наливают 0,1 куб. см смеси
контрольной пробы. Передвигают крышку прибора до упора назад, нажимают
на нее рукой и снимают показания прибора. Анализ повторяют три раза,
вычисляют среднее значение и записывают в блокнот.
После анализа контрольную пробу и пробы анализируемой воды
термостатируют в течение 2 час. 15 мин. при температуре 37 +/- 1
град.С и проводят анализ проб в той же последовательности: сначала
контрольную пробу, а затем пробы анализируемой воды, вычисляют средние
значения и сравнивают их между собой. Если показания хотя бы одной из
анализируемых проб воды больше показаний контрольной пробы, то в
анализируемой воде присутствуют колифаги.
Экспресс-метод определения лактозоположительных
кишечных палочек в воде поверхностных водоисточников
хемилюминесцентным методом
Настоящие методические рекомендации устанавливают методику
хемилюминесцентного определения в 1 куб. дм воды поверхностных
водоисточников лактозоположительных кишечных палочек.
1. Принцип метода
Определение лактозоположительных кишечных палочек основано на их
способности инициировать хемилюминесценцию люминола в щелочной среде,
величина интенсивности которой пропорциональна числу клеток в
анализируемой пробе.
2. Чувствительность и сущность метода определения
Определение лактозоположительных кишечных палочек выполняют на
хемилюминометре ЛИК.
Нижний предел чувствительности измерения составляет 2 КОЕ/куб.
см. Определению не мешают продукты метаболизма, отмершие клетки и
питательная среда.
Концентрирование кишечных палочек из воды осуществляют на
мембранный фильтр с последующим его термостатированием при температуре
45 +/- 1 град.С в течение 2 часов в жидкой питательной среде,
содержащей пептон, лактозу и натрия хлорид.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства,
материалы, реактивы
----------------------------------------------------------------------
| 3.1. Приборы | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Хемилюминометр ЛИК | ТУ 000.000.АЖП |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| 3.2. Вспомогательные устройства | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Дозатор пипеточный | ТУ 64-1-33-29 |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Пинцет | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Батометр | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Вакуумный насос | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Термостат электрический с автоматическим | |
| терморегулятором до 50 град.С | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Аппарат фильтровальный с диаметром | |
| фильтрующей поверхности 35 или 47 мм | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Фильтры мембранные или фильтрующие | |
| мембраны "Владисарт" марки МФА-МА N 4 - 6, | |
| диаметром 35 или 47 мм | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Флакон из стекла объемом 1 куб. дм | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Флаконы из стекла или мерные стаканы, бюксы | |
| диаметром 50 мм и емкостью 30 - 50 куб. см | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| 3.3. Материалы | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Бумага фильтровальная | ГОСТ 12026 |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| 3.4. Реактивы | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Реактив на основе люминола | |
| 3% водный раствор перекиси водорода | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ 5962 |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Натрий хлористый | ГОСТ 4233 |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Лактоза | |
----------------------------------------------------------------------
4. Требования по безопасности
4.1. При работе с реактивами и этиловым спиртом соблюдаются
правила безопасности по ГОСТ 1.005.
4.2. При выполнении измерений с использованием прибора ЛИК
соблюдают правила по ГОСТ 12.1.019 и инструкции по эксплуатации
прибора.
5. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию
лаборант и опыт работы на приборе ЛИК и прошедшие обучение в ФЦ ГСЭН
МЗ РФ.
6. Условия измерения
Измерения проводят при атмосферном давлении 730 - 760 мм рт. ст.,
температуре окружающей среды (20 +/- 15) град.С в лабораторных и
полевых условиях.
7. Подготовка и выполнение определений
7.1. Прибор ЛИК готовят к работе в соответствии с инструкцией по
эксплуатации.
7.2. Приготовление рабочего реактива.
В чистую пробирку дозатором пипеточным наливают 0,3 куб. см 3%
водной перекиси водорода и прибавляют к ней 6,0 +/- 0,1 куб. см
реактива.
Рабочий реактив годен для анализа в течение 24 часов с момента
его приготовления.
7.3. Отбор пробы воды.
Пробу воды из поверхностного водоисточника отбирают батометром и
помещают в стерильную емкость объемом 1 куб. дм.
7.4. Приготовление жидкой питательной среды.
На аналитических весах поочередно взвешивают 5 г пептона, 5 г
натрия хлористого, 5 г лактозы и растворяют их в 1 куб. дм стерильной
дистиллированной воды.
5
Полученную смесь стерилизуют при 112 град.С (0,49 х 10 Па) 12
минут.
7.5. Концентрирование микробных клеток.
Концентрирование проводят путем фильтрования пробы через
мембранный фильтр. Для этого фильтровальный аппарат стерилизуют
фламбинированием, собирают согласно инструкции и фильтруют через него
1 куб. дм отобранной воды. Подготовку мембранных фильтров и фильтрацию
проводят согласно инструкции, прилагаемой к ним.
8. Проведение анализа
8.1. Определение величины сигнала фона питательной среды. Крышку
прибора передвигают до упора вперед, снимают крышку-дозатор, в кювету
из стекла наливают 0,3 куб. см рабочего реактива и устанавливают его в
реакционную камеру. Камеру закрывают крышкой-дозатором и в ее полость,
сменив наконечник пипеточного дозатора на чистый, наливают 0,1 куб. см
смеси питательной среды. Передвигают крышку прибора до упора назад,
нажимают на нее рукой и снимают показания прибора. Анализ повторяют
три раза, вычисляют среднее значение и записывают в блокнот.
8.2. Термостатирование мембранного фильтра.
Извлекают фламбинированным пинцетом из фильтровального аппарата
мембранный фильтр, помещают его в стерильный флакон нижней стороной
(или в стаканчик, бюкс), куда наливают 2,0 +/- 0,1 куб. см жидкой
питательной среды. Флакон (или стаканчик, бюкс) закрывают крышкой и
термостатируют при температуре (45 +/- 1) град.С в течение 2 часов.
8.3. Определение лактозоположительных кишечных палочек. По
окончании термостатирования флакон извлекают из термостата, всю
жидкость над фильтром анализируют на приборе, как указано в п. 8.1, из
полученного сигнала вычитают сигнал фона и по градуировочному графику
(см. рекомендации по экспресс-определению ОМЧ) определяют концентрацию
кишечных палочек.
Экспресс-метод определения термотолерантных
колиформных бактерий хемилюминесцентным методом
Настоящие методические рекомендации устанавливают методику
хемилюминесцентного определения в 100 куб. см воды централизованного
хозяйственно-питьевого водоснабжения термотолерантных колиформных
бактерий.
1. Принцип метода
Определение клеток термотолерантных колиформных бактерий в воде
основано на их способности инициировать хемилюминесценцию люминола в
щелочной среде, величина интенсивности которой пропорциональна числу
клеток в анализируемой пробе.
2. Чувствительность и сущность метода определения
Определение клеток термотолерантных колиформных бактерий
выполняют на хемилюминометре ЛИК.
Концентрирование микробных клеток из воды осуществляют на
мембранный фильтр с последующим его термостатированием при температуре
(45 +/- 1) град.С в течение 2 часов в жидкой питательной среде,
содержащей пептон, лактозу и NaCl.
Нижний предел чувствительности измерения составляет 2 КОЕ/куб.
см. Определению не мешают продукты метаболизма клеток, питательная
среда и их отмершие клетки.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства,
материалы, реактивы
-----------------------------------------------------------------------
| 3.1. Приборы | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Хемилюминометр ЛИК | ТУ 000.000.АЖП |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| 3.2. Вспомогательные устройства | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Дозатор пипеточный | ТУ 64-1-33-29 |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Пинцет | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Пробоотборник для отбора проб воды | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Мерный стакан объемом 100 куб. см | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Термостат электрический с автоматическим | |
| терморегулированием до 50 град.С | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Аппарат фильтровальный с диаметром | |
| фильтрующей поверхности 35 или 47 мм | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Вакуумный насос (или инжекторное устройство) | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Разовые чашки Петри диаметром 50 и менее мм | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Фильтры мембранные или фильтрующие | |
| мембраны "Владисарт", марки МФА-МА | |
| N 4 - 6, диаметром 35 или 47 мм | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Флаконы из стекла объемом 100 куб. см | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Флаконы из стекла или мерные стаканы, | |
| бюксы диам. 50 мм и емкостью 30 - 50 куб. см | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| 3.3. Материалы | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Бумага фильтровальная | ГОСТ 12026 |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| 3.4. Реактивы | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Реактив на основе люминола | |
| 3% водный раствор перекиси водорода | |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ 5962 |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Натрий хлористый | ГОСТ 4233 |
|---------------------------------------------------|-----------------|
| Лактоза | |
-----------------------------------------------------------------------
4. Требования к безопасности
4.1. При работе с реактивом и спиртом соблюдают меры безопасности
по ГОСТ 1.005.
4.2. При работе на приборе ЛИК соблюдают правила
электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.019 и инструкцией по
эксплуатации прибора.
5. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений допускаются лица имеющие квалификацию
лаборант с опытом работы на приборе ЛИК и прошедшие обучение в ФЦ ГСЭН
МЗ РФ.
6. Условия измерения
Измерение проводят при атмосферном давлении 730 - 760 мм рт. ст.,
температуре окружающего воздуха 20 +/- 5 град.С в лабораторных
условиях.
7. Подготовка к выполнению измерений
7.1. Прибор ЛИК готовят к работе в соответствии с инструкцией по
эксплуатации.
7.2. Приготовление рабочего реактива.
В чистую пробирку дозатором пипеточным наливают 0,3 куб. см 3%
перекиси водорода и прибавляют к ней 6,0 +/- 0,1 куб. см реактива.
Рабочий реактив годен для анализа в течение 24 часов с момента его
приготовления.
7.3. Отбор проб воды из системы центрального питьевого
водоснабжения.
Открывают кран и дают воде свободно истекать в течение 10 минут.
Затем трижды ополаскивают три емкости для отбора проб истекающей водой
и отбирают в каждую из них поочередно по 100 куб. см с интервалом
времени 1 минута между каждым отбором. Емкости закрывают пробкой и
нумеруют.
7.4. Приготовление жидкой питательной среды.
Взвешивают на аналитических весах поочередно по 5,0 г пептона,
лактозы и NaCl и растворяют их в 1 куб. дм стерильной дистиллированной
5
воды. Смесь стерилизуют при 112 град.С (0,49 х 10 Па) 12 минут.
7.5. Концентрирование микробных клеток проводят путем
фильтрования проб воды через мембранный фильтр. Для этого стерилизуют
фильтровальный аппарат фламбинированием, собирают согласно инструкции
и фильтруют через него 300 куб. см отобранной для анализа воды.
Подготовку мембранных фильтров к фильтрации проводят согласно
инструкции, прилагаемой к ним.
8. Проведение анализа
8.1. Определение величины сигнала фона питательной среды. Крышку
прибора передвигают до упора вперед, снимают крышку-дозатор. В кювету
из стекла дозатором пипеточным наливают 0,3 куб. см рабочего реактива,
устанавливают ее в реакционную камеру прибора и закрывают
крышкой-дозатором. В полость крышки-дозатора, сменив наконечник
дозатора пипеточного на чистый, наливают 0,1 куб. см питательной
среды. Крышку прибора передвигают до упора назад, нажимают на нее
рукой и с индикатора снимают его показания. Анализ питательной среды
повторяют три раза, вычисляют среднее значение и записывают его в
блокнот.
8.2. Термостатирование мембранного фильтра.
Извлекают фламбинированным пинцетом из фильтровального аппарата
мембранный фильтр, помещают его нижней стороной в стерильный флакон
(разовую чашку Петри, стаканчик или бюкс), куда заливают 2,0 +/- 0,1
куб. см жидкой питательной среды. Флакон закрывают крышкой и
термостатируют при температуре (45 +/- 1) град.С в течение 2 часов.
8.3. Определение термотолерантных колиформных бактерий.
По истечении времени термостатирования флакон (или стаканчик, или
бюкс) извлекают из термостата и всю жидкую фазу анализируют на приборе
ЛИК, как указано в п. 8.1. Вычисляют среднее значение сигнала. Если
оно больше среднего значения сигнала фона питательной среды, то проба
анализируемой воды содержит клетки термотолерантных колиформных
бактерий.
Экспресс-метод определения общих колиформных
бактерий в воде хемилюминесцентным методом
Настоящие методические рекомендации устанавливают методику
определения в 100 куб. см воды централизованного хозяйственно -
питьевого водоснабжения и в 1 куб. дм воды из подземного водоисточника
клеток общих колиформных бактерий.
1. Принцип метода
Определение клеток общих колиформных бактерий в воде основано на
их способности инициировать хемилюминесценцию люминола в щелочной
среде, величина интенсивности которой пропорциональна числу клеток в
анализируемой пробе.
2. Чувствительность и сущность метода определения
Определение клеток общих колиформных бактерий выполняют на
хемилюминометре ЛИК. Концентрирование микробных клеток из воды
осуществляют на мембранный фильтр с последующим его термостатированием
при температуре (37 +/- 1) град.С в течение 2 часов в жидкой
питательной среде, содержащей пептон, глюкозу и NaCl.
Нижний предел измерения концентрации бактериальных клеток
составляет 2 КОЕ/куб. см. Определению не мешают продукты метаболизма
бактерий, их отмершие клетки и питательная среда.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства,
материалы и реактивы
----------------------------------------------------------------------
| 3.1. Приборы | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Хемилюминометр ЛИК | ТУ 000.000.АЖП |
|---------------------------------------------------|----------------|
| 3.2. Вспомогательные устройства | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Дозатор пипеточный | ТУ 64-1-33-29 |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Пинцет | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Пробоотборник для отбора проб воды | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Мерный стакан объемом 100 куб. см | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Разовые чашки Петри диаметром 50 и менее мм | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Термостат электрический с автоматическим | |
| терморегулированием до 50 град.С | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Аппарат фильтровальный с диаметром | |
| фильтрующей поверхности 35 или 47 мм | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Вакуумный насос (или инжекторное устройство) | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Фильтры мембранные или фильтрующие мембраны | |
| "Владисарт", марки МФА-МА N 4 - 6, | |
| диаметром 35 или 47 мм | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Емкость (бутыль) объемом 1 куб. дм | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Флаконы из стекла или мерные стаканы, | |
| бюксы диам. 50 мм и емкостью 30 - 50 куб. см | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Флаконы из стекла объемом 150 куб. см | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| 3.3. Материалы | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Бумага фильтровальная | ГОСТ 12026 |
|---------------------------------------------------|----------------|
| 3.4. Реактивы | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Реактив на основе люминола | |
| 3% водный раствор перекиси водорода | |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ 5962 |
|---------------------------------------------------|----------------|
| NaCL | ГОСТ 4233-77 |
|---------------------------------------------------|----------------|
| Глюкоза, х.ч. | ГОСТ 6038-79 |
----------------------------------------------------------------------
4. Требования по безопасности
4.1. При работе с реактивом и спиртом соблюдаются меры
безопасности по ГОСТ 1.005-88.
4.2. При работе на приборе ЛИК соблюдают правила
электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по
эксплуатации прибора.
5. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию
лаборант с опытом работы на приборе ЛИК и прошедшие обучение в ФЦ ГСЭН
МЗ РФ.
6. Условия измерения
Измерение проводят при атмосферном давлении 730 - 760 мм рт. ст.,
температуре окружающего воздуха (20 +/- 15) град.С в лабораторных или
полевых условиях.
7. Подготовка к выполнению измерений
7.1. Прибор ЛИК готовят к работе в соответствии с инструкцией по
эксплуатации.
7.2. Приготовление рабочего реактива.
В чистую пробирку наливают 0,3 куб. см 3% водного раствора
перекиси водорода и приливают к ней 6,0 +/- 0,1 куб. см реактива.
Рабочий реактив годен для анализа в течение 24 часов с момента его
приготовления.
7.3. Отбор проб воды.
7.3.1. Отбор проб воды из системы централизованного питьевого
водоснабжения.
Открывают кран и дают воде свободно истекать в течение 10 минут.
Затем берут поочередно три флакона, трижды ополаскивают каждый
истекающей водой и отбирают по 100 +/- 1,0 куб. см пробы воды с
интервалом времени между отбором проб 1 минута. Флаконы закрывают
крышкой и нумеруют.
7.3.2. Отбор проб воды из подземного водоисточника. Открывают
кран и дают воде свободно истекать в течение 10 минут. Затем берут
емкость объемом 1 куб. дм, трижды ополаскивают ее истекающей водой и
отбирают пробу объемом 1,0 +/- 0,01 куб. дм.
7.4. Приготовление жидкой питательной среды. Взвешивают на
аналитических весах 5 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г глюкозы и
растворяют их в 1 куб. дм стерильной дистиллированной воды. Указанный
5
раствор стерилизуют при 112 град.С (0,49 х 10 Па) 12 минут.
7.5. Концентрирование микробных клеток.
Стерилизуют фламбированием фильтровальный аппарат и фильтруют
через него отобранные для анализа пробы воды. При этом подготовку
мембранных фильтров к фильтрации проводят согласно прилагаемой к ним
инструкции, а концентрирование микробных клеток из проб осуществляют
путем фильтрации проб воды. Для фильтрации проб воды из системы
централизованного водоснабжения и подземного водоисточника используют
раздельные фильтры. Все три пробы воды централизованного водоснабжения
фильтруют через один фильтр.
8. Проведение анализа
8.1. Определение величины фона питательной среды. Крышку прибора
передвигают до упора вперед, снимают крышку-дозатор, в кювету из
стекла наливают 0,3 куб. см рабочего реактива и устанавливают ее в
реакционную камеру. Крышкой-дозатором закрывают реакционную камеру и в
ее полость наливают 0,1 куб. см жидкой питательной среды пипеточным
дозатором с чистой насадкой. Крышку прибора передвигают до упора
назад, нажимают на нее рукой и снимают показания прибора. Анализ
повторяют три раза, вычисляют среднее значение сигнала и записывают
его в блокнот.
8.2. Термостатирование мембранного фильтра.
Извлекают фламбированным пинцетом из фильтровального аппарата
мембранный фильтр, помещают его нижней стороной в стерильный флакон
(стаканчик, бюкс, чашка Петри) и заливают в него 2,0 +/- 0,1 куб. см
жидкой питательной среды. Флакон (стаканчик, бюкс) закрывают крышкой и
термостатируют при температуре (37 +/- 1) град.С в течение 2-х часов.
8.3. Определение общих колиформных бактерий.
По истечении времени термостатирования флакона с мембранным
фильтром, на котором сконцентрированы клетки бактерий из проб воды
централизованного водоснабжения его извлекают из термостата и всю
жидкую фазу над ним анализируют на приборе, как указано в п. 8.1.
Вычисляют среднее значение сигнала и сравнивают его с фоном
питательной среды. Если он больше, то в анализируемой воде
присутствуют искомые бактерии.
8.4. Определение числа бактерий группы кишечных палочек.
По истечении времени термостатирования извлекают флакон с
фильтром, на котором сконцентрированы клетки из воды подземного
водоисточника и на приборе анализируют всю жидкую фазу над ним, как
указано в п. 8.1. Вычисляют среднее значение сигнала, вычитают из него
значение фона питательной среды и по градуировочному графику (см.
рекомендации по экспресс-определению ОМЧ) определяют концентрацию
клеток.
Экспресс-метод определения коли-индекса
воды подземных источников
1. Введение
Настоящая методика разработана для экспрессного определения
коли-индекса в воде хемилюминесцентным методом.
2. Принцип и характеристика метода
Метод основан на использовании способности микробных клеток
вегетативной форме инициировать хемилюминесценцию в момент смешения
реактива и анализируемой пробы воды, содержащей в себе эти клетки.
Диапазон измеряемых концентраций микробных клеток в воде составляет от
9
10 до 10 КОЕ / куб. см. Суммарная погрешность метода не превышает 20
град.. Анализ одной пробы выполняют в течение 5 минут. Предел
чувствительности - 2 КОЕ/куб. см.
3. Аппаратура, посуда, материалы
----------------------------------------------------------------------
| Анализатор ЛИК | ТУ 000.000.АЖП |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Пробирки химические на 10/160 | ГОСТ 199198 |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Дозатор пипеточный П1 | ТУ 64-3329 |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Стеклянная палочка, диаметр 6 мм, длина 200 мм | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Цилиндр мерный на 50 мл. | ГОСТ 1770 |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Воронка диаметром 36 мм, высота 88 мм | ГОСТ 25336 |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Марлевые фильтры 50 х 50 мм, трехслойные | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Фильтровальная бумага | ГОСТ 12026 |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Пинцет | ГОСТ 9048 |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Аппарат для мембранной фильтрации | |
|--------------------------------------------------|-----------------|
| Бюкс диаметром 50 мм | ГОСТ 1770 |
----------------------------------------------------------------------
4. Реактивы и растворы
----------------------------------------------------------------------
|Реактив | ГО-33.10.000.01 |
|-------------------------------------------------|------------------|
|Дистиллированная вода | ТУ 6-09-2502 |
|-------------------------------------------------|------------------|
|Этиловый спирт | ГОСТ 18300 |
|-------------------------------------------------|------------------|
|Универсальная индикаторная бумага | ТУ 6-09-1181 |
|-------------------------------------------------|------------------|
|Перекись водорода, ч.д.а. | ГОСТ 177 |
----------------------------------------------------------------------
5. Приготовление рабочего реактива
5.1. Определяют исходный объем рабочего реактива исходя из его
расхода на один анализ 0,3 мл. Для этого число анализов умножают на
0,3 мл и получают исходный объем реактива. Пример. Необходимо провести
100 анализов 100 х 0,3 мл = 30 мл.
5.2. В чистую пробирку (мерный стакан) наливают 30 мл реактива и
прибавляют к нему 1 мл 3% перекиси водорода. (На 6 мл реактива
приходится 0,2 мл 3% перекиси водорода.) Приготовленный рабочий
реактив пригоден для анализа в течение 24 часов.
6. Определение коли-индекса
6.1. Спиртом фламбируют аппарат для фильтрации и пинцет.
6.2. В аппарат для фильтрации помещают мембранный фильтр и
готовят его к работе согласно инструкции.
6.3. Отобранную для анализа пробу воды тщательно перемешивают
встряхиванием в течение 3-х минут и фильтруют ее через мембранный
фильтр.
6.4. Извлекают мембранный фильтр из фильтровального аппарата и
пинцетом помещают его нижней стороной в стерильный бюкс, куда
предварительно наливают 2 мл стерильного физраствора.
6.5. Готовят к работе прибор ЛИК согласно инструкции и определяют
на нем фон физраствора. Для этого крышку прибора передвигают до упора
вперед, наливают в кювету из стекла дозатором пипеточным 0,3 мл
рабочего реактива, помещают кювету в камеру прибора и закрывают ее
крышкой-дозатором.
Сменив на дозаторе пипеточном наконечник на чистый, наливают в
полость крышки-дозатора 0,1 мл стерильного физраствора, крышку прибора
передвигают до упора назад, сильно нажимают на нее рукой и снимают
показания прибора. Определение повторяют три раза, вычисляют среднее
значение фона и записывают его в журнал (блокнот).
6.6. Круговыми движениями экстрагируют мембранный фильтр,
помещенный в стерильный бюкс по п. 6.4 в течение 2-х минут и весь
жидкий экстракт (физраствор) анализируют на приборе ЛИК, как указано в
п. 6.5. Вычисляют среднее значение показаний прибора, вычитают из него
значение фона физраствора и по градуировочному графику определяют
коли-индекс.
7. Техника безопасности
Все работы по определению бактерий в воде проводят в строгом
соответствии с действующими Правилами и Инструкциями по охране труда.
Не допускать попадания реактива и анализируемой пробы на открытые
участки кожи и в глаза; в случае попадания немедленно протереть 10%
раствором питьевой соды или обмыть обильным количеством воды. При
работе с прибором строго выполнять требования по технике безопасности,
указанные в инструкции по эксплуатации. |