МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
ОРГАНИЗАЦИЯ КОНТРОЛЯ И МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ
LISTERIA MONOCYTOGENES В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
МЕТОДИКА
ГЛАВНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНИТАРНЫЙ ВРАЧ РФ
22 апреля 2002 г.
N МУК 4.2.1122-02
(Д)
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
22 апреля 2002 года
Дата введения -
1 июня 2002 года
1. Разработаны Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава
России (Л.Г. Подунова, Э.Ф. Опочинский, Н.С. Кривопалова), ГУ Научно -
исследовательским институтом питания Российской Академии медицинских
наук (В.А. Тутельян, С.А. Шевелева, И.Б. Куваева, Н.Р. Ефимочкина),
Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России (Н.Н. Иванова),
Научно - исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (И.С. Тартаковский, С.А. Ермолаева, Т.С.
Карпова), Центральным научно - исследовательским институтом
эпидемиологии МЗ РФ (Б.Л. Черкасский), Центром госсанэпиднадзора в г.
Москве (Н.Я. Салова, В.П. Голованова), Центром госсанэпиднадзора в
Тульской области (Т.А. Попова), Всероссийским научно -
исследовательским институтом мясной промышленности (Ю.Г. Костенко),
Координационным микробиологическим центром рыбной промышленности
ГИПРОРЫБФЛОТа (Л.Б. Мухина, Е.Ю. Дмитриева), Всероссийским научно -
исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии
(В.М. Котляров).
2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом
Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения
Российской Федерации Г.Г. Онищенко 22.04.02.
3. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие Методические указания устанавливают основные
принципы организации контроля и методику проведения лабораторных
исследований пищевых продуктов по выявлению в них бактерий Listeria
monocytogenes.
При контроле пищевых продуктов на загрязненность патогенными
микроорганизмами в СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к
безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" предусматривается
новый микробиологический показатель "Listeria monocytogenes - не
допускаются" в 25 г продуктов массового назначения и в 50 - 100 г для
продуктов детского и специализированного питания.
Проведение контроля на Listeria monocytogenes позволит получить
реальную картину ситуации в Российской Федерации, оценить степень
загрязненности пищевой продукции и дать оценку эффективности
принимаемых мер в целях обеспечения ее безопасности в плане новых и
вновь возникающих возбудителей инфекций с пищевым путем передачи для
здоровья и жизни человека.
1.2. Методические указания предназначены для применения в
лабораториях учреждений государственной санитарно - эпидемиологической
службы Российской Федерации, осуществляющих контроль за качеством
продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в
Российскую Федерацию, гигиеническую оценку и выдачу санитарно -
эпидемиологических заключений, а также бактериологическую диагностику
заболеваний с пищевым путем передачи; в лабораториях других
организаций, аккредитованных в установленном порядке на право
проведения контроля безопасности пищевой продукции и
продовольственного сырья; в организациях, независимо от форм
собственности, осуществляющих производственный контроль
продовольственного сырья и пищевых продуктов в процессе промышленного
производства и выпуска продукции.
1.3. Методические указания являются обязательными при контроле
пищевых продуктов в ходе проведения противоэпидемических мероприятий
при возникновении вспышек, а также в порядке осуществления санитарно -
эпидемиологического надзора.
1.4. Организация проведения контроля пищевых продуктов на
Listeria monocytogenes.
Лабораторный контроль за отсутствием Listeria monocytogenes в
пищевых продуктах, где нормируется этот показатель, проводится:
в порядке надзора за соблюдением установленных требований в
области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов в ходе
проверок изготовления и оборота пищевой продукции, оказания услуг в
сфере торговли и общественного питания;
при экспертизе продукции и подтверждении соответствия требованиям
нормативных документов для целей гигиенической оценки и выдачи
санитарно - эпидемиологических заключений;
при контроле за безопасностью продукции изготовителем
(производственный контроль);
в ходе проведения противоэпидемических мероприятий и при
эпидрасследовании заболеваний.
1.5. При проведении контроля безопасности по показателю Listeria
monocytogenes согласно Положению о государственной санитарно -
эпидемиологической службе, утвержденному Постановлением Правительства
Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554, должен осуществляться
периодический отбор образцов пищевой продукции.
1.5.1. Порядок контроля и кратность исследований должны
устанавливаться в соответствии с методическими и инструктивными
документами, утвержденными или согласованными в установленном порядке
органами государственной санитарно - эпидемиологической службы
Российской Федерации, при этом необходимо учитывать специфику
производства, степень его эпидзначимости, материально - техническое
оснащение и т.п.
Особого внимания должны заслуживать предприятия, вырабатывающие
продукты детского питания, детские молочные кухни, пищеблоки детских
лечебно - профилактических учреждений, стационаров для онкологических,
гематологических больных, домов ребенка, родильных домов, домов
престарелых и инвалидов и т.п.
При проведении текущего надзора рекомендуемая минимальная
периодичность выборочного лабораторного контроля пищевой продукции
массового потребления - 1 раз в квартал; для детского и диетического
питания - 2 раза.
1.5.2. При производственном контроле организация и периодичность
лабораторных исследований продукции по показателю Listeria
monocytogenes должна устанавливаться изготовителем продукции в
соответствии с действующими санитарными правилами и согласовываться с
учреждениями государственной санитарно - эпидемиологической службы по
месту расположения предприятия - изготовителя.
1.5.3. Контроль пищевых продуктов по показателю Listeria
monocytogenes с целью гигиенической оценки для выдачи санитарно -
эпидемиологических заключений и подтверждения соответствия
установленным требованиям при проведении экспертизы осуществляется в
уполномоченных лабораториях центров госсанэпиднадзора или других
организаций, аккредитованных в установленном порядке.
1.6. В пищевых продуктах, предназначенных для непосредственного
употребления в пищу, в отношении которых отсутствуют
микробиологические нормативы или данные о возможности выделения
Listeria monocytogenes, контроль Listeria monocytogenes не проводится,
однако в случае заболеваний людей и/или нарушений в области
обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов образцы таких
продуктов должны быть направлены на лабораторное исследование.
1.7. Организация лабораторных исследований на Listeria
monocytogenes.
Допускается организация лабораторных исследований путем их
поэтапного выполнения в лабораториях учреждений госсанэпидслужбы
различных уровней. При отсутствии возможности идентификации выделенных
культур последние могут быть переданы в лаборатории, располагающие
соответствующей материально - технической базой и квалифицированным
персоналом, для выдачи окончательного результата.
2. Сущность метода
Методические указания содержат описание метода выявления бактерий
Listeria monocytogenes, основанного на высеве определенного количества
продукта в жидкие селективные среды, инкубировании посевов, выявлении
в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные
колонии на агаризованных дифференциально - диагностических средах.
Принадлежность выделенных культур к Listeria monocytogenes
определяется по биохимическим, морфологическим и другим свойствам.
Метод выявления L. monocytogenes в пищевых продуктах основан на
применении специальных селективных и дифференциально - диагностических
сред. Селективность сред по отношению к сопутствующей микрофлоре
обеспечивается включением в их состав хлорида лития, акрифлавина,
циклогексимида, налидиксиновой кислоты, полимиксина или других
антибиотиков. Внесение эскулина и цитрата аммония железа позволяет
подтверждать наличие листерий по почернению среды за счет гидролиза
эскулина в присутствии ионов Fe+. Подтверждающие тесты родовой и
видовой идентификации включают окраску по Граму, определение
подвижности выделенных на агаризованных средах типичных по
физиологическим и морфологическим признакам культур, их способности
восстанавливать нитраты до нитритов, сбраживать рамнозу, ксилозу и
маннит, способности к гидролизу лецитина на ГРМ-среде с активированным
углем, а также определение наличия В-гемолиза на кровяном агаре и
дифференциацию L. monocytogenes от других гемолизирующих листерий в
САМР-тесте с контрольными штаммами Staphylococcus aureus и Rhodococcus
equi.
При необходимости для выявления L. monocytogenes в пищевых
продуктах проводится постановка реакции нарастания титра фага (РНФ).
Предлагаемый метод обнаружения L. monocytogenes,
гармонизированный с Международным стандартом ISO 11290-111996,
предусматривает определение наличия или отсутствия L. monocytogenes в
нормируемой массе продукта в соответствии с нормативами СанПиН
2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой
ценности пищевых продуктов", выраженными в альтернативной форме и
основанными на существующей системе отбора образцов и оценки
результатов анализа по двухклассной системе.
Методические указания также содержат описание методики
кондуктометрического определения L. monocytogenes в пищевых продуктах
с использованием микробиологического анализатора "Бак Трак". Метод
кондуктометрического анализа основан на регистрации изменений
импеданса - сопротивления питательной среды, которые происходят в
процессе роста и метаболической активности микроорганизмов.
3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда,
реактивы и питательные среды
--------------------------------------------------------------------
| 3.1. Аппаратура и инструментарий |
|------------------------------------------------------------------|
| |НД (ГОСТ, ТУ) |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Анализатор потенциометрический, | |
|погрешность измерений pH +/- 0,01 |ГОСТ 19881-74 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П | |
|или других марок, позволяющий | |
|поддерживать температуру (160 +/- 5) ЬC |ТУ 64-1-28-70-76 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Термостат, позволяющий поддерживать | |
|рабочую температуру 37 ЬC с отклонением | |
|от заданной +/- 1 ЬC |ТУ 64-1-1382-72 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Баня водяная с подогревом |ГОСТ 12026-76 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4| |
|класса точности, с наибольшим пределом | |
|взвешивания 200 г |ГОСТ 24104-88 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, | |
|МБИ-3, МБР-1, МБР-3, МБС |ГОСТ 8284-78 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Стерилизаторы паровые медицинские или | |
|аналогичные |ГОСТ 19569-89 Е |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Дистиллятор, обеспечивающий качество | |
|дистиллированной воды в соответствии с |ГОСТ 6709-72 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Гомогенизатор перистальтического типа | |
|"Стомайкер" или других наименований | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150| |
|или других видов |ТУ 16-535-84 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Холодильник бытовой электрический | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Пинцет медицинский |ГОСТ 21241-89 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Ножницы медицинские |ГОСТ 21239-89 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Скальпель хирургический, 15 см |ГОСТ 21240-89 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Штативы для пробирок | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Часы механические сигнальные |ГОСТ 3145-84 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Электроплитка |ГОСТ 14919-83 |
|------------------------------------------------------------------|
| 3.2. Лабораторная посуда и материалы |
|------------------------------------------------------------------|
|Бумага фильтровальная лабораторная |ГОСТ 12026-76 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Бутылки стеклянные для химических | |
|реактивов | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Кастрюли эмалированные |ГОСТ 24778-81 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Марля медицинская |ГОСТ 9412-77 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Колбы плоскодонные конические или круглые | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|разной вместимости |ГОСТ 1770-74 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Воронки стеклянные |ГОСТ 25336-82 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Вата медицинская гигроскопическая |ГОСТ 5556-81 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см |ГОСТ 29227-91 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Полистироловые планшеты U-образные | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Пробирки Уленгута (поплавки) | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Пробирки типов П1, П2 |ГОСТ 25336-82 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Стекла предметные для микропрепаратов |ГОСТ 6672-75 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Спиртовки лабораторные стеклянные |ГОСТ 23932-90 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Ступка фарфоровая с пестиком |ГОСТ 9147-80 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Термометр ртутный с диапазоном измерения | |
|от 0 до 100 ЬC (цена деления шкалы 1 ЬC) |ГОСТ 13646-68 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Чашки биологические (Петри) |ГОСТ 23932-90 |
|------------------------------------------------------------------|
| 3.3. Реактивы и питательные среды |
|------------------------------------------------------------------|
| |НД (ФС, ТУ), |
| |фирма - изготовитель |
|------------------------------------------------------------------|
| 3.3.1. Реактивы, компоненты сред |
|------------------------------------------------------------------|
|Агар микробиологический |ГОСТ 17206-84 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Вода дистиллированная |ГОСТ 6709-72 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|D-глюкоза, ч. |ГОСТ 6038-79 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|D-лактоза, 1-водная |ТУ 6-09-22-98-79 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Маннит | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Ксилоза | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Рамноза | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Калия гидроокись |ГОСТ 24363-80 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч. |ГОСТ 4198-75 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Калий фосфорнокислый двузамещенный, | |
|3-водный |ГОСТ 2493-75 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Кислота соляная, х.ч. |ГОСТ 3118-77 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Литий хлористый, ч. или х.ч., или ч.д.а. |ГОСТ 4328-77 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Масло иммерсионное для микроскопии |ГОСТ 31739-78 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Набор реактивов для окраски по Граму | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Натрий-аммоний фосфорнокислый | |
|двузамещенный, 4-водный, ч. или х.ч. |ГОСТ 4170-78 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Натрия гидроокись, ч.д.а. |ГОСТ 4328-77 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Натрий лимоннокислый, 5,5-водный, ч.д.а. |ГОСТ 22280-75 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Натрий хлористый, ч. или х.ч., или ч.д.а. |ГОСТ 4233-77 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Пара-диметиламидобензальдегид, ч. |ТУ 6-09-3272-77 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Пептон сухой ферментативный для | |
|бактериологических целей |ГОСТ 13805-76 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Полимиксин "М" или "В" сульфат по | |
|500000 ед. (медпрепарат) | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Спирт этиловый ректификованный | |
|технический |ГОСТ 18300-87 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Спирт этиловый ректификованный |ГОСТ 5962-67 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Железа аммонийного цитрат | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Феноловый красный |ГОСТ 5853-51 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Фенолфталеин |ГОСТ 5850-72 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Фуксин основной |ТУ 6-09-4119-75 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Хлороформ технический |ГОСТ 2-15-76-72 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Уксусная кислота |ГОСТ 61-75 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Сульфаниловая кислота | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|А-нафтол | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Цинк порошкообразный |ГОСТ 3640 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Эскулин | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Экстракт дрожжевой сухой | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Лития хлорид | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Уголь активированный |Р.72.270.3 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Желток куриного яйца | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Крахмал | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Налидиксовая кислота |Lab M, HiMedia |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Акрифлавина гидрохлорид (трипафлавин) |Lab M, HiMedia |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Цефтазидим | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Циклогексимид | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Тест - штаммы Listeria monocytogenes, | |
|Listeria ivanovii, Listeria innocua, | |
|Staphylococcus aureus, Rhodococcus equi, | |
|типичные по культуральным, морфологическим| |
|и биохимическим свойствам | |
|------------------------------------------------------------------|
| 3.3.2. Среды питательные |
|------------------------------------------------------------------|
| 3.3.2.1. Для культивирования изолятов |
|------------------------------------------------------------------|
|Триптозный ГРМ-агар и ГРМ-бульон |ФС42-3377-97 |
| |(ГНЦ ПМ) |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Среда ГРМ N 1 |ВФС 42-2988-97 |
| |(ГНЦПН) |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Питательный бульон и питательный агар |ТУ 10-02-02-789-176-94 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Триптон - соевый агар с дрожжевым | |
|экстрактом (TSYEA) |HiMedia M1214 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Триптон - соевый бульон с дрожжевым | |
|экстрактом (TSYEB) |HiMedia M1263 |
|------------------------------------------------------------------|
| 3.3.2.2. Среды селективного обогащения |
|------------------------------------------------------------------|
|Бульон Фрейзера (Fraser Broth) |BioMerieux 42046 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Бульон Фрейзера половинной концентрации | |
|(Half Fraser Broth) |BioMerieux 42048 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Fraser Broth Base, Fraser Supplement, | |
|Fraser Selective Supplement |HiMedia M1327, |
| |FD 141, FE1251 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Бульон для обогащения Listeria Enrichment | |
|Broth |Merck 1.10549, |
| |HiMedia M569 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Бульон вторичного обогащения для листерий | |
|- Fraser Secondary Enrichment Broth Base |HiMedia M1083 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Селективный бульон для листерий - | |
|Listeria Selective Broth Base |HiMedia M889 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Среды Pre-Media 403A и BiMedia 401A, | |
|402A, 403A |Lab M |
|------------------------------------------------------------------|
| 3.3.2.3. Дифференциально - диагностические |
| селективные среды |
|------------------------------------------------------------------|
|PALCAM - Listeria Selective Agar Base с | |
|селективной добавкой 1.12122 |Merck 1.1 1755 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|PALCAM-агар - селективная среда для | |
|выделения листерий |BioMerieux 43559 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Агар для идентификации листерий - | |
|Listeria Identification Agar Base | |
|(PALCAM) |HiMedia M1064 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Oxford - агар - селективная среда для | |
|выделения листерий |BioMerieux 43 560 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Listeria Oxford Medium Base и Oxford | |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Listeria Supplement |HiMedia M1 145, |
| |FD 071 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Среды Гисса с маннитом, ксилозой, рамнозой|ФС (ЦНИИВС |
| |им. И.И. Мечникова, |
| |НИИ питательных сред) |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Среда для определения подвижности | |
|листерий (Listeria motility medium) |HiMedia M1215 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|SIM-агар (сероводород-индол - подвижность)|Difco |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Blood Agar Base - основа кровяного агара |HiMedia M073 |
|------------------------------------------|-----------------------|
|Тест - системы биохимические для видовой | |
|идентификации API Listeria |BioMerieux |
--------------------------------------------------------------------
Допускается использование других коммерческих питательных сред
диагностических препаратов аналогичного назначения для проведения
исследований в соответствии с данным документом. При их применении
следует руководствоваться рекомендациями изготовителя.
Питательные среды и биологические препараты импортного
производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000
или EN 29 000. Питательные среды и препараты отечественного
производства должны вырабатываться по нормативной документации,
утвержденной в установленном порядке.
4. Подготовка к анализу
4.1. Приготовление растворов и реактивов
4.1.1. Пептонно - солевой раствор - по ГОСТ 26669.
4.1.2. Изотонический (0,85%-ный водный) раствор хлорида натрия -
по ГОСТ 26669.
4.1.3. Растворы и реактивы для постановки реакции нитратредукции
- по ГОСТ 10444.8-99.
4.1.4. Приготовление растворов и реактивов для окраски препаратов
по Граму - по ГОСТ 10444.1 или в соответствии с инструкцией по
применению.
4.1.5. Раствор перекиси водорода для определения каталазы 3%-ный
- по ГОСТ 30425.
4.2. Приготовление питательных сред
Среды промышленного изготовления, поименованные в п. 3.3.2,
готовятся согласно прописям на этикетке или в соответствии с
рекомендациями фирмы.
Допускается применение сред лабораторного приготовления по п. п.
4.2.1- 4.2.10.
Приготовление питательных сред Pre-Media 403A и BiMedia 401A,
402A, 403A для определения листерий проводят в соответствии с МУК
4.2.590-96 "Бактериологические исследования с использованием
микробиологического экспресс - анализатора "Бак Трак 4100".
4.2.1. Питательный агар с 1% глюкозы и питательный бульон с 1%
глюкозы (МПА с 1% глюкозы, МПБ с 1% глюкозы) готовят в соответствии с
ГОСТ 10444.1.
4.2.2. Триптон - соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB) /
триптон - соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA)
Состав среды (г/л): ферментативный гидролизат казеина - 17,0;
пептон соевый - 3,0; натрий хлористый - 5,0; фосфат калия
однозамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 6,0; агар
микробиологический (для TSYEA) - 15,0.
Компоненты растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды,
тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2 и автоклавируют
при 121 ЬC в течение 15 мин.
4.2.3. Среды селективного обогащения типа бульона Фрейзера
Приготовление основы среды (г/л): ферментативный гидролизат
казеина - 5,0; пептон - 5,0; мясной экстракт - 5,0; дрожжевой экстракт
- 5,0; натрий хлористый - 20,0; калия дигидрофосфат - 1,35; натрия
гидрофосфат - 12,0; эскулин - 1,0; литий хлористый - 3,0; железа
аммонийного цитрат - 0,25 растворяют в 1000 куб. см дистиллированной
воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,2 +/- 0,2 и
автоклавируют при 121 ЬC 15 мин.
Перед употреблением в основу среды вносят асептический раствор
селективных компонентов следующего состава:
4.2.3.1. Для приготовления среды типа бульона Фрейзера первичного
обогащения <*>: налидиксовой кислоты - 10 мг, акрифлавина гидрохлорид
- 12,5 мг растворить в 10 куб. см стерильного 0,2 N гидроксида натрия.
--------------------------------
<*> Допускается при приготовлении среды типа бульона Фрейзера
первичного обогащения готовить основу среды без добавления эскулина и
цитрата железа аммонийного.
4.2.3.2. Для приготовления среды типа бульона Фрейзера вторичного
обогащения: налидиксовой кислоты - 20 мг, акрифлавина гидрохлорид - 25
мг растворить в 10 куб. см стерильного 0,2 N гидроксида натрия.
Готовые среды разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят
в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 ЬC.
4.2.4. PALCAM-агар (полимиксин-акрифлавин-лития
хлорид-цефтазидим-эскулин-маннитол-агар) - селективная дифференциально
- диагностическая среда для выделения листерий
Приготовление основы среды (г/л): пептон мясной ферментативный -
23,0; дрожжевой экстракт - 3,0; крахмал - 1,0; натрия хлорид - 5,0;
эскулин - 0,8; лития хлорид - 15,0; железа аммония цитрат - 0,5;
глюкоза - 0,5; маннит - 10,0; феноловый красный - 0,08; агар - 15,0
растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно
перемешивают, устанавливают pH 7,0 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 ЬC
15 мин.
К стерильной расплавленной основе среды добавляют асептически
раствор селективных компонентов следующего состава: акрифлавин -
0,005; полимиксин "В" - 100000 ед.; цефтазидим - 0,02 в 10 куб. см
стерильной дистиллированной воды.
Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят в
защищенных от света условиях при температуре не выше 8 ЬC.
4.2.5. Селективная дифференциально - диагностическая среда для
выделения листерий типа Оксфорд - агара
Приготовление основы среды (г/л): пептон мясной ферментативный -
23,0; крахмал кукурузный - 1,0; натрия хлорид - 15,0; эскулин - 1,0;
лития хлорид - 15,0; железа аммония цитрат - 0,5; глюкоза - 0,5; агар
- 15,0 растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно
перемешивают, устанавливают pH 7,0 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 ЬC
15 мин.
К стерильной расплавленной основе среды добавляют асептически
раствор селективных компонентов следующего состава: акрифлавина
гидрохлорид - 0,005; циклогексимид - 0,4, колистина сульфат <*> -
0,02, цефатетан <*> - 0,002, фосфомицин <*> - 0,01 мг в 10 куб. см
50%-ного этилового спирта.
--------------------------------
<*> Допускается замена комплекса перечисленных антибиотиков на
полимиксин в количестве 500000 ед. на 1 л.
Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят в
защищенных от света условиях при температуре не выше 8 ЬC.
4.2.6. Кровяной агар
К растопленному и охлажденному до 45 - 50 ЬC питательному агару с
1% глюкозы (п. 4.2.1) добавляют 5% по объему дефибринированной крови
животных. Разливают в чашки Петри диаметром 90 мм по 15 куб. см среды
и подсушивают при 37 ЬC.
Засев производят в теплые чашки.
4.2.7. Питательный агар с эритроцитами барана
Дефибринированную или стабилизированную цитратом кровь барана
центрифугируют в асептических условиях 30 мин. при 900 об./мин.
Надосадочную жидкость сливают. Осадок суспендируют в стерильном
физиологическом растворе до первоначального объема, добавляют в
количестве 5% по объему к растопленному и охлажденному до 45 - 50 ЬC
питательному агару (п. 4.2.1). Разливают в чашки Петри по 10 куб. см,
подсушивают при 37 ЬC. Чашки используют для посева теплыми.
4.2.8. Среда для определения подвижности
20 г гидролизата казеина ферментативного, 6 г пептона мясного
ферментативного и 5 г агара растворяют в 1000 куб. см дистиллированной
воды, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2, разливают в пробирки по 5 - 7 куб.
см и автоклавируют при 121 ЬC 15 мин.
4.2.9. Среды Гисса по ГОСТ 10444.1 с маннитом, рамнозой, ксилозой
10 г пептона ферментативного и 5 г натрия хлористого растворяют в
1000 куб. см дистиллированной воды и добавляют 10 г соответствующего
углевода. Устанавливают pH 7,1 +/- 0,1, вносят 10 мл индикатора
Андреде (также возможно использование индикатора бромкрезолового
пурпурного, "ВР" и др.), разливают в пробирки и стерилизуют при 112 ЬC
в течение 20 мин.
4.2.10. Среда для определения лецитиназной активности листерий
К среде ГРМ N 1 перед стерилизацией добавляют активированный
уголь, растертый до порошкообразного состояния, до концентрации 0,5%
(вес / объем). Желток куриного яйца разводят в 150 мл физиологического
раствора и добавляют 5% по объему к стерилизованному и охлажденному до
40 - 50 ЬC питательному агару. Разливают в чашки Петри по 20 куб. см и
подсушивают при 37 ЬC. Аналогично готовят среду с добавлением желтка,
но без добавления активированного угля.
5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа
5.1. Общие положения по отбору и подготовке проб
Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с
ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для микробиологических анализов",
ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для
микробиологических анализов", МУК 4.2.577-96 "Методы
микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и
их компонентов", ГОСТ Р 51446 (ИСО 7218-96), а также в соответствии с
действующими ГОСТ и НД на конкретные виды продуктов.
Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для
проведения исследования и минимально вдвое превышать аналитический
образец. Из точечных проб составляют навеску массой 25 +/- 0,1 г (50 -
100 г - для продуктов детского, лечебного и специализированного
питания).
От продукции в потребительской таре в мелкой фасовке пробы
отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от
массы или объема потребительской тары, с тем чтобы количество было
достаточным для проведения анализа.
От продукции в транспортной или потребительской таре больших
размеров или неупакованной пробы отбирают из разных мест с различной
глубины, включая поверхность.
Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб на
физико - химические и органолептические анализы стерильным
инструментом в стерильную посуду. При этом от образца отбирают
несколько точечных проб из разных мест, которые измельчают и
перемешивают, из них составляют навеску 25 г.
Замороженные продукты предварительно размораживают до температуры
внутри продукта 0 - (-1) ЬC; продукты, содержащие жиры (сливочное
масло, мороженое), нагревают до температуры 40 - 45 ЬC и перемешивают.
Отобранные образцы перемешивают и измельчают или доводят до
однородной консистенции по ГОСТ 26669, из измельченной суспензии
составляют навеску необходимой массы.
При посевах высококислотных или щелочных (с pH < 6 или > 7,5)
жидких и твердых продуктов для предотвращения снижения pH питательных
сред на 0,5 и более pH продукта перед посевом доводят до 7,0 +/- 0,2
по ГОСТ Р 50480.
5.2. Отбор и подготовка проб молока, молочных продуктов,
сыров, мороженого
Отбор и подготовку проб продуктов проводят согласно ГОСТ 3622-68
"Молоко и молочные продукты. Отбор и подготовка их к испытанию" и
9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического
анализа".
Кисломолочные продукты, сыр, творог, творожные изделия и
пастообразные продукты тщательно измельчают с помощью гомогенизаторов
перистальтического типа или ножевых и подвергают нейтрализации, масло
сливочное и мороженое растапливают до сметанообразной консистенции.
5.3. Отбор и подготовка проб мяса,
мясных полуфабрикатов, мяса птицы и птицепродуктов,
колбасных изделий и других мясопродуктов
Отбор и подготовку проб мяса, субпродуктов, мясных
полуфабрикатов, колбасных изделий и других мясных продуктов проводят
по ГОСТ 21237 "Мясо. Методы бактериологического анализа", ГОСТ 4288
"Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого мяса", ГОСТ 9958,
ГОСТ 9792 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины
и мяса других видов убойных животных и птиц".
Массу навески отбирают в соответствии с п. 6.1.
Отбор и подготовку проб мяса птицы, субпродуктов и птичьих
полуфабрикатов проводят по ГОСТ Р 50396.0 "Мясо птицы, субпродукты и
полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к
микробиологическим исследованиям".
5.4. Отбор и подготовка проб плодоовощной продукции
Отбор и подготовку к анализу проб плодоовощной продукции проводят
согласно ГОСТ 26668, ГОСТ 26669, ГОСТ 26313 "Продукты переработки
плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб", кроме
подготовки к анализу проб поверхностно - контаминированных и
пюреобразных продуктов. Для поверхностно - контаминированной и
быстрозамороженной плодоовощной продукции подготовку проводят согласно
"Инструкции по микробиологическому контролю быстрозамороженной
плодоовощной продукции" (МЗ СССР, 29.09.89, прил. 1, п. 1.3). Для
анализа поверхностно - контаминированной продукции готовят суспензию
добавлением к навеске массой (100 +/- 30) г, отобранной из трех единиц
тары или фасовки, 0,1%-ного пептонно - солевого раствора в количестве,
равном массе навески. При этом 1 куб. см полученной суспензии
оценивают как 1 г (куб. см) продукта.
Из измельченных плодов, овощей, полуфабрикатов и пюреобразных и
жидких отбирают раздельно навески массой по (100 +/- 30) г из трех
единиц тары или фасовки и готовят объединенную пробу массой в
соответствии с п. 6.1.
5.5. Отбор и подготовка проб рыбы, нерыбных объектов
промысла и продуктов, вырабатываемых из них
Отбор и подготовку проб проводят согласно "Инструкции по
санитарно - микробиологическому контролю производства пищевой
продукции из рыбы и морских беспозвоночных" N 5319-91 от 22.02.91 и
ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и
продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы
оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний".
Отбор проб свежей, охлажденной и мороженой рыбы проводят от 2
точечных образцов, мышечная ткань в которых составляет не менее 25 г
по ГОСТ 7631-85. Из каждой точечной пробы стерильным инструментом
вырезают спинные мышцы с кожей, перемешивают и отвешивают 25 г, затем
измельчают с помощью гомогенизаторов перистальтического типа или
ножевых и гомогенизируют в 225 куб. см среды накопления.
5.6. Продукты детского, лечебного питания
и их компоненты
Отбор и подготовку проб продуктов детского, лечебного питания и
их компонентов проводят согласно МУК 4.2.577-96 "Методы
микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и
их компонентов".
Отобранные пробы продуктов перед исследованием тщательно
перемешивают, кисломолочные продукты нейтрализуют (на 10 куб. см/г
исследуемого продукта или его первого разведения для сухих
кисломолочных продуктов, напитка или закваски добавляют 1,0 куб. см
стерильного раствора двууглекислого натрия с массовой концентрацией
100 г/куб. см). Сыр, творог, творожные изделия и пастообразные
продукты тщательно измельчают и нейтрализуют. Топленое масло или
молочный жир расплавляют при температуре 40 - 45 ЬC и перемешивают до
получения однородной эмульсии.
6. Проведение анализа
6.1. Подготовленную в соответствии с п. 5. навеску исследуемого
продукта (гомогената, смыва с поверхности) в количестве 25 г (куб. см)
вносят в одну из сред для первичного обогащения в количестве 225 куб.
см (по п. п. 3.3.2.2, 4.2.3.1). При необходимости анализа других масс
продукта их посев проводят в среду также в соотношении 1:9 по объему.
Посевы термостатируют при 37 ЬC в течение (24 +/- 2) ч. При росте
листерий на средах предобогащения, содержащих эскулин и цитрат железа,
аммонийного, наблюдается почернение среды за счет гидролиза гликозида
эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа,
образуя комплекс черного или оливкового цвета. На других средах
почернения не отмечается.
6.2. После термостатирования продукта в среде для первичного
обогащения 0,1 куб. см суспензии пересевают в 10 куб. см одной из
жидких сред для вторичного обогащения по п. п. 3.3.2.2, 4.2.3.2.
Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) ЬC в течение 48 ч. В
средах с эскулином отмечают почернение как признак возможного
присутствия бактерий рода Listeria.
6.3. Из пробирок после термостатирования, независимо от наличия
или отсутствия признаков роста, и в т.ч. почернения, делают пересев по
0,1 куб. см на поверхность двух чашек Петри с одной из агаризованных
дифференциально - диагностических сред по п. п. 3.3.2.3, 4.2.4, 4.2.5.
Посевной материал растирают стерильным шпателем. Допускается проводить
пересев петлей штрихом. Чашки со средами предварительно подсушивают.
Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) ЬC в течение 24
- 48 ч.
6.4. Проведение анализа без этапа вторичного обогащения
При посеве продуктов с низким исходным уровнем микробной
контаминации и при отсутствии признаков роста в жидкой среде
(помутнение, почернение и др.) допускается проводить пересев на чашки
с агаризованными дифференциально - диагностическими средами сразу
после этапа первичного обогащения по п. 6.2.
6.5. При отсутствии роста на чашках с дифференциально -
диагностическими средами типа Оксфордского агара и PALCAM-агара анализ
прекращают и дают заключение об отсутствии L. monocytogenes в
исследованной пробе продукта.
6.6. При обнаружении характерного роста на чашках отбирают 3 - 5
колоний для их дальнейшего изучения.
На средах типа PALCAM-агара через 24 ч инкубирования листерии
формируют мелкие, серовато - зеленые или оливково - зеленые колонии с
черным ореолом, диаметром 0,5 - 1,0 мм, иногда с черным центром. Через
48 ч колонии диаметром 1,0 - 2,0 мм приобретают зеленую окраску с
углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Кокковая микрофлора
(бактерии родов Staphylococcus, Enterococcus) образует желтые колонии
за счет ферментации маннита.
На Оксфордском агаре (Oxford - agar) листерии, выращенные в
течение 24 ч, - мелкие (1 мм), сероватые, окруженные черным ореолом.
Через 48 ч - более темные, около 2 мм в диаметре, с черным ореолом и
углубленным центром.
При появлении сплошного роста листерий производят пересев
бактериологической петлей из зон наибольшего почернения среды штрихами
на 2 - 3 чашки Петри с селективной дифференциально - диагностической
питательной средой (Оксфордский или PALKAM-агар) для получения
изолированных колоний. Посевы термостатируют аналогично п. 6.3.
6.7. Отобранные характерные колонии, подозрительные на
принадлежность к Listeria monocytogenes, пересевают на среды: МПА с 1%
глюкозы (п. 4.2.1), триптон - соевый агар с дрожжевым экстрактом
(TSYEA) по п. 3.3.2.1 или 4.2.2 для получения изолированных колоний,
которые подвергают дальнейшему изучению.
Посевы термостатируют при температуре 30 ЬC в течение 24 ч.
6.8. Идентификация выделенных культур
Для определения принадлежности выделенных микроорганизмов к роду
Listeria полученные на средах культивирования чистые культуры
микроскопируют по Граму, определяют наличие у них каталазы,
подвижность при двух температурах инкубирования - 22 и 37 ЬC,
способность к ферментации маннита и ставят реакцию нитрат - редукции.
6.8.1. Окраска по Граму
Бактерии рода Listeria являются грамположительными тонкими
короткими палочками, спор не образуют.
6.8.2. Каталазную активность культур определяют в соответствии с
ГОСТ 30425 по способности каталазы разлагать перекись водорода с
выделением пузырьков газа. Реакцию ставят с охлажденной до комнатной
температуры суточной культурой на стерильном предметном стекле.
Изолированную колонию, взятую с поверхности питательной среды,
растирают на стекле и пипеткой наносят каплю 3%-ного раствора перекиси
водорода. Если через 30 - 60 с на стекле появляются пузырьки газа, то
считают результаты реакции положительными. Параллельно ставят
контрольную пробу.
Бактерии рода Listeria являются каталазоположительными.
6.8.3. Подвижность культур определяют посевом уколом в среды по
п. п. 3.3.2.3 и 4.2.8 и инкубированием при двух температурах - 25 и 37
ЬC в течение 48 - 72 ч.
Бактерии рода Listeria подвижны при 20 - 25 ЬC (образуют
характерный рост вокруг линии укола, похожий на зонтик) и неподвижны
(или слабоподвижны) при 35 - 37 ЬC.
6.8.4. Для определения способности сбраживать углеводы культуры
пересевают на пестрый ряд в среды Гисса по п. п. 3.3.2.3 или 4.2.9.
Посевы термостатируют 7 дней при 37 ЬC, наличие ферментативной
активности в отношении углеводов определяют по изменению окраски сред
за счет образования кислоты.
Большинство бактерий рода Listeria не утилизируют маннит (за
исключением L. grayi и L. grayi subsp. murrayi).
6.8.5. Постановку реакции нитрат - редукции проводят по ГОСТ
10444.8-88. Бактерии рода Listeria не восстанавливают нитраты до
нитритов (за исключением L. grayi и L. grayi subsp. murrayi).
Обнаружение в посевах грамположительных коротких тонких палочек,
каталазоположительных, не восстанавливающих нитраты до нитритов, не
утилизирующих маннит, подвижных при 25 ЬC и неподвижных при 37 ЬC
указывает на принадлежность выделенных на дифференциально -
диагностических средах культур с характерной морфологией к роду
Listeria.
Для подтверждения принадлежности выделенных листерий к виду L.
monocytogenes определяют способность к ферментации рамнозы, ксилозы,
наличие лецитиназной и бета - гемолитической активности и проводят
постановку КАМП-теста (CAMP-test). Дифференцирующие признаки видов
рода Listeria указаны в табл. 1.
Таблица 1
----------------------------------------------------------------------------------------------
| Признак |L. monocytogenes|L. ivanovii|L. seeligeri|L. innocua|L. grayi|L. welshimeri|
| | | | | | | |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
|Ферментация: | | | | | | |
| маннита | - | - | - | - | + | - |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
| ксилозы | - | + | + | - | - | + |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
| рамнозы | + | - | - | +/- | +/- | +/- |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
|Бета - | | | | | | |
|гемолиз | + | + | + | - | - | - |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
|КАМП-тест | | | | | | |
|(CAMP-test). | | | | | | |
|Усиление | | | | | | |
|гемолиза | | | | | | |
|около штриха: | | | | | | |
| Rhodococcus | | | | | | |
| equi | - | + | - | - | - | - |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
| Staphylococcus | | | | | | |
| aureus | + | - | + | - | - | - |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
|Лецитиназная | | | | | | |
|активность: | | | | | | |
| на среде с | | | | | | |
| активированным | | | | | | |
| углем | + | + | - | - | - | - |
|----------------|----------------|-----------|------------|----------|--------|-------------|
| на среде | | | | | | |
| без угля | - | + | - | - | - | - |
----------------------------------------------------------------------------------------------
Для видовой дифференциации выделенных культур листерий
допускается использовать биохимические тест - системы API Listeria
фирмы "BioMerieux". При их применении следует руководствоваться
рекомендациями изготовителя.
6.8.6. Наличие способности ферментировать рамнозу и ксилозу -
определяют аналогично п. 6.8.4. Бактерии L. monocytogenes утилизируют
рамнозу с образованием кислоты и не утилизируют ксилозу.
6.8.7. Бета - гемолитическую активность исследуемых культур
определяют по образованию зон просветления за счет растворения
эритроцитов вокруг колоний при посеве на поверхность кровяного агара,
приготовленного с добавлением стерильной дефибринированной крови
барана или кролика. Посевы на кровяном агаре (п. п. 3.3.2.3, 4.2.6)
термостатируют при 37 ЬC в течение 24 ч.
Listeria monocytogenes обладают бета - гемолитической активностью
(образуют узкие четкие зоны просветления вокруг колоний).
6.8.8. Постановку КАМП-теста проводят для дифференциации L.
monocytogenes от других видов листерий, обладающих гемолитической
активностью.
Для проведения теста 2 - 3-суточные культуры геополитических
штаммов Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi засевают на кровяной
агар с эритроцитами барана двумя параллельными штрихами на расстоянии
5,0 - 5,5 см, как показано на рис. 1 <*>.
--------------------------------
<*> Не приводится.
Между вертикальными штрихами St. aureus и Rh. equi засевают
параллельными штрихами исследуемые культуры листерий на расстоянии
друг от друга не менее 1 см и от вертикальных штрихов - 0,5 см. В
качестве контрольных используют тест - штаммы L. monocytogenes и L.
ivanovii. Инкубацию проводят 24 ч при 37 ЬC. Отмечают форму и размеры
зон гемолиза около вертикальных штрихов роста стафилококка и
родококка.
Listeria monocytogenes дает расширение зоны гемолиза около штриха
St. aureus (положительный КАМП-тест) и имеет отсутствие изменений зоны
гемолиза рядом со штрихом Rh. equi (отрицательный КАМП-тест).
6.8.9. Для определения лецитиназной активности дно двух чашек
Петри со средой ГРМ N 1, содержащих: 1 чашка - желток куриного яйца и
активированный уголь, 2 чашка - желток куриного яйца без
активированного угля - делят на несколько секторов или квадратов,
исследуемые культуры и контрольные штаммы листерий пересевают
параллельно короткими штрихами на соответствующие секторы чашек,
содержащих и не содержащих уголь. Инкубируют 48 ч при 37 ЬC. Чашки
просматривают в проходящем свете и определяют наличие активности в
присутствии и в отсутствие активированного угля, сравнивая с
контрольными высевами музейных штаммов. Listeria ivanovii дает плотную
зону помутнения шириной 3 - 6 мм независимо от присутствия
активированного угля. Listeria monocytogenes дает аналогичную зону
помутнения в присутствии активированного угля и не дает при отсутствии
угля. Другие виды листерий не дают зоны помутнения.
6.9. Учет результатов
Результат оценивают по каждой исследованной пробе отдельно. В
образце продукта констатируют присутствие Listeria monocytogenes, если
при посеве на селективные среды выделены короткие неспорообразующие
грамположительные па ломки, каталазоположительные, подвижные при 25 ЬC
и неподвижные при 37 ЬC, утилизирующие эскулин, сбраживающие с
образованием кислоты рамнозу и не сбраживающие маннит и ксилозу, не
восстанавливающие нитраты до нитритов, обладающие бета -
гемолитической активностью, дающие положительную реакцию в КАМП-тесте
со Staphylococcus aureus и отрицательную - с Rhodococcus equi,
проявляющие лецитиназную активность на среде ГРМ N 1 с добавлением
желтка куриного яйца и в присутствии активированного угля.
Результаты выявления Listeria monocytogenes в определенной
навеске продукта записывают: "Listeria monocytogenes обнаружены в 25 г
(куб. см) (в 50 - 100 г - для продуктов детского, лечебного и
специализированного питания) продукта" или "Listeria monocytogenes не
обнаружены в 25 г (куб. см) (в 50 - 100 г - для продуктов детского,
лечебного и специального питания) продукта".
Результат оценивают по каждой пробе отдельно.
7. Проведение исследования с использованием
кондуктометрического анализатора "Бак Трак"
7.1. Предварительное обогащение - 1 этап
Для предварительного обогащения используется среда Pre-Media
403A.
Необходимое количество продукта, в котором регламентируется
отсутствие L. monocytogenes, смешивают со средой Pre-Media 403A в
соотношении 1/10, затем образец гомогенизируют и инкубируют в течение
24 ч.
7.2. Обогащение - 2 этап
Для обогащения используют одну из сред: BiMedia 401A, BiMedia
402A, BiMedia 403A.
Среду BiMedia 403A (401A, 402A) оставляют уравновеситься при
комнатной температуре в течение 12 ч. Устанавливают температуру 37 ЬC
на приборе "Бак Трак".
В основном меню программы "Бак Трак" устанавливают следующие
параметры.
Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters)
Время исследований (Duration) 36 ч
Масштаб измерений (Scale)
М-параметр 0 - 20%
Е-параметр 0 - 80%
Время задержки (Delay) 1 ч
Пороговые значения (Thresholds)
М-параметр 5%
Е-параметр 15%
Проводить учет результатов по Е-параметру
Пороговое значение по времени (Time limit) 30 ч
Добавляют в каждую измерительную ячейку по 10 куб. см среды
BiMedia и вносят по 0,1 куб. см предобогащенного образца, тщательно
перемешивают содержимое, вращая ячейку между ладонями (не
переворачивая).
Для контроля среды используют одну измерительную ячейку с 10 куб.
см среды BiMedia (без инокулята).
Выбирают в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start
Measurement) и начинают измерения.
После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как
свободная на экране монитора, измерительные ячейки помещают в прибор
"Бак Трак". Измерение начинается автоматически через 1 ч после
загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения
изменения импеданса (IDT) записываются автоматически.
Учет результатов
Образец загрязнен листериями, если изменение импеданса превышает
15%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 30 ч.
Подтверждение Listeria - позитивных образцов. В случае
положительного ответа на листерии проводится подтверждение роста и
идентификация до L. monocytogenes с высевом на селективные питательные
среды в соответствии с п. п. 6.3 - 6.8. Высев производится
непосредственно из измерительной ячейки.
Выросшие культуры подвергают идентификации по п. 6.8.
Учет результатов и выдача ответа - по п. 6.9.
8. Выявление Listeria monocytogenes в реакции
нарастания титра фага (РНФ)
РНФ может быть использована в качестве дополнительного метода для
обнаружения L. monocytogenes в пищевых продуктах (при проведении
противоэпидемических мероприятий и при эпидрасследовании).
Реакция нарастания титра фага - быстрый специфический метод
обнаружения листерий, обеспечивающий выявление возбудителя в
исследуемом материале без выделения культуры.
РНФ основана на свойстве индикаторного бактериофага строго
специфично размножаться в клетках гомологичного микроба. Размножение
бактериофага сопровождается увеличением количества его частиц и
повышением титра.
8.1. В реакции применяют листериозные бактериофаги L2A и L4A.
Штаммы L. monocytogenes - I (9 - 127) и II (9 - 72) серогрупп.
Питательные среды, содержащие 0,5% глюкозы: мясопептонный бульон,
1,5%-ный и 0,7%-ный мясопептонный агар.
8.2. При постановке РНФ с пробами пищевых продуктов отвешивают 25
г исследуемого материала, измельчают, помещают в колбу емкостью 1000
куб. см и добавляют 250 куб. см МПБ. Смесь в течение 5 - 10 мин.
встряхивают, затем 9 куб. см переносят в бактериологическую пробирку N
1 (опыт).
8.3. Бактериофаги используют в рабочем разведении (10000 фаговых
корпускул в 1 куб. см). Для этого их растворяют в МПБ до исходного
объема, указанного на этикетке ампулы, а затем на МПБ отдельными
пипетками делают пять последовательных десятикратных разведений (в
4
последнем разведении титр бактериофага составит 1 x 10 ).
Смесь фагов готовят путем смешивания равных объемов фага L2A и
L4A в рабочем разведении.
8.4. Для контроля титра бактериофага, который ставят один на
группу анализов, проводимых одновременно, в пробирку N 2 (контроль)
вносят 9 куб. см МПБ.
8.5. В пробирки N 1 и 2 вносят по 1 куб. см смеси фага в рабочем
разведении (рис. 2) и выдерживают их в течение 16 - 24 ч при комнатной
температуре, после чего в пробирки добавляют по 1 куб. см хлороформа.
Содержимое тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре
на 30 - 40 мин. Хлороформ оседает на дно, надосадочную жидкость
подвергают дальнейшим исследованиям.
Исследуемый субстрат Смесь фагов Мясопептонный бульон
| | | |
--------- -------------- ---------- -----------
| | | |
\/ \/ \/ \/
N 1 - опытная N 2 - контроль смеси фагов
| |
\/ \/
Инкубация в термостате при 23 ЬC в течение 16 - 24 часов
| |
\/ \/
Обработка хлороформом 30 - 40 минут
| |
\/ \/
Исследование методом агаровых слоев
------------------ ------------------
\/ \/ \/ \/
L2A L4A L2A L4A
Рис. 2. Схема постановки РНФ для обнаружения листерий.
8.6. При использовании смеси фагов из опытной и контрольной
пробирок (N 1 и 2) берут по 0,2 куб. см и переносят по 0,1 куб. см в
две пробирки, содержащие по 0,9 куб. см МПБ (один ряд для обнаружения
фага L2A, а другой - L4A), а затем из каждой пробирки готовят еще одно
десятикратное разведение.
8.7. Готовят взвесь штаммов I и II серогруппы по стандарту
мутности 10 ед. путем разведения суточной агаровой культуры в
физиологическом растворе. Во все пробирки с разведенным материалом
добавляют по 0,1 куб. см взвеси, штамма 1 серогруппы для выявления
фага L2A или штамма II серогруппы для обнаружения фага L4A.
Содержимое пробирок засевают методом агаровых слоев по Грациа.
Для этого накануне дня исследования в бактериологические чашки Петри
разливают по 10 куб. см 1,5%-ного МПА; МПА можно разлить в чашки Петри
и в день исследования, но в этом случае поверхность агара необходимо
предварительно подсушить в течение 40 - 50 мин. при 37 ЬC или 2 ч при
комнатной температуре. Для второго слоя используют расплавленный и
охлажденный до 48 - 50 ЬC 0,7%-ный МПА, который следует использовать в
течение часа, так как позже он приобретает гелеобразную консистенцию и
непригоден для исследования.
Затем в пробирки пипеткой вносят по 2,5 - 3 куб. см
расплавленного и охлажденного до 48 - 50 ЬC 0,7%-ного МПА. Содержимое
быстро и тщательно перемешивают вращением пробирки между ладонями и
выливают в чашку Петри. Смесь легким покачиванием чашки равномерно
распределяют вторым слоем на поверхности 1,5%-ного МПА. Чашки
оставляют на ровном месте на 20 - 30 мин. (до застывания 0,7%-ного
МПА), затем переворачивают и инкубируют при комнатной температуре.
8.8. Учет реакции проводят через 16 - 24 ч инкубирования посевов.
В опытных пробах и контроле титра фага подсчитывают число
негативных колоний во всех чашках. Негативные колонии - округлые,
хорошо заметные на фоне бактериального роста, прозрачные участки,
образующиеся в результате лизиса бактерий.
При учете результатов сравнивают количество негативных колоний на
чашках соответствующих разведений.
8.9. Результаты реакции оценивают по увеличению титра
бактериофага (количества негативных колоний):
увеличение количества негативных колоний в опытной пробе по
отношению к контролю в 5 и более раз (хотя бы по одному из разведений)
оценивается как положительный результат, менее чем в 5 раз -
отрицательный;
сплошной лизис или лизис с островками оценивается как
положительный результат.
8.10. При получении положительного результата РНФ дают
заключение, что в исследуемом материале (пробе) обнаружены бактерии
рода Listeria.
9. Биологические исследования
Биологические исследования (постановку биопроб на мышах)
выделенных культур и их серологическую диагностику в реакции
агглютинации проводят в ходе противоэпидемических мероприятий и при
эпидрасследовании заболеваний в соответствии с Методическими
рекомендациями "Лабораторная диагностика листериоза животных и людей,
меры борьбы и профилактики". М., 1987 (утв. 04.09.86) [16].
10. Требования безопасности
Исследования пищевых продуктов на наличие Listeria monocytogenes
проводят в соответствии с СанПиН 1.2.731-99 "Безопасность работы с
микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".
Библиографический список
1. Федеральный закон "О санитарно - эпидемиологическом
благополучии населения" от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ.
2. Положение о государственной санитарно - эпидемиологической
службе Российской Федерации, утвержденное Постановлением Правительства
Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554.
3. Положение о государственном санитарно - эпидемиологическом
нормировании, утвержденное Постановлением Правительства Российской
Федерации от 24 июля 2000 г. N 554.
4. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности
и пищевой ценности пищевых продуктов".
5. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб
для микробиологических исследований".
6. ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб
для микробиологических анализов".
7. ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования
микроорганизмов".
8. ГОСТ 10444.1-84 "Консервы. Приготовление растворов, красок,
индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом
анализе".
9. ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы
микробиологического анализа".
10. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины,
баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц.
Правила приемки и методы отбора проб".
11. ГОСТ 9958-81 "Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы
бактериологического анализа".
12. ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы микробиологического анализа".
13. ГОСТ 4288-76 "Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого
мяса. Правила приемки и методы испытания".
14. ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские
беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки,
органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для
лабораторных испытаний".
15. МУК 4.2.590-96 "Бактериологические исследования с
использованием микробиологического экспресс - анализатора "Бак Трак
4100" / Минздрав России. М., 1997.
16. Методические рекомендации "Лабораторная диагностика
листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактики" (утв.
Минздравом СССР 04.09.86).
17. "Инструкция по санитарно - микробиологическому контролю
тушек, мяса птицы, птицепродуктов, яиц и яйцепродуктов на
птицеводческих и птицеперерабатывающих предприятиях" (утв.
Главветупромом; согл. зам. Главного государственного санитарного врача
СССР 30.08.90).
18. СанПиН 2.3.4.050-96 "Производство и реализация рыбной
продукции".
19. СанПиН 2.3.4.545-96 "Производство хлеба, хлебобулочных и
кондитерских изделий".
20. СанПин 2.3.4.551-96 "Производство молока и молочных
продуктов".
21. СанПиН 42-123-4423-87 "Нормативы и методы микробиологического
контроля продуктов детского питания, изготовленных на молочных кухнях
системы здравоохранения".
22. СанПиН 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III
- IV групп патогенности и гельминтами".
23. СанПиН 2.3.6.1066-01 "Санитарно - эпидемиологические
требования к организации торговли и обороту в них продовольственного
сырья и пищевых продуктов".
24. "Инструкция по порядку и периодичности контроля за
содержанием микробиологических и химических загрязнителей в молоке и
молочных продуктах на предприятиях молочной промышленности" (утв.
Минсельхозпродом России, согл. Госкомсанэпиднадзором России 29.12.95).
25. "Санитарные правила для предприятий пищеконцентратной
промышленности" (утв. Минздравом СССР 01.03.76).
26. "Ветеринарно - санитарные правила для предприятий (цехов)
переработки птицы и производства яйцепродуктов" (утв. Минздравом СССР
06.03.87).
27. "Инструкция по порядку и периодичности контроля за
содержанием микробиологических и химических загрязнителей в мясе,
птице, яйцах и продуктах их переработки" (утв. Минсельхозпромом
России; согл. Минздравом России 27.06.00).
28. "Инструкция по микробиологическому контролю производства
мороженого" (утв. ТК 186 по стандартизации (молоко и молочные
продукты); согл. зам. Главного государственного санитарного врача
России 10.03.93).
29. "Инструкция по санитарно - бактериологическому контролю
производства маргарина и майонеза на предприятиях маргариновой
промышленности" (утв. Госагропромом СССР 21.11.88).
30. "Порядок санитарно - микробиологического контроля при
производстве мяса и мясных продуктов" (утв. Минсельхозпромом России
15.12.95).
31. "Инструкция по микробиологическому контролю производства
высокостойких безалкогольных напитков. ИК 10-5031536-105-91" (утв.
Госагропромом СССР; согл. Минздравом СССР 28.06.91).
32. "Инструкция по микробиологическому контролю
быстрозамороженной плодоовощной продукции" (утв. Госагропромом СССР;
согл. Минздравом СССР 29.09.89).
33. МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов
детского, лечебного питания и их компонентов". |