МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ОРГАНИЗАЦИЯ КОНТРОЛЯ И МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ LISTERIA MONOCYTOGENES В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ. Методика. Главный государственный санитарный врач РФ. 22.04.02 МУК 4.2.1122-02

                    МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
                     И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
           ОРГАНИЗАЦИЯ КОНТРОЛЯ И МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ
              LISTERIA MONOCYTOGENES В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

                             МЕТОДИКА

               ГЛАВНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНИТАРНЫЙ ВРАЧ РФ                    

                          22 апреля 2002 г.
                          N МУК 4.2.1122-02

                                 (Д)


                                                             Утверждаю

                                               Главный государственный
                                                       санитарный врач
                                                 Российской Федерации,
                                                    Первый заместитель
                                              Министра здравоохранения
                                                  Российской Федерации
                                                          Г.Г.ОНИЩЕНКО
                                                   22 апреля 2002 года

                                                       Дата введения -
                                                      1 июня 2002 года

     1. Разработаны  Федеральным  центром  госсанэпиднадзора Минздрава
России (Л.Г. Подунова, Э.Ф. Опочинский, Н.С. Кривопалова), ГУ Научно -
исследовательским  институтом  питания Российской Академии медицинских
наук (В.А.  Тутельян,  С.А.  Шевелева, И.Б. Куваева, Н.Р. Ефимочкина),
Департаментом   госсанэпиднадзора  Минздрава  России  (Н.Н.  Иванова),
Научно - исследовательским институтом  эпидемиологии  и  микробиологии
им.  Н.Ф.  Гамалеи  РАМН  (И.С.  Тартаковский,  С.А.  Ермолаева,  Т.С.
Карпова),   Центральным   научно   -   исследовательским    институтом
эпидемиологии МЗ РФ (Б.Л.  Черкасский), Центром госсанэпиднадзора в г.
Москве (Н.Я.  Салова,  В.П.  Голованова),  Центром госсанэпиднадзора в
Тульской    области    (Т.А.    Попова),    Всероссийским   научно   -
исследовательским институтом мясной  промышленности  (Ю.Г.  Костенко),
Координационным   микробиологическим   центром  рыбной  промышленности
ГИПРОРЫБФЛОТа (Л.Б.  Мухина,  Е.Ю.  Дмитриева), Всероссийским научно -
исследовательским  институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии
(В.М. Котляров).
     2. Утверждены    Главным    государственным   санитарным   врачом
Российской Федерации - Первым  заместителем  Министра  здравоохранения
Российской Федерации Г.Г. Онищенко 22.04.02.
     3. Введены впервые.

               1. Общие положения и область применения

     1.1. Настоящие  Методические  указания   устанавливают   основные
принципы  организации  контроля  и  методику  проведения  лабораторных
исследований пищевых продуктов по выявлению в  них  бактерий  Listeria
monocytogenes.
     При контроле  пищевых  продуктов  на  загрязненность  патогенными
микроорганизмами  в  СанПиН  2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к
безопасности и пищевой ценности пищевых  продуктов"  предусматривается
новый  микробиологический  показатель  "Listeria  monocytogenes  -  не
допускаются" в 25 г продуктов массового назначения и в 50 - 100 г  для
продуктов детского и специализированного питания.
     Проведение контроля на Listeria monocytogenes  позволит  получить
реальную  картину  ситуации  в  Российской Федерации,  оценить степень
загрязненности  пищевой  продукции   и   дать   оценку   эффективности
принимаемых  мер  в  целях обеспечения ее безопасности в плане новых и
вновь возникающих возбудителей инфекций с пищевым путем  передачи  для
здоровья и жизни человека.
     1.2. Методические  указания  предназначены   для   применения   в
лабораториях учреждений государственной санитарно - эпидемиологической
службы Российской  Федерации,  осуществляющих  контроль  за  качеством
продовольственного сырья и пищевых продуктов,  в т.ч.  импортируемых в
Российскую  Федерацию,  гигиеническую  оценку  и  выдачу  санитарно  -
эпидемиологических заключений,  а также бактериологическую диагностику
заболеваний  с  пищевым  путем   передачи;   в   лабораториях   других
организаций,   аккредитованных   в   установленном  порядке  на  право
проведения    контроля    безопасности     пищевой     продукции     и
продовольственного   сырья;   в   организациях,   независимо  от  форм
собственности,      осуществляющих      производственный      контроль
продовольственного  сырья и пищевых продуктов в процессе промышленного
производства и выпуска продукции.
     1.3. Методические  указания  являются  обязательными при контроле
пищевых продуктов в ходе проведения  противоэпидемических  мероприятий
при возникновении вспышек, а также в порядке осуществления санитарно -
эпидемиологического надзора.
     1.4. Организация   проведения   контроля   пищевых  продуктов  на
Listeria monocytogenes.
     Лабораторный контроль  за  отсутствием  Listeria  monocytogenes в
пищевых продуктах, где нормируется этот показатель, проводится:
     в порядке  надзора  за  соблюдением  установленных  требований  в
области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов  в  ходе
проверок  изготовления  и оборота пищевой продукции,  оказания услуг в
сфере торговли и общественного питания;
     при экспертизе продукции и подтверждении соответствия требованиям
нормативных  документов  для  целей  гигиенической  оценки  и   выдачи
санитарно - эпидемиологических заключений;
     при контроле    за    безопасностью    продукции    изготовителем
(производственный контроль);
     в ходе  проведения   противоэпидемических   мероприятий   и   при
эпидрасследовании заболеваний.
     1.5. При проведении контроля безопасности по показателю  Listeria
monocytogenes   согласно   Положению  о  государственной  санитарно  -
эпидемиологической службе,  утвержденному Постановлением Правительства
Российской Федерации от 24 июля 2000 г.  N 554,  должен осуществляться
периодический отбор образцов пищевой продукции.
     1.5.1. Порядок   контроля   и   кратность   исследований   должны
устанавливаться  в  соответствии  с  методическими  и   инструктивными
документами,  утвержденными или согласованными в установленном порядке
органами  государственной  санитарно   -   эпидемиологической   службы
Российской   Федерации,   при   этом  необходимо  учитывать  специфику
производства,  степень его эпидзначимости,  материально -  техническое
оснащение и т.п.
     Особого внимания должны заслуживать  предприятия,  вырабатывающие
продукты детского питания,  детские молочные кухни,  пищеблоки детских
лечебно - профилактических учреждений, стационаров для онкологических,
гематологических   больных,  домов  ребенка,  родильных  домов,  домов
престарелых и инвалидов и т.п.
     При проведении   текущего   надзора   рекомендуемая   минимальная
периодичность выборочного  лабораторного  контроля  пищевой  продукции
массового  потребления - 1 раз в квартал;  для детского и диетического
питания - 2 раза.
     1.5.2. При  производственном контроле организация и периодичность
лабораторных   исследований   продукции   по    показателю    Listeria
monocytogenes   должна   устанавливаться   изготовителем  продукции  в
соответствии с действующими санитарными правилами и согласовываться  с
учреждениями  государственной санитарно - эпидемиологической службы по
месту расположения предприятия - изготовителя.
     1.5.3. Контроль   пищевых   продуктов   по   показателю  Listeria
monocytogenes с целью гигиенической  оценки  для  выдачи  санитарно  -
эпидемиологических    заключений    и    подтверждения    соответствия
установленным требованиям при проведении экспертизы  осуществляется  в
уполномоченных   лабораториях  центров  госсанэпиднадзора  или  других
организаций, аккредитованных в установленном порядке.
     1.6. В  пищевых продуктах,  предназначенных для непосредственного
употребления    в    пищу,    в    отношении    которых    отсутствуют
микробиологические   нормативы  или  данные  о  возможности  выделения
Listeria monocytogenes, контроль Listeria monocytogenes не проводится,
однако   в   случае   заболеваний  людей  и/или  нарушений  в  области
обеспечения качества и безопасности пищевых  продуктов  образцы  таких
продуктов должны быть направлены на лабораторное исследование.
     1.7. Организация   лабораторных    исследований    на    Listeria
monocytogenes.
     Допускается организация  лабораторных   исследований   путем   их
поэтапного   выполнения  в  лабораториях  учреждений  госсанэпидслужбы
различных уровней. При отсутствии возможности идентификации выделенных
культур  последние  могут  быть переданы в лаборатории,  располагающие
соответствующей материально - технической  базой  и  квалифицированным
персоналом, для выдачи окончательного результата.

                          2. Сущность метода

     Методические указания содержат описание метода выявления бактерий
Listeria monocytogenes, основанного на высеве определенного количества
продукта в жидкие селективные среды,  инкубировании посевов, выявлении
в этих посевах  бактерий,  способных  расти  и  образовывать  типичные
колонии  на  агаризованных  дифференциально  - диагностических средах.
Принадлежность   выделенных   культур   к    Listeria    monocytogenes
определяется по биохимическим, морфологическим и другим свойствам.
     Метод выявления L.  monocytogenes в пищевых продуктах основан  на
применении специальных селективных и дифференциально - диагностических
сред.  Селективность сред  по  отношению  к  сопутствующей  микрофлоре
обеспечивается  включением  в  их  состав хлорида лития,  акрифлавина,
циклогексимида,  налидиксиновой  кислоты,   полимиксина   или   других
антибиотиков.  Внесение  эскулина  и  цитрата аммония железа позволяет
подтверждать наличие листерий по почернению среды  за  счет  гидролиза
эскулина  в  присутствии  ионов  Fe+.  Подтверждающие  тесты родовой и
видовой  идентификации  включают   окраску   по   Граму,   определение
подвижности   выделенных   на   агаризованных   средах   типичных   по
физиологическим и морфологическим признакам  культур,  их  способности
восстанавливать  нитраты  до нитритов,  сбраживать рамнозу,  ксилозу и
маннит, способности к гидролизу лецитина на ГРМ-среде с активированным
углем,  а  также  определение  наличия  В-гемолиза на кровяном агаре и
дифференциацию L.  monocytogenes от других гемолизирующих  листерий  в
САМР-тесте с контрольными штаммами Staphylococcus aureus и Rhodococcus
equi.
     При необходимости   для  выявления  L.  monocytogenes  в  пищевых
продуктах проводится постановка реакции нарастания титра фага (РНФ).
     Предлагаемый метод       обнаружения       L.      monocytogenes,
гармонизированный  с  Международным   стандартом   ISO   11290-111996,
предусматривает определение наличия или отсутствия L.  monocytogenes в
нормируемой  массе  продукта  в  соответствии  с  нормативами   СанПиН
2.3.2.1078-01  "Гигиенические  требования  к  безопасности  и  пищевой
ценности пищевых продуктов",  выраженными  в  альтернативной  форме  и
основанными   на   существующей   системе  отбора  образцов  и  оценки
результатов анализа по двухклассной системе.
     Методические указания    также    содержат    описание   методики
кондуктометрического определения L.  monocytogenes в пищевых продуктах
с  использованием  микробиологического  анализатора "Бак Трак".  Метод
кондуктометрического  анализа   основан   на   регистрации   изменений
импеданса  -  сопротивления  питательной  среды,  которые происходят в
процессе роста и метаболической активности микроорганизмов.

            3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда,
                     реактивы и питательные среды

--------------------------------------------------------------------
|                  3.1. Аппаратура и инструментарий                |
|------------------------------------------------------------------|
|                                          |НД (ГОСТ, ТУ)          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Анализатор потенциометрический,           |                       |
|погрешность измерений pH +/- 0,01         |ГОСТ 19881-74          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П   |                       |
|или других марок, позволяющий             |                       |
|поддерживать температуру (160 +/- 5) ЬC   |ТУ 64-1-28-70-76       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Термостат, позволяющий поддерживать       |                       |
|рабочую температуру 37 ЬC с отклонением   |                       |
|от заданной +/- 1 ЬC                      |ТУ 64-1-1382-72        |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Баня водяная с подогревом                 |ГОСТ 12026-76          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4|                       |
|класса точности, с наибольшим пределом    |                       |
|взвешивания 200 г                         |ГОСТ 24104-88          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2,     |                       |
|МБИ-3, МБР-1, МБР-3, МБС                  |ГОСТ 8284-78           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Стерилизаторы паровые медицинские или     |                       |
|аналогичные                               |ГОСТ 19569-89 Е        |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Дистиллятор, обеспечивающий качество      |                       |
|дистиллированной воды в соответствии с    |ГОСТ 6709-72           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Гомогенизатор перистальтического типа     |                       |
|"Стомайкер" или других наименований       |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150|                       |
|или других видов                          |ТУ 16-535-84           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Холодильник бытовой электрический         |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Пинцет медицинский                        |ГОСТ 21241-89          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Ножницы медицинские                       |ГОСТ 21239-89          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Скальпель хирургический, 15 см            |ГОСТ 21240-89          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Штативы для пробирок                      |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Часы механические сигнальные              |ГОСТ 3145-84           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Электроплитка                             |ГОСТ 14919-83          |
|------------------------------------------------------------------|
|              3.2. Лабораторная посуда и материалы                |
|------------------------------------------------------------------|
|Бумага фильтровальная лабораторная        |ГОСТ 12026-76          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Бутылки стеклянные для химических         |                       |
|реактивов                                 |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Кастрюли эмалированные                    |ГОСТ 24778-81          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Марля медицинская                         |ГОСТ 9412-77           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Колбы плоскодонные конические или круглые |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|разной вместимости                        |ГОСТ 1770-74           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Воронки стеклянные                        |ГОСТ 25336-82          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Вата медицинская гигроскопическая         |ГОСТ 5556-81           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см |ГОСТ 29227-91          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Полистироловые планшеты U-образные        |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Пробирки Уленгута (поплавки)              |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Пробирки типов П1, П2                     |ГОСТ 25336-82          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Стекла предметные для микропрепаратов     |ГОСТ 6672-75           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Спиртовки лабораторные стеклянные         |ГОСТ 23932-90          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Ступка фарфоровая с пестиком              |ГОСТ 9147-80           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Термометр ртутный с диапазоном измерения  |                       |
|от 0 до 100 ЬC (цена деления шкалы 1 ЬC)  |ГОСТ 13646-68          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Чашки биологические (Петри)               |ГОСТ 23932-90          |
|------------------------------------------------------------------|
|               3.3. Реактивы и питательные среды                  |
|------------------------------------------------------------------|
|                                          |НД (ФС, ТУ),           |
|                                          |фирма - изготовитель   |
|------------------------------------------------------------------|
|                3.3.1. Реактивы, компоненты сред                  |
|------------------------------------------------------------------|
|Агар микробиологический                   |ГОСТ 17206-84          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Вода дистиллированная                     |ГОСТ 6709-72           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|D-глюкоза, ч.                             |ГОСТ 6038-79           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|D-лактоза, 1-водная                       |ТУ 6-09-22-98-79       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Маннит                                    |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Ксилоза                                   |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Рамноза                                   |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Калия гидроокись                          |ГОСТ 24363-80          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч.   |ГОСТ 4198-75           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Калий фосфорнокислый двузамещенный,       |                       |
|3-водный                                  |ГОСТ 2493-75           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Кислота соляная, х.ч.                     |ГОСТ 3118-77           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Литий хлористый, ч. или х.ч., или ч.д.а.  |ГОСТ 4328-77           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Масло иммерсионное для микроскопии        |ГОСТ 31739-78          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Набор реактивов для окраски по Граму      |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Натрий-аммоний фосфорнокислый             |                       |
|двузамещенный, 4-водный, ч. или х.ч.      |ГОСТ 4170-78           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Натрия гидроокись, ч.д.а.                 |ГОСТ 4328-77           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Натрий лимоннокислый, 5,5-водный, ч.д.а.  |ГОСТ 22280-75          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Натрий хлористый, ч. или х.ч., или ч.д.а. |ГОСТ 4233-77           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Пара-диметиламидобензальдегид, ч.         |ТУ 6-09-3272-77        |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Пептон сухой ферментативный для           |                       |
|бактериологических целей                  |ГОСТ 13805-76          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Полимиксин "М" или "В" сульфат по         |                       |
|500000 ед. (медпрепарат)                  |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Спирт этиловый ректификованный            |                       |
|технический                               |ГОСТ 18300-87          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Спирт этиловый ректификованный            |ГОСТ 5962-67           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Железа аммонийного цитрат                 |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Феноловый красный                         |ГОСТ 5853-51           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Фенолфталеин                              |ГОСТ 5850-72           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Фуксин основной                           |ТУ 6-09-4119-75        |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Хлороформ технический                     |ГОСТ 2-15-76-72        |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Уксусная кислота                          |ГОСТ 61-75             |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Сульфаниловая кислота                     |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|А-нафтол                                  |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Цинк порошкообразный                      |ГОСТ 3640              |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Эскулин                                   |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Экстракт дрожжевой сухой                  |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Лития хлорид                              |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Уголь активированный                      |Р.72.270.3             |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Желток куриного яйца                      |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Крахмал                                   |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Налидиксовая кислота                      |Lab M, HiMedia         |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Акрифлавина гидрохлорид (трипафлавин)     |Lab M, HiMedia         |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Цефтазидим                                |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Циклогексимид                             |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Тест - штаммы Listeria monocytogenes,     |                       |
|Listeria ivanovii, Listeria innocua,      |                       |
|Staphylococcus aureus, Rhodococcus equi,  |                       |
|типичные по культуральным, морфологическим|                       |
|и биохимическим свойствам                 |                       |
|------------------------------------------------------------------|
|                    3.3.2. Среды питательные                      |
|------------------------------------------------------------------|
|             3.3.2.1. Для культивирования изолятов                |
|------------------------------------------------------------------|
|Триптозный ГРМ-агар и ГРМ-бульон          |ФС42-3377-97           |
|                                          |(ГНЦ ПМ)               |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Среда ГРМ N 1                             |ВФС 42-2988-97         |
|                                          |(ГНЦПН)                |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Питательный бульон и питательный агар     |ТУ 10-02-02-789-176-94 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Триптон - соевый агар с дрожжевым         |                       |
|экстрактом (TSYEA)                        |HiMedia M1214          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Триптон - соевый бульон с дрожжевым       |                       |
|экстрактом (TSYEB)                        |HiMedia M1263          |
|------------------------------------------------------------------|
|             3.3.2.2. Среды селективного обогащения               |
|------------------------------------------------------------------|
|Бульон Фрейзера (Fraser Broth)            |BioMerieux 42046       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Бульон Фрейзера половинной концентрации   |                       |
|(Half Fraser Broth)                       |BioMerieux 42048       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Fraser Broth Base, Fraser Supplement,     |                       |
|Fraser Selective Supplement               |HiMedia M1327,         |
|                                          |FD 141, FE1251         |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Бульон для обогащения Listeria Enrichment |                       |
|Broth                                     |Merck 1.10549,         |
|                                          |HiMedia M569           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Бульон вторичного обогащения для листерий |                       |
|- Fraser Secondary Enrichment Broth Base  |HiMedia M1083          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Селективный бульон для листерий -         |                       |
|Listeria Selective Broth Base             |HiMedia M889           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Среды Pre-Media 403A и BiMedia 401A,      |                       |
|402A, 403A                                |Lab M                  |
|------------------------------------------------------------------|
|           3.3.2.3. Дифференциально - диагностические             |
|                       селективные среды                          |
|------------------------------------------------------------------|
|PALCAM - Listeria Selective Agar Base с   |                       |
|селективной добавкой 1.12122              |Merck  1.1 1755        |
|------------------------------------------|-----------------------|
|PALCAM-агар - селективная среда для       |                       |
|выделения листерий                        |BioMerieux 43559       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Агар для идентификации листерий -         |                       |
|Listeria Identification Agar Base         |                       |
|(PALCAM)                                  |HiMedia M1064          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Oxford - агар - селективная среда для     |                       |
|выделения листерий                        |BioMerieux 43 560      |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Listeria Oxford Medium Base и Oxford      |                       |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Listeria Supplement                       |HiMedia M1 145,        |
|                                          |FD 071                 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Среды Гисса с маннитом, ксилозой, рамнозой|ФС (ЦНИИВС             |
|                                          |им. И.И. Мечникова,    |
|                                          |НИИ питательных сред)  |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Среда для определения подвижности         |                       |
|листерий (Listeria motility medium)       |HiMedia M1215          |
|------------------------------------------|-----------------------|
|SIM-агар (сероводород-индол - подвижность)|Difco                  |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Blood Agar Base - основа кровяного агара  |HiMedia M073           |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Тест - системы биохимические для видовой  |                       |
|идентификации API Listeria                |BioMerieux             |
--------------------------------------------------------------------

     Допускается использование других  коммерческих  питательных  сред
диагностических  препаратов  аналогичного  назначения  для  проведения
исследований в соответствии с данным  документом.  При  их  применении
следует руководствоваться рекомендациями изготовителя.
     Питательные среды   и    биологические    препараты    импортного
производства  должны  иметь международный сертификат качества ИСО 9000
или  EN  29  000.  Питательные  среды   и   препараты   отечественного
производства   должны   вырабатываться  по  нормативной  документации,
утвержденной в установленном порядке.

                       4. Подготовка к анализу

               4.1. Приготовление растворов и реактивов

     4.1.1. Пептонно - солевой раствор - по ГОСТ 26669.
     4.1.2. Изотонический  (0,85%-ный водный) раствор хлорида натрия -
по ГОСТ 26669.
     4.1.3. Растворы  и реактивы для постановки реакции нитратредукции
- по ГОСТ 10444.8-99.
     4.1.4. Приготовление растворов и реактивов для окраски препаратов
по Граму - по  ГОСТ  10444.1  или  в  соответствии  с  инструкцией  по
применению.
     4.1.5. Раствор перекиси водорода для определения каталазы  3%-ный
- по ГОСТ 30425.

                 4.2. Приготовление питательных сред

     Среды промышленного   изготовления,  поименованные  в  п.  3.3.2,
готовятся  согласно  прописям  на  этикетке  или  в   соответствии   с
рекомендациями фирмы.
     Допускается применение сред лабораторного приготовления по п.  п.
4.2.1- 4.2.10.
     Приготовление питательных сред Pre-Media  403A  и  BiMedia  401A,
402A,  403A  для  определения  листерий  проводят в соответствии с МУК
4.2.590-96   "Бактериологические   исследования    с    использованием
микробиологического экспресс - анализатора "Бак Трак 4100".
     4.2.1. Питательный агар с 1%  глюкозы и питательный бульон  с  1%
глюкозы (МПА с 1%  глюкозы, МПБ с 1% глюкозы) готовят в соответствии с
ГОСТ 10444.1.
     4.2.2. Триптон  -  соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB) /
триптон - соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA)
     Состав среды  (г/л):  ферментативный  гидролизат  казеина - 17,0;
пептон  соевый  -  3,0;  натрий  хлористый   -   5,0;   фосфат   калия
однозамещенный - 2,5;  глюкоза - 2,5;  дрожжевой экстракт - 6,0;  агар
микробиологический (для TSYEA) - 15,0.
     Компоненты растворяют  в  1000  куб.  см  дистиллированной  воды,
тщательно перемешивают,  устанавливают pH 7,3 +/- 0,2 и  автоклавируют
при 121 ЬC в течение 15 мин.
     4.2.3. Среды селективного обогащения типа бульона Фрейзера
     Приготовление основы   среды   (г/л):  ферментативный  гидролизат
казеина - 5,0; пептон - 5,0; мясной экстракт - 5,0; дрожжевой экстракт
-  5,0;  натрий хлористый - 20,0;  калия дигидрофосфат - 1,35;  натрия
гидрофосфат - 12,0;  эскулин - 1,0;  литий  хлористый  -  3,0;  железа
аммонийного  цитрат - 0,25 растворяют в 1000 куб.  см дистиллированной
воды,  тщательно  перемешивают,  устанавливают  pH  7,2  +/-   0,2   и
автоклавируют при 121 ЬC 15 мин.
     Перед употреблением в основу среды  вносят  асептический  раствор
селективных компонентов следующего состава:
     4.2.3.1. Для приготовления среды типа бульона Фрейзера первичного
обогащения <*>:  налидиксовой кислоты - 10 мг, акрифлавина гидрохлорид
- 12,5 мг растворить в 10 куб. см стерильного 0,2 N гидроксида натрия.
     --------------------------------
     <*> Допускается при приготовлении  среды  типа  бульона  Фрейзера
первичного  обогащения готовить основу среды без добавления эскулина и
цитрата железа аммонийного.

     4.2.3.2. Для приготовления среды типа бульона Фрейзера вторичного
обогащения: налидиксовой кислоты - 20 мг, акрифлавина гидрохлорид - 25
мг растворить в 10 куб. см стерильного 0,2 N гидроксида натрия.
     Готовые среды  разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят
в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 ЬC.
     4.2.4. PALCAM-агар                   (полимиксин-акрифлавин-лития
хлорид-цефтазидим-эскулин-маннитол-агар) - селективная дифференциально
- диагностическая среда для выделения листерий
     Приготовление основы среды (г/л):  пептон мясной ферментативный -
23,0;  дрожжевой экстракт - 3,0;  крахмал - 1,0;  натрия хлорид - 5,0;
эскулин - 0,8;  лития хлорид - 15,0;  железа  аммония  цитрат  -  0,5;
глюкоза - 0,5;  маннит - 10,0;  феноловый красный - 0,08;  агар - 15,0
растворяют  в  1000   куб.   см   дистиллированной   воды,   тщательно
перемешивают,  устанавливают pH 7,0 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 ЬC
15 мин.
     К стерильной  расплавленной  основе  среды  добавляют асептически
раствор  селективных  компонентов  следующего  состава:  акрифлавин  -
0,005;  полимиксин  "В" - 100000 ед.;  цефтазидим - 0,02 в 10 куб.  см
стерильной дистиллированной воды.
     Готовую среду  разливают  в  стерильные  чашки  Петри  и хранят в
защищенных от света условиях при температуре не выше 8 ЬC.
     4.2.5. Селективная  дифференциально  -  диагностическая среда для
выделения листерий типа Оксфорд - агара
     Приготовление основы среды (г/л):  пептон мясной ферментативный -
23,0;  крахмал кукурузный - 1,0;  натрия хлорид - 15,0; эскулин - 1,0;
лития хлорид - 15,0;  железа аммония цитрат - 0,5; глюкоза - 0,5; агар
- 15,0 растворяют в 1000  куб.  см  дистиллированной  воды,  тщательно
перемешивают,  устанавливают pH 7,0 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 ЬC
15 мин.
     К стерильной  расплавленной  основе  среды  добавляют асептически
раствор  селективных  компонентов  следующего   состава:   акрифлавина
гидрохлорид  -  0,005;  циклогексимид  - 0,4,  колистина сульфат <*> -
0,02,  цефатетан <*> - 0,002,  фосфомицин <*> - 0,01 мг в 10  куб.  см
50%-ного этилового спирта.
     --------------------------------
     <*> Допускается  замена  комплекса  перечисленных антибиотиков на
полимиксин в количестве 500000 ед. на 1 л.

     Готовую среду разливают в  стерильные  чашки  Петри  и  хранят  в
защищенных от света условиях при температуре не выше 8 ЬC.
     4.2.6. Кровяной агар
     К растопленному и охлажденному до 45 - 50 ЬC питательному агару с
1%  глюкозы (п.  4.2.1) добавляют 5% по объему дефибринированной крови
животных.  Разливают в чашки Петри диаметром 90 мм по 15 куб. см среды
и подсушивают при 37 ЬC.
     Засев производят в теплые чашки.
     4.2.7. Питательный агар с эритроцитами барана
     Дефибринированную или  стабилизированную  цитратом  кровь  барана
центрифугируют в  асептических  условиях  30  мин.  при  900  об./мин.
Надосадочную   жидкость  сливают.  Осадок  суспендируют  в  стерильном
физиологическом  растворе  до  первоначального  объема,  добавляют   в
количестве  5%  по объему к растопленному и охлажденному до 45 - 50 ЬC
питательному агару (п.  4.2.1). Разливают в чашки Петри по 10 куб. см,
подсушивают при 37 ЬC. Чашки используют для посева теплыми.
     4.2.8. Среда для определения подвижности
     20 г  гидролизата  казеина  ферментативного,  6 г пептона мясного
ферментативного и 5 г агара растворяют в 1000 куб. см дистиллированной
воды, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2, разливают в пробирки по 5 - 7 куб.
см и автоклавируют при 121 ЬC 15 мин.
     4.2.9. Среды Гисса по ГОСТ 10444.1 с маннитом, рамнозой, ксилозой
     10 г пептона ферментативного и 5 г натрия хлористого растворяют в
1000  куб.  см дистиллированной воды и добавляют 10 г соответствующего
углевода.  Устанавливают pH 7,1  +/-  0,1,  вносят  10  мл  индикатора
Андреде   (также  возможно  использование  индикатора  бромкрезолового
пурпурного, "ВР" и др.), разливают в пробирки и стерилизуют при 112 ЬC
в течение 20 мин.
     4.2.10. Среда для определения лецитиназной активности листерий
     К среде  ГРМ  N  1  перед  стерилизацией добавляют активированный
уголь,  растертый до порошкообразного состояния,  до концентрации 0,5%
(вес / объем). Желток куриного яйца разводят в 150 мл физиологического
раствора и добавляют 5% по объему к стерилизованному и охлажденному до
40 - 50 ЬC питательному агару. Разливают в чашки Петри по 20 куб. см и
подсушивают при 37 ЬC.  Аналогично готовят среду с добавлением желтка,
но без добавления активированного угля.

       5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа

           5.1. Общие положения по отбору и подготовке проб

     Отбор и  подготовку  проб  продукции  производят в соответствии с
ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб  для  микробиологических  анализов",
ГОСТ  26669-85  "Продукты  пищевые  и  вкусовые.  Подготовка  проб для
микробиологических     анализов",     МУК      4.2.577-96      "Методы
микробиологического  контроля продуктов детского,  лечебного питания и
их компонентов",  ГОСТ Р 51446 (ИСО 7218-96), а также в соответствии с
действующими ГОСТ и НД на конкретные виды продуктов.
     Масса или объем отбираемых  проб  должны  быть  достаточными  для
проведения  исследования  и  минимально  вдвое превышать аналитический
образец. Из точечных проб составляют навеску массой 25 +/- 0,1 г (50 -
100  г  -  для  продуктов  детского,  лечебного  и специализированного
питания).
     От продукции  в  потребительской  таре  в  мелкой  фасовке  пробы
отбирают в количестве одной или нескольких  единиц  в  зависимости  от
массы  или  объема  потребительской тары,  с тем чтобы количество было
достаточным для проведения анализа.
     От продукции  в  транспортной  или  потребительской  таре больших
размеров или неупакованной пробы отбирают из разных мест  с  различной
глубины, включая поверхность.
     Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб  на
физико   -   химические   и   органолептические   анализы   стерильным
инструментом  в  стерильную  посуду.  При  этом  от  образца  отбирают
несколько   точечных   проб  из  разных  мест,  которые  измельчают  и
перемешивают, из них составляют навеску 25 г.
     Замороженные продукты предварительно размораживают до температуры
внутри продукта 0 - (-1)  ЬC;  продукты,  содержащие  жиры  (сливочное
масло, мороженое), нагревают до температуры 40 - 45 ЬC и перемешивают.
     Отобранные образцы  перемешивают  и  измельчают  или  доводят  до
однородной  консистенции  по  ГОСТ  26669,  из  измельченной суспензии
составляют навеску необходимой массы.
     При посевах  высококислотных  или  щелочных  (с pH < 6 или > 7,5)
жидких и твердых продуктов для предотвращения снижения pH  питательных
сред  на  0,5 и более pH продукта перед посевом доводят до 7,0 +/- 0,2
по ГОСТ Р 50480.

       5.2. Отбор и подготовка проб молока, молочных продуктов,
                          сыров, мороженого

     Отбор и  подготовку проб продуктов проводят согласно ГОСТ 3622-68
"Молоко и молочные продукты.  Отбор и подготовка  их  к  испытанию"  и
9225-84   "Молоко  и  молочные  продукты.  Методы  микробиологического
анализа".
     Кисломолочные продукты,   сыр,   творог,   творожные   изделия  и
пастообразные продукты тщательно измельчают с помощью  гомогенизаторов
перистальтического типа или ножевых и подвергают нейтрализации,  масло
сливочное и мороженое растапливают до сметанообразной консистенции.

                  5.3. Отбор и подготовка проб мяса,
         мясных полуфабрикатов, мяса птицы и птицепродуктов,
               колбасных изделий и других мясопродуктов

     Отбор и    подготовку    проб    мяса,    субпродуктов,    мясных
полуфабрикатов,  колбасных  изделий и других мясных продуктов проводят
по ГОСТ 21237 "Мясо.  Методы бактериологического анализа",  ГОСТ  4288
"Изделия  кулинарные  и  полуфабрикаты из рубленого мяса",  ГОСТ 9958,
ГОСТ 9792 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины
и мяса других видов убойных животных и птиц".
     Массу навески отбирают в соответствии с п. 6.1.
     Отбор и  подготовку  проб  мяса  птицы,  субпродуктов  и  птичьих
полуфабрикатов проводят по ГОСТ Р 50396.0 "Мясо птицы,  субпродукты  и
полуфабрикаты    птичьи.   Методы   отбора   проб   и   подготовка   к
микробиологическим исследованиям".

         5.4. Отбор и подготовка проб плодоовощной продукции

     Отбор и подготовку к анализу проб плодоовощной продукции проводят
согласно  ГОСТ  26668,  ГОСТ  26669,  ГОСТ 26313 "Продукты переработки
плодов  и  овощей.  Правила  приемки,  методы  отбора   проб",   кроме
подготовки   к   анализу   проб  поверхностно  -  контаминированных  и
пюреобразных  продуктов.  Для  поверхностно  -   контаминированной   и
быстрозамороженной плодоовощной продукции подготовку проводят согласно
"Инструкции   по   микробиологическому   контролю   быстрозамороженной
плодоовощной продукции" (МЗ СССР,  29.09.89,  прил.  1,  п.  1.3). Для
анализа поверхностно - контаминированной продукции  готовят  суспензию
добавлением к навеске массой (100 +/- 30) г, отобранной из трех единиц
тары или фасовки, 0,1%-ного пептонно - солевого раствора в количестве,
равном  массе  навески.  При  этом  1  куб.  см  полученной  суспензии
оценивают как 1 г (куб. см) продукта.
     Из измельченных плодов,  овощей,  полуфабрикатов и пюреобразных и
жидких отбирают раздельно навески массой по (100 +/-  30)  г  из  трех
единиц  тары  или  фасовки  и  готовят  объединенную  пробу  массой  в
соответствии с п. 6.1.

         5.5. Отбор и подготовка проб рыбы, нерыбных объектов
             промысла и продуктов, вырабатываемых из них

     Отбор и   подготовку   проб   проводят  согласно  "Инструкции  по
санитарно  -   микробиологическому   контролю   производства   пищевой
продукции  из  рыбы  и морских беспозвоночных" N 5319-91 от 22.02.91 и
ГОСТ 7631-85 "Рыба,  морские млекопитающие,  морские беспозвоночные  и
продукты  их  переработки.  Правила приемки,  органолептические методы
оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний".
     Отбор проб  свежей,  охлажденной  и  мороженой рыбы проводят от 2
точечных образцов,  мышечная ткань в которых составляет не менее 25  г
по  ГОСТ  7631-85.  Из  каждой  точечной пробы стерильным инструментом
вырезают спинные мышцы с кожей,  перемешивают и отвешивают 25 г, затем
измельчают  с  помощью  гомогенизаторов  перистальтического  типа  или
ножевых и гомогенизируют в 225 куб. см среды накопления.

              5.6. Продукты детского, лечебного питания
                           и их компоненты

     Отбор и  подготовку проб продуктов детского,  лечебного питания и
их   компонентов   проводят   согласно    МУК    4.2.577-96    "Методы
микробиологического  контроля продуктов детского,  лечебного питания и
их компонентов".
     Отобранные пробы    продуктов   перед   исследованием   тщательно
перемешивают,  кисломолочные продукты нейтрализуют (на  10  куб.  см/г
исследуемого   продукта   или   его   первого   разведения  для  сухих
кисломолочных продуктов,  напитка или закваски добавляют 1,0  куб.  см
стерильного  раствора  двууглекислого  натрия с массовой концентрацией
100  г/куб.  см).  Сыр,  творог,  творожные  изделия  и  пастообразные
продукты  тщательно  измельчают  и  нейтрализуют.  Топленое  масло или
молочный жир расплавляют при температуре 40 - 45 ЬC и перемешивают  до
получения однородной эмульсии.

                        6. Проведение анализа

     6.1. Подготовленную в соответствии с п.  5.  навеску исследуемого
продукта (гомогената, смыва с поверхности) в количестве 25 г (куб. см)
вносят  в одну из сред для первичного обогащения в количестве 225 куб.
см (по п.  п. 3.3.2.2, 4.2.3.1). При необходимости анализа других масс
продукта их посев проводят в среду также в соотношении 1:9 по объему.
     Посевы термостатируют при 37 ЬC в течение (24 +/- 2) ч. При росте
листерий на средах предобогащения, содержащих эскулин и цитрат железа,
аммонийного,  наблюдается почернение среды за счет гидролиза гликозида
эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа,
образуя комплекс  черного  или  оливкового  цвета.  На  других  средах
почернения не отмечается.
     6.2. После термостатирования  продукта  в  среде  для  первичного
обогащения  0,1  куб.  см  суспензии пересевают в 10 куб.  см одной из
жидких сред для вторичного  обогащения  по  п.  п.  3.3.2.2,  4.2.3.2.
Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) ЬC в течение 48 ч.  В
средах  с  эскулином  отмечают  почернение  как   признак   возможного
присутствия бактерий рода Listeria.
     6.3. Из пробирок после термостатирования,  независимо от  наличия
или отсутствия признаков роста, и в т.ч. почернения, делают пересев по
0,1 куб.  см на поверхность двух чашек Петри с одной из  агаризованных
дифференциально - диагностических сред по п. п. 3.3.2.3, 4.2.4, 4.2.5.
Посевной материал растирают стерильным шпателем. Допускается проводить
пересев петлей штрихом. Чашки со средами предварительно подсушивают.
     Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) ЬC в течение  24
- 48 ч.
     6.4. Проведение анализа без этапа вторичного обогащения
     При посеве   продуктов   с   низким  исходным  уровнем  микробной
контаминации  и  при  отсутствии  признаков  роста  в   жидкой   среде
(помутнение,  почернение и др.) допускается проводить пересев на чашки
с агаризованными  дифференциально  -  диагностическими  средами  сразу
после этапа первичного обогащения по п. 6.2.
     6.5. При  отсутствии  роста  на  чашках   с   дифференциально   -
диагностическими средами типа Оксфордского агара и PALCAM-агара анализ
прекращают  и  дают  заключение  об  отсутствии  L.  monocytogenes   в
исследованной пробе продукта.
     6.6. При обнаружении характерного роста на чашках отбирают 3 -  5
колоний для их дальнейшего изучения.
     На средах типа PALCAM-агара через  24  ч  инкубирования  листерии
формируют мелкие,  серовато - зеленые или оливково - зеленые колонии с
черным ореолом, диаметром 0,5 - 1,0 мм, иногда с черным центром. Через
48  ч  колонии  диаметром  1,0  - 2,0 мм приобретают зеленую окраску с
углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Кокковая микрофлора
(бактерии родов Staphylococcus,  Enterococcus) образует желтые колонии
за счет ферментации маннита.
     На Оксфордском  агаре  (Oxford  -  agar)  листерии,  выращенные в
течение 24 ч,  - мелкие (1 мм),  сероватые, окруженные черным ореолом.
Через 48 ч - более темные,  около 2 мм в диаметре,  с черным ореолом и
углубленным центром.
     При появлении   сплошного   роста   листерий  производят  пересев
бактериологической петлей из зон наибольшего почернения среды штрихами
на  2  - 3 чашки Петри с селективной дифференциально - диагностической
питательной  средой  (Оксфордский  или  PALKAM-агар)   для   получения
изолированных колоний. Посевы термостатируют аналогично п. 6.3.
     6.7. Отобранные   характерные    колонии,    подозрительные    на
принадлежность к Listeria monocytogenes, пересевают на среды: МПА с 1%
глюкозы (п.  4.2.1),  триптон - соевый  агар  с  дрожжевым  экстрактом
(TSYEA)  по п.  3.3.2.1 или 4.2.2 для получения изолированных колоний,
которые подвергают дальнейшему изучению.
     Посевы термостатируют при температуре 30 ЬC в течение 24 ч.
     6.8. Идентификация выделенных культур
     Для определения  принадлежности выделенных микроорганизмов к роду
Listeria  полученные  на  средах   культивирования   чистые   культуры
микроскопируют   по   Граму,   определяют   наличие  у  них  каталазы,
подвижность  при  двух  температурах  инкубирования  -  22  и  37  ЬC,
способность к ферментации маннита и ставят реакцию нитрат - редукции.
     6.8.1. Окраска по Граму
     Бактерии рода   Listeria   являются   грамположительными  тонкими
короткими палочками, спор не образуют.
     6.8.2. Каталазную  активность культур определяют в соответствии с
ГОСТ 30425 по  способности  каталазы  разлагать  перекись  водорода  с
выделением  пузырьков газа.  Реакцию ставят с охлажденной до комнатной
температуры  суточной  культурой  на  стерильном  предметном   стекле.
Изолированную   колонию,   взятую  с  поверхности  питательной  среды,
растирают на стекле и пипеткой наносят каплю 3%-ного раствора перекиси
водорода.  Если через 30 - 60 с на стекле появляются пузырьки газа, то
считают  результаты   реакции   положительными.   Параллельно   ставят
контрольную пробу.
     Бактерии рода Listeria являются каталазоположительными.
     6.8.3. Подвижность  культур  определяют посевом уколом в среды по
п. п. 3.3.2.3 и 4.2.8 и инкубированием при двух температурах - 25 и 37
ЬC в течение 48 - 72 ч.
     Бактерии рода  Listeria  подвижны  при  20  -  25  ЬC   (образуют
характерный  рост вокруг линии укола,  похожий на зонтик) и неподвижны
(или слабоподвижны) при 35 - 37 ЬC.
     6.8.4. Для  определения  способности сбраживать углеводы культуры
пересевают на пестрый ряд в среды Гисса по п.  п.  3.3.2.3 или  4.2.9.
Посевы  термостатируют  7  дней  при  37  ЬC,  наличие  ферментативной
активности в отношении углеводов определяют по изменению окраски  сред
за счет образования кислоты.
     Большинство бактерий рода  Listeria  не  утилизируют  маннит  (за
исключением L. grayi и L. grayi subsp. murrayi).
     6.8.5. Постановку реакции нитрат  -  редукции  проводят  по  ГОСТ
10444.8-88.  Бактерии  рода  Listeria  не  восстанавливают  нитраты до
нитритов (за исключением L. grayi и L. grayi subsp. murrayi).
     Обнаружение в  посевах грамположительных коротких тонких палочек,
каталазоположительных,  не восстанавливающих нитраты до  нитритов,  не
утилизирующих  маннит,  подвижных  при  25  ЬC и неподвижных при 37 ЬC
указывает  на   принадлежность   выделенных   на   дифференциально   -
диагностических  средах  культур  с  характерной  морфологией  к  роду
Listeria.
     Для подтверждения  принадлежности  выделенных  листерий к виду L.
monocytogenes определяют способность к ферментации  рамнозы,  ксилозы,
наличие  лецитиназной  и  бета  - гемолитической активности и проводят
постановку КАМП-теста  (CAMP-test).  Дифференцирующие  признаки  видов
рода Listeria указаны в табл. 1.

                                                             Таблица 1

----------------------------------------------------------------------------------------------
|   Признак      |L. monocytogenes|L. ivanovii|L. seeligeri|L. innocua|L. grayi|L. welshimeri|
|                |                |           |            |          |        |             |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
|Ферментация:    |                |           |            |          |        |             |
| маннита        |    -           |    -      |    -       |   -      |   +    |   -         |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
| ксилозы        |    -           |    +      |    +       |   -      |   -    |   +         |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
| рамнозы        |    +           |    -      |    -       |  +/-     |  +/-   |  +/-        |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
|Бета -          |                |           |            |          |        |             |
|гемолиз         |    +           |    +      |    +       |   -      |   -    |   -         |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
|КАМП-тест       |                |           |            |          |        |             |
|(CAMP-test).    |                |           |            |          |        |             |
|Усиление        |                |           |            |          |        |             |
|гемолиза        |                |           |            |          |        |             |
|около штриха:   |                |           |            |          |        |             |
| Rhodococcus    |                |           |            |          |        |             |
| equi           |    -           |    +      |    -       |   -      |   -    |   -         |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
| Staphylococcus |                |           |            |          |        |             |
| aureus         |    +           |    -      |    +       |   -      |   -    |   -         |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
|Лецитиназная    |                |           |            |          |        |             |
|активность:     |                |           |            |          |        |             |
| на среде с     |                |           |            |          |        |             |
| активированным |                |           |            |          |        |             |
| углем          |    +           |    +      |    -       |   -      |   -    |   -         |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
| на среде       |                |           |            |          |        |             |
| без угля       |    -           |    +      |    -       |   -      |   -    |   -         |
----------------------------------------------------------------------------------------------

     Для видовой   дифференциации    выделенных    культур    листерий
допускается  использовать  биохимические  тест  - системы API Listeria
фирмы  "BioMerieux".  При  их  применении  следует   руководствоваться
рекомендациями изготовителя.
     6.8.6. Наличие способности ферментировать  рамнозу  и  ксилозу  -
определяют аналогично п.  6.8.4. Бактерии L. monocytogenes утилизируют
рамнозу с образованием кислоты и не утилизируют ксилозу.
     6.8.7. Бета   -  гемолитическую  активность  исследуемых  культур
определяют  по  образованию  зон  просветления  за  счет   растворения
эритроцитов  вокруг колоний при посеве на поверхность кровяного агара,
приготовленного  с  добавлением  стерильной  дефибринированной   крови
барана или кролика.  Посевы на кровяном агаре (п.  п.  3.3.2.3, 4.2.6)
термостатируют при 37 ЬC в течение 24 ч.
     Listeria monocytogenes обладают бета - гемолитической активностью
(образуют узкие четкие зоны просветления вокруг колоний).
     6.8.8. Постановку   КАМП-теста  проводят  для  дифференциации  L.
monocytogenes от  других  видов  листерий,  обладающих  гемолитической
активностью.
     Для проведения теста  2  -  3-суточные  культуры  геополитических
штаммов  Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi засевают на кровяной
агар с эритроцитами барана двумя параллельными штрихами на  расстоянии
5,0 - 5,5 см, как показано на рис. 1 <*>.
     --------------------------------
     <*> Не приводится.

     Между вертикальными  штрихами  St.  aureus  и  Rh.  equi засевают
параллельными штрихами исследуемые  культуры  листерий  на  расстоянии
друг  от  друга  не  менее 1 см и от вертикальных штрихов - 0,5 см.  В
качестве контрольных используют тест - штаммы L.  monocytogenes  и  L.
ivanovii.  Инкубацию проводят 24 ч при 37 ЬC. Отмечают форму и размеры
зон  гемолиза  около  вертикальных  штрихов   роста   стафилококка   и
родококка.
     Listeria monocytogenes дает расширение зоны гемолиза около штриха
St. aureus (положительный КАМП-тест) и имеет отсутствие изменений зоны
гемолиза рядом со штрихом Rh. equi (отрицательный КАМП-тест).
     6.8.9. Для  определения  лецитиназной  активности  дно двух чашек
Петри со средой ГРМ N 1,  содержащих: 1 чашка - желток куриного яйца и
активированный   уголь,   2   чашка   -   желток   куриного  яйца  без
активированного угля - делят  на  несколько  секторов  или  квадратов,
исследуемые   культуры   и   контрольные  штаммы  листерий  пересевают
параллельно  короткими  штрихами  на  соответствующие  секторы  чашек,
содержащих  и  не содержащих уголь.  Инкубируют 48 ч при 37 ЬC.  Чашки
просматривают в проходящем свете и  определяют  наличие  активности  в
присутствии   и   в   отсутствие  активированного  угля,  сравнивая  с
контрольными высевами музейных штаммов. Listeria ivanovii дает плотную
зону   помутнения   шириной   3  -  6  мм  независимо  от  присутствия
активированного угля.  Listeria monocytogenes  дает  аналогичную  зону
помутнения в присутствии активированного угля и не дает при отсутствии
угля. Другие виды листерий не дают зоны помутнения.
     6.9. Учет результатов
     Результат оценивают по каждой  исследованной  пробе  отдельно.  В
образце продукта констатируют присутствие Listeria monocytogenes, если
при посеве на селективные среды  выделены  короткие  неспорообразующие
грамположительные па ломки, каталазоположительные, подвижные при 25 ЬC
и  неподвижные  при  37  ЬC,  утилизирующие  эскулин,  сбраживающие  с
образованием  кислоты  рамнозу и не сбраживающие маннит и ксилозу,  не
восстанавливающие   нитраты   до   нитритов,   обладающие    бета    -
гемолитической активностью,  дающие положительную реакцию в КАМП-тесте
со  Staphylococcus  aureus  и  отрицательную  -  с  Rhodococcus  equi,
проявляющие  лецитиназную  активность  на  среде ГРМ N 1 с добавлением
желтка куриного яйца и в присутствии активированного угля.
     Результаты выявления   Listeria   monocytogenes   в  определенной
навеске продукта записывают: "Listeria monocytogenes обнаружены в 25 г
(куб.  см)  (в  50  -  100  г  -  для продуктов детского,  лечебного и
специализированного питания) продукта" или "Listeria monocytogenes  не
обнаружены  в  25 г (куб.  см) (в 50 - 100 г - для продуктов детского,
лечебного и специального питания) продукта".
     Результат оценивают по каждой пробе отдельно.

             7. Проведение исследования с использованием
             кондуктометрического анализатора "Бак Трак"

               7.1. Предварительное обогащение - 1 этап

     Для предварительного  обогащения  используется  среда   Pre-Media
403A.
     Необходимое количество  продукта,  в   котором   регламентируется
отсутствие  L.  monocytogenes,  смешивают  со  средой Pre-Media 403A в
соотношении 1/10,  затем образец гомогенизируют и инкубируют в течение
24 ч.

                       7.2. Обогащение - 2 этап

     Для обогащения  используют  одну из сред:  BiMedia 401A,  BiMedia
402A, BiMedia 403A.
     Среду BiMedia  403A  (401A,  402A)  оставляют  уравновеситься при
комнатной температуре в течение 12 ч.  Устанавливают температуру 37 ЬC
на приборе "Бак Трак".
     В основном меню  программы  "Бак  Трак"  устанавливают  следующие
параметры.

        Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters)

 Время исследований (Duration)                  36 ч
 Масштаб измерений (Scale)
 М-параметр                                     0 - 20%
 Е-параметр                                     0 - 80%
 Время задержки (Delay)                         1 ч
 Пороговые значения (Thresholds)
 М-параметр                                     5%
 Е-параметр                                     15%
 Проводить учет результатов по Е-параметру
 Пороговое значение по времени (Time limit)     30 ч

     Добавляют в каждую измерительную  ячейку  по  10  куб.  см  среды
BiMedia  и вносят по 0,1 куб.  см предобогащенного образца,  тщательно
перемешивают   содержимое,   вращая   ячейку   между   ладонями    (не
переворачивая).
     Для контроля среды используют одну измерительную ячейку с 10 куб.
см среды BiMedia (без инокулята).
     Выбирают в  основном  меню  программы  ЗАПУСК  ИЗМЕРЕНИЙ   (Start
Measurement) и начинают измерения.
     После того как каждая позиция в  блоке  будет  отмаркирована  как
свободная  на экране монитора,  измерительные ячейки помещают в прибор
"Бак  Трак".  Измерение  начинается  автоматически  через  1  ч  после
загрузки  ячеек  в  прибор.  Рост  микроорганизмов и время определения
изменения импеданса (IDT) записываются автоматически.
     Учет результатов
     Образец загрязнен листериями,  если изменение импеданса превышает
15%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 30 ч.
     Подтверждение Listeria   -   позитивных   образцов.   В    случае
положительного  ответа  на  листерии  проводится подтверждение роста и
идентификация до L. monocytogenes с высевом на селективные питательные
среды   в   соответствии  с  п.  п.  6.3  -  6.8.  Высев  производится
непосредственно из измерительной ячейки.
     Выросшие культуры подвергают идентификации по п. 6.8.
     Учет результатов и выдача ответа - по п. 6.9.

            8. Выявление Listeria monocytogenes в реакции
                     нарастания титра фага (РНФ)

     РНФ может быть использована в качестве дополнительного метода для
обнаружения L.  monocytogenes  в  пищевых  продуктах  (при  проведении
противоэпидемических мероприятий и при эпидрасследовании).
     Реакция нарастания  титра  фага  -  быстрый  специфический  метод
обнаружения   листерий,   обеспечивающий   выявление   возбудителя   в
исследуемом материале без выделения культуры.
     РНФ основана   на   свойстве  индикаторного  бактериофага  строго
специфично размножаться в клетках гомологичного  микроба.  Размножение
бактериофага   сопровождается  увеличением  количества  его  частиц  и
повышением титра.
     8.1. В  реакции  применяют  листериозные  бактериофаги L2A и L4A.
Штаммы L.  monocytogenes - I (9 -  127)  и  II  (9  -  72)  серогрупп.
Питательные  среды,  содержащие  0,5%  глюкозы:  мясопептонный бульон,
1,5%-ный и 0,7%-ный мясопептонный агар.
     8.2. При постановке РНФ с пробами пищевых продуктов отвешивают 25
г исследуемого материала,  измельчают,  помещают в колбу емкостью 1000
куб.  см  и  добавляют  250 куб.  см МПБ.  Смесь в течение 5 - 10 мин.
встряхивают, затем 9 куб. см переносят в бактериологическую пробирку N
1 (опыт).
     8.3. Бактериофаги используют в рабочем разведении (10000  фаговых
корпускул  в  1 куб.  см).  Для этого их растворяют в МПБ до исходного
объема,  указанного на этикетке ампулы,  а  затем  на  МПБ  отдельными
пипетками  делают  пять  последовательных  десятикратных разведений (в
                                                      4
последнем разведении титр бактериофага составит 1 x 10 ).
     Смесь фагов готовят путем смешивания равных объемов  фага  L2A  и
L4A в рабочем разведении.
     8.4. Для контроля титра  бактериофага,  который  ставят  один  на
группу  анализов,  проводимых одновременно,  в пробирку N 2 (контроль)
вносят 9 куб. см МПБ.
     8.5. В пробирки N 1 и 2 вносят по 1 куб.  см смеси фага в рабочем
разведении (рис. 2) и выдерживают их в течение 16 - 24 ч при комнатной
температуре,  после чего в пробирки добавляют по 1 куб. см хлороформа.
Содержимое тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре
на  30  -  40  мин.  Хлороформ  оседает на дно,  надосадочную жидкость
подвергают дальнейшим исследованиям.

 Исследуемый субстрат       Смесь фагов       Мясопептонный бульон

         |                      | |                    |
         --------- -------------- ---------- -----------
                 | |                       | |
                \/ \/                     \/ \/
           N 1 - опытная           N 2 - контроль смеси фагов
                  |                          |
                 \/                         \/
     Инкубация в термостате при 23 ЬC в течение 16 - 24 часов
                  |                          |
                 \/                         \/
               Обработка хлороформом 30 - 40 минут
                  |                          |
                 \/                         \/
               Исследование методом агаровых слоев
         ------------------         ------------------
        \/               \/        \/               \/
         L2A             L4A       L2A              L4A

        Рис. 2. Схема постановки РНФ для обнаружения листерий.

     8.6. При использовании  смеси  фагов  из  опытной  и  контрольной
пробирок (N 1 и 2) берут по 0,2 куб.  см и переносят по 0,1 куб.  см в
две пробирки,  содержащие по 0,9 куб. см МПБ (один ряд для обнаружения
фага L2A, а другой - L4A), а затем из каждой пробирки готовят еще одно
десятикратное разведение.
     8.7. Готовят  взвесь  штаммов  I  и  II  серогруппы  по стандарту
мутности  10  ед.  путем  разведения  суточной  агаровой  культуры   в
физиологическом  растворе.  Во  все  пробирки с разведенным материалом
добавляют по 0,1 куб.  см взвеси,  штамма 1 серогруппы  для  выявления
фага L2A или штамма II серогруппы для обнаружения фага L4A.
     Содержимое пробирок засевают методом агаровых  слоев  по  Грациа.
Для  этого  накануне дня исследования в бактериологические чашки Петри
разливают по 10 куб. см 1,5%-ного МПА; МПА можно разлить в чашки Петри
и  в день исследования,  но в этом случае поверхность агара необходимо
предварительно подсушить в течение 40 - 50 мин.  при 37 ЬC или 2 ч при
комнатной  температуре.  Для  второго  слоя используют расплавленный и
охлажденный до 48 - 50 ЬC 0,7%-ный МПА, который следует использовать в
течение часа, так как позже он приобретает гелеобразную консистенцию и
непригоден для исследования.
     Затем в   пробирки   пипеткой   вносят   по   2,5  -  3  куб.  см
расплавленного и охлажденного до 48 - 50 ЬC 0,7%-ного МПА.  Содержимое
быстро  и  тщательно  перемешивают вращением пробирки между ладонями и
выливают в чашку Петри.  Смесь легким  покачиванием  чашки  равномерно
распределяют   вторым   слоем  на  поверхности  1,5%-ного  МПА.  Чашки
оставляют на ровном месте на 20 - 30  мин.  (до  застывания  0,7%-ного
МПА), затем переворачивают и инкубируют при комнатной температуре.
     8.8. Учет реакции проводят через 16 - 24 ч инкубирования посевов.
     В опытных   пробах  и  контроле  титра  фага  подсчитывают  число
негативных колоний во всех  чашках.  Негативные  колонии  -  округлые,
хорошо  заметные  на  фоне  бактериального роста,  прозрачные участки,
образующиеся в результате лизиса бактерий.
     При учете результатов сравнивают количество негативных колоний на
чашках соответствующих разведений.
     8.9. Результаты    реакции    оценивают   по   увеличению   титра
бактериофага (количества негативных колоний):
     увеличение количества  негативных  колоний  в  опытной  пробе  по
отношению к контролю в 5 и более раз (хотя бы по одному из разведений)
оценивается   как  положительный  результат,  менее  чем  в  5  раз  -
отрицательный;
     сплошной лизис   или   лизис   с   островками   оценивается   как
положительный результат.
     8.10. При    получении   положительного   результата   РНФ   дают
заключение,  что в исследуемом материале (пробе)  обнаружены  бактерии
рода Listeria.

                    9. Биологические исследования

     Биологические исследования    (постановку   биопроб   на   мышах)
выделенных  культур  и  их  серологическую   диагностику   в   реакции
агглютинации  проводят  в  ходе противоэпидемических мероприятий и при
эпидрасследовании   заболеваний   в   соответствии   с   Методическими
рекомендациями  "Лабораторная диагностика листериоза животных и людей,
меры борьбы и профилактики". М., 1987 (утв. 04.09.86) [16].

                     10. Требования безопасности

     Исследования пищевых продуктов на наличие Listeria  monocytogenes
проводят  в  соответствии  с  СанПиН 1.2.731-99 "Безопасность работы с
микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".


                       Библиографический список

     1. Федеральный    закон   "О   санитарно   -   эпидемиологическом
благополучии населения" от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ.
     2. Положение  о  государственной  санитарно  - эпидемиологической
службе Российской Федерации, утвержденное Постановлением Правительства
Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554.
     3. Положение о  государственном  санитарно  -  эпидемиологическом
нормировании,  утвержденное  Постановлением  Правительства  Российской
Федерации от 24 июля 2000 г. N 554.
     4. СанПиН  2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности
и пищевой ценности пищевых продуктов".
     5. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб
для микробиологических исследований".
     6. ГОСТ  26669-85  "Продукты пищевые и вкусовые.  Подготовка проб
для микробиологических анализов".
     7. ГОСТ   26670-91   "Продукты  пищевые.  Методы  культивирования
микроорганизмов".
     8. ГОСТ  10444.1-84 "Консервы.  Приготовление растворов,  красок,
индикаторов,  питательных  сред,  применяемых   в   микробиологическом
анализе".
     9. ГОСТ   9225-84   "Молоко   и   молочные    продукты.    Методы
микробиологического анализа".
     10. ГОСТ  9792-73  "Колбасные  изделия  и  продукты  из  свинины,
баранины,  говядины  и  мяса  других  видов  убойных  животных и птиц.
Правила приемки и методы отбора проб".
     11. ГОСТ  9958-81  "Изделия колбасные и продукты из мяса.  Методы
бактериологического анализа".
     12. ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы микробиологического анализа".
     13. ГОСТ 4288-76 "Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого
мяса. Правила приемки и методы испытания".
     14. ГОСТ   7631-85   "Рыба,   морские   млекопитающие,    морские
беспозвоночные   и   продукты   их   переработки.   Правила   приемки,
органолептические методы  оценки  качества,  методы  отбора  проб  для
лабораторных испытаний".
     15. МУК    4.2.590-96    "Бактериологические    исследования    с
использованием  микробиологического  экспресс  - анализатора "Бак Трак
4100" / Минздрав России. М., 1997.
     16. Методические     рекомендации    "Лабораторная    диагностика
листериоза  животных  и  людей,  меры  борьбы  и  профилактики"  (утв.
Минздравом СССР 04.09.86).
     17. "Инструкция  по  санитарно  -  микробиологическому   контролю
тушек,   мяса   птицы,   птицепродуктов,   яиц   и   яйцепродуктов  на
птицеводческих    и    птицеперерабатывающих    предприятиях"    (утв.
Главветупромом; согл. зам. Главного государственного санитарного врача
СССР 30.08.90).
     18. СанПиН   2.3.4.050-96   "Производство   и  реализация  рыбной
продукции".
     19. СанПиН  2.3.4.545-96  "Производство  хлеба,  хлебобулочных  и
кондитерских изделий".
     20. СанПин   2.3.4.551-96   "Производство   молока   и   молочных
продуктов".
     21. СанПиН 42-123-4423-87 "Нормативы и методы микробиологического
контроля продуктов детского питания,  изготовленных на молочных кухнях
системы здравоохранения".
     22. СанПиН 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III
- IV групп патогенности и гельминтами".
     23. СанПиН   2.3.6.1066-01   "Санитарно   -    эпидемиологические
требования  к  организации торговли и обороту в них продовольственного
сырья и пищевых продуктов".
     24. "Инструкция   по   порядку   и   периодичности   контроля  за
содержанием микробиологических и химических загрязнителей в  молоке  и
молочных  продуктах  на  предприятиях  молочной  промышленности" (утв.
Минсельхозпродом России, согл. Госкомсанэпиднадзором России 29.12.95).
     25. "Санитарные   правила   для   предприятий   пищеконцентратной
промышленности" (утв. Минздравом СССР 01.03.76).
     26. "Ветеринарно  -  санитарные  правила  для предприятий (цехов)
переработки птицы и производства яйцепродуктов" (утв.  Минздравом СССР
06.03.87).
     27. "Инструкция  по   порядку   и   периодичности   контроля   за
содержанием  микробиологических  и  химических  загрязнителей  в мясе,
птице,  яйцах  и  продуктах  их  переработки"  (утв.  Минсельхозпромом
России; согл. Минздравом России 27.06.00).
     28. "Инструкция  по  микробиологическому  контролю   производства
мороженого"   (утв.  ТК  186  по  стандартизации  (молоко  и  молочные
продукты);  согл.  зам.  Главного государственного  санитарного  врача
России 10.03.93).
     29. "Инструкция  по  санитарно  -  бактериологическому   контролю
производства   маргарина   и  майонеза  на  предприятиях  маргариновой
промышленности" (утв. Госагропромом СССР 21.11.88).
     30. "Порядок   санитарно   -   микробиологического  контроля  при
производстве мяса и мясных продуктов"  (утв.  Минсельхозпромом  России
15.12.95).
     31. "Инструкция  по  микробиологическому  контролю   производства
высокостойких  безалкогольных  напитков.  ИК  10-5031536-105-91" (утв.
Госагропромом СССР; согл. Минздравом СССР 28.06.91).
     32. "Инструкция       по       микробиологическому       контролю
быстрозамороженной плодоовощной продукции" (утв.  Госагропромом  СССР;
согл. Минздравом СССР 29.09.89).
     33. МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов
детского, лечебного питания и их компонентов".