Страницы: 1 2
pH 8,2 - 8,4.
Определение чувствительности культур бруцелл к фагу.
Бруцеллезный фаг "Тб" избирательно лизирует бруцеллы вида
abortus, находящиеся в S-фазе. При определении чувствительности
бруцелл к фагу используют следующий метод:
Питательная среда - 1,5% мартеновский агар (можно 1,5% агар
Альбими) разливают в чашки Петри по 25 - 30 мл. Среду подсушивают при
комнатной температуре в течение 18 - 20 часов. Чашки можно открыть и
прикрыть их стерильными кружками фильтровальной бумаги, но в этом
случае желательно чашки держать под лучами бактерицидной лампы.
Для посева используют 48-часовую агаровую культуру бруцелл, из
которой готовят взвесь в физиологическом растворе из расчета
9
1 x 10 мкл в 1 мл, 0,4 - 0,5 мл из этой взвеси наливают на
поверхность агара. Затем чашки тщательно раскачивают для получения
равномерного газона, лишнюю посевную жидкость удаляют пастеровской
пипеткой.
Засеянные чашки подсушивают в течение 1 часа при температуре 37
ЬC. На газон наносят пастеровской пипеткой по одной капле фага в
2
концентрации по 10 x 10 корпускул фага в 1 мл. Чашки быстро
наклоняют и капли фага стекают по дорожке. Места нанесения капель
и путь стекания капли можно заранее расчертить карандашом на
внешней стороне дна чашки.
Учет результатов.
Полный лизис культуры на месте нанесения фага (или по дорожке)
"4+", лизис с небольшим количеством отдельных колоний бруцелл или
слившиеся бляшки в виде сот "3+". Резко ослабленный рост и небольшое
количество бляшек "2+", очень слабый лизис "+" и отсутствие лизиса "-"
- результат отрицательный.
Оценка результатов.
За положительный результат следует принимать лизис культуры
минимум на два креста на месте нанесения капли фага. В качестве
контроля рекомендуется включать референтные штаммы В.melitensis 16M,
В.abortus 544 и В.suis 1330.
Дифференциальные свойства видов и сероваров рода Brucella: см.
таблицу.
5.1.6. Иммунологические и молекулярно-биологические
тесты выявления бруцелл и
их растворимые антигены
Учитывая, что бруцеллы относятся к медленно растущим
микроорганизмам и окончательный ответ бактериологического и
биологического методов исследования можно ожидать только через 3 - 5
недель, были разработаны тесты, основанные на иммунологическом
взаимодействии специфического антигена и антител (реакция
иммунофлюоресценции (РИФ) - прямой метод, реакция нейтрализации
антител (РНАт), иммуноферментный анализ (ИФА), а также
молекулярно-биологический метод - полимеразная цепная реакция (ПЦР)).
Технику постановки этих методов см. в разделе 4.
5.2. Методы выявления специфических
антител
При бруцеллезе рекомендуется несколько методов, которые
используются в зависимости от целей исследования.
При проведении эпидобследования населения в очагах рекомендуется:
реакция агглютинации - пластинчатая (Хеддлсона), РПГА, ИФА,
кожно-аллергическая проба Бюрне.
При обследовании населения перед профилактической вакцинацией:
пластинчатая реакция агглютинации (Хеддлсона) или ИФА и
кожно-аллергическая проба Бюрне или реакция лизиса эритроцитов.
Для диагностики острого и подострого бруцеллеза проводят
бактериологические исследования, ставят реакцию агглютинации и РПГА. В
случаях отрицательного результата используют реакцию Кумбса. Может
быть использована ИФА.
Для диагностики хронического бруцеллеза и при проведении
диспансерного наблюдения за переболевшими бруцеллезом рекомендуется
реакция Кумбса, ИФА и аллергические тесты.
Серологические реакции и аллергическая кожная проба по своему
диагностическому значению в различные периоды заболевания не
равноценны, вследствие чего не могут заменять друг друга. Это
обуславливает необходимость применения комплексного
серо-аллергического метода, являющегося наиболее надежным способом
диагностики бруцеллеза.
В ранние сроки от начала заболевания (в первые 6 месяцев)
диагностическая ценность серологического метода выше, чем
аллергического; серологические реакции в этот период оказываются
положительными почти в 98% случаев. По мере удлинения срока
заболевания процент положительных серологических реакций (реакция
агглютинации, РПГА) начинает падать. В поздние периоды заболевания
большую диагностическую ценность имеет реакция Кумбса, ИФА и
внутрикожная аллергическая проба.
При проведении обследования нужно учитывать, что если высокие
титры антител почти всегда указывают на наличие инфекции, то антитела
в низких титрах или их полное отсутствие не исключают возможности
заболевания. В связи с этим рекомендуется проводить повторные
исследования с интервалом 1 - 2 недели, особенно при подозрении на
острую форму бруцеллеза.
Следует иметь в виду, что положительную реакцию агглютинации с
бруцеллезным антигеном могут давать также сыворотки, содержащие
антитела к микроорганизмам, имеющим общие антигенные детерминанты с
бруцеллами (Е.coli, V.cholerae, Fr.tularensis, Y.enterocolitica 0 - 9,
S.typhimurium).
5.2.1. Пластинчатая реакция агглютинации
(реакция Хеддлсона)
Преимущество этого метода заключается в простоте постановки
реакции, быстром получении результатов и чувствительности реакции. В
качестве антигена для постановки реакции Хеддлсона и Райта применяют
единый бруцеллезный диагностикум. Реакцию ставят на обычном оконном,
тщательно вымытом, обезжиренном стекле, расчерченном на квадраты
величиной 4 x 4 см каждый, по горизонтали должно быть 5 квадратов. На
первом квадрате с левой стороны записывается номер испытуемой
сыворотки, в последующие квадраты слева направо разливают
(микропипеткой или 1 мл градуированной пипеткой) испытуемую сыворотку
в следующих дозах: 0,04, 0,02, 0,01 и 0,03 (контроль сыворотки). К
первым трем дозам сыворотки добавляют по 0,03 мл антигена. К последней
дозе сыворотки (0,03) добавляют 0,03 мл физиологического раствора.
Сыворотку осторожно смешивают с антигеном палочкой, начиная с
минимальной дозы сыворотки. Контроль антигена ставят, добавляя 0,03 мл
физиологического раствора к 0,03 мл антигена. Затем стекло слегка
подогревают над пламенем спиртовки так, чтобы происходило равномерное
нагревание всей поверхности стекла.
В случае положительной реакции в первые же минуты в каплях
сыворотки с антигеном появляются хлопья (агглютинат). Максимальный
срок наблюдения 8 минут:
а) контроль сыворотки ставят с каждой испытуемой сывороткой для
исключения спонтанной агглютинации;
б) контроль антигена ставят один (при любом числе испытуемых
сывороток) для исключения спонтанной агглютинации применяемого
антигена.
Учет реакции проводят невооруженным глазом по следующей схеме:
а) полное просветление жидкости с крупными и мелкими хлопьями,
т.е. 100% агглютинации (4+);
б) почти полное просветление жидкости с ясно заметными хлопьями,
т.е. 75% агглютинации (3+);
в) незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями,
т.е. 50% агглютинации (2+);
г) мутная жидкость с едва заметной зернистостью (+);
д) равномерная мутная жидкость (-).
Для оценки результатов рекомендуется следующая схема:
а) агглютинация на 4+ во всех дозах сыворотки - результат "резко
положительный";
б) агглютинация не менее 2+ во всех дозах сыворотки - результат
"положительный";
в) агглютинация только в первой или в первой и второй дозах
сыворотки - результат "сомнительный";
г) отсутствие агглютинации во всех дозах сыворотки - реакция
"отрицательная".
Для диагностики бруцеллеза имеет значение только положительный
результат реакции. При сомнительном или отрицательном результатах
реакции и наличии эпидемических и эпизоотических показаний, а также в
стационаре и при обследовании доноров, где необходимо определение
титра агглютининов и их динамики, следует применять реакции Райта и
Кумбса, РПГА и ИФА.
5.2.2. Реакция агглютинации в пробирках
(реакция Райта)
Реакция агглютинации является одним из основных методов
диагностики бруцеллеза у людей. Наибольшую диагностическую ценность
реакция агглютинации представляет при острой и подострой форме
бруцеллеза.
Техника постановки реакции.
В пробирки разливают физиологический раствор: в первую - 2,4 мл,
в остальные по 0,5 мл. В первую пробирку добавляют 0,1 мл исследуемой
сыворотки, перемешивают, переносят 0,5 мл в третью пробирку и т.д. Из
последней пробирки 0,5 мл смеси выливают, в результате получают в
каждой пробирке по 0,5 мл следующих разведений 1:25, 1:50, 1:100,
1:200 и т.д. Из первой пробирки 0,5 мл переносят в чистую пробирку и
добавляют туда 0,5 мл физиологического раствора (контроль сыворотки в
разведении 1:50), а 1,0 мл выливают.
Диагностикум разводят физиологическим раствором согласно
прилагаемому к нему наставлению и добавляют по 0,5 мл во все пробирки,
кроме контроля. После добавления диагностикума разведение сыворотки
соответственно удваивается, т.е. получается 1:50, 1:100 и т.д.
Сыворотки с антигеном смешивают путем встряхивания и помещают в
термостат (37 ЬC ) на 18 - 20 часов. После инкубации пробирки
выдерживают 1 - 2 часа при комнатной температуре и проводят учет
реакции.
Учет реакции проводят по стандарту мутности в зависимости от
степени осаждения агглютината и просветления жидкости.
Для приготовления стандарта мутности антиген, применяемый для
постановки РА, еще раз разводят в два раза.
Дальнейшее разведение антигена физиологическим раствором
производят по схеме 1.
Схема 1
РАЗВЕДЕНИЕ АНТИГЕНА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИМ РАСТВОРОМ
------------------------------------------------------------------
| | Степень агглютинации |
| |---------------------------------------|
| | ++++ | +++ | ++ | + | - |
|------------------------|-------|-------|-------|-------|-------|
|Антиген, разведенный 1:2|0 |0,25 |0,5 |0,75 |1,0 |
|------------------------|-------|-------|-------|-------|-------|
|Физ. раствор |1,0 |0,75 |0,5 |0,25 |0 |
|------------------------|-------|-------|-------|-------|-------|
|% просветления |100 |75 |50 |25 |0 |
------------------------------------------------------------------
Стандарт мутности готовят каждый раз при постановке РА и ставят в
термостат одновременно с основной реакцией.
Титром сыворотки является максимальное ее разведение, дающее 50%
агглютинации, - просветление, оцениваемое на 2+.
При применении стандартизированного диагностикума титры
исследуемых сывороток соответствуют количеству международных единиц
антител (ме/мл).
Так, титры 1:50, 1:100, 1:200 и т.д. соответственно равны 50,
100, 200 и т.д. ме/мл.
При диагностической оценке РА рекомендуется следующая схема:
- титр сыворотки 1:100 (100 ме/мл) - результат положительный;
- титр сыворотки 1:200 (200 ме/мл) - результат положительный;
- титр сыворотки 1:400 (400 ме/мл) - результат резко
положительный.
Диагностическим титром принято считать реакцию агглютинации не
менее 2+ при разведении сыворотки 1:100 и выше.
5.2.3. Антиглобулиновая проба
(реакция Кумбса)
В диагностике бруцеллеза у людей и животных, особенно при
хроническом течении инфекции, когда реакция агглютинации может быть
отрицательной или положительной в низких титрах, важное место следует
отвести выявлению неполных антител. При постановке реакции Кумбса
используют предварительно оттитрованную антиглобулиновую сыворотку
против глобулинов человека (например - антиглобулиновая сыворотка для
иммуноэлектрофореза против глобулинов человека) (см. схему титрации).
Техника постановки реакции Кумбса (РК).
В начале ставят реакцию агглютинации (Райта). После учета реакции
агглютинации (через 20 часов) берут не менее трех пробирок первых
разведений при отрицательном результате реакции агглютинации или не
менее трех пробирок, начиная со слабоположительного результата (+,
++). Эти пробирки центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 20 минут
для осаждения антигена. Надосадочную жидкость осторожно отсасывают с
помощью пастеровской пипетки и отбрасывают, затем в каждую пробирку
наливают по 1 мл физиологического раствора, тщательно встряхивают и
снова центрифугируют, таким образом осадок промывают три раза. После
последнего центрифугирования к осадку отмытого антигена добавляют 0,5
мл антиглобулиновой сыворотки в рабочем титре, пробирки тщательно
встряхивают и помещают в термостат на 18 - 20 часов. Учет реакции
проводят так же, как при реакции агглютинации. Диагностическим титром
РК считается агглютинация не менее 2+ в разведении сыворотки 1:50.
Для контроля антиглобулиновой сыворотки взять в опыт сыворотку,
содержащую неполные антитела с известным титром.
Контроль антигена. Взвесь антигена в физиологическом растворе
подвергается отмыванию центрифугированием, как в основной реакции,
после чего добавляют 0,5 мл антиглобулиновой сыворотки. При учете в
контроле антигена наблюдается равномерное помутнение.
Схема титрования антиглобулиновой сыворотки для РК.
Для титрования антиглобулиновой сыворотки (против глобулинов
человека) необходимо иметь сыворотку крови человека, заведомо
содержащую неполные антитела к бруцеллам в высоком титре. Титрование
антиглобулиновой сыворотки производят следующим образом. Вначале
титруют положительную бруцеллезную сыворотку в реакции агглютинации
(Райта). При этом делают несколько рядов разведений сыворотки,
приблизительно - 8 рядов (схема 2).
Схема 2
РЕЗУЛЬТАТЫ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ
------------------------------------------------------------------
| N | Разведения сыворотки, содержащей неполные антитела |
|рядов|----------------------------------------------------------|
| |1:50 |1:100 |1:200 |1:400 |1:800 |1:1600 |1:3200 | 1:6400 |
|-----|-----|------|------|------|------|-------|-------|--------|
|1 |4+ |4+ |2+ |- |- |- |- |- |
|-----|-----|------|------|------|------|-------|-------|--------|
|2 |4+ |4+ |2+ |- |- |- |- |- |
|-----|-----|------|------|------|------|-------|-------|--------|
|3 |4+ |4+ |2+ |- |- |- |- |- |
|-----|-----|------|------|------|------|-------|-------|--------|
|4 |4+ |4+ |2+ |- |- |- |- |- |
|-----|-----|------|------|------|------|-------|-------|--------|
|5 |4+ |4+ |2+ |- |- |- |- |- |
|-----|-----|------|------|------|------|-------|-------|--------|
|6 |4+ |4+ |2+ |- |- |- |- |- |
|-----|-----|------|------|------|------|-------|-------|--------|
|7 |4+ |4+ |2+ |- |- |- |- |- |
|-----|-----|------|------|------|------|-------|-------|--------|
|8 |4+ |4+ |2+ |- |- |- |- |- |
------------------------------------------------------------------
После учета реакции агглютинации во всех рядах отбирают пробирки,
в которых отсутствует агглютинация (в схеме 1 - начиная с 1:400) и в
каждой из них отмывают антиген согласно методике постановки реакции
Кумбса. Затем (схема 3) делают несколько разведений титруемой
антиглобулиновой сыворотки (в нашем примере от 1:10 до 1:250) и
добавляют по 0,5 мл каждого разведения этой сыворотки в один ряд
пробирок с оставшимся после отмывания антигеном. Объем жидкости в
каждой пробирке должен быть доведен до 0,5 мл. Пробирки встряхивают и
помещают в термостат при 37 ЬC. Результаты учитывают так же, как
реакцию агглютинации. За титр антиглобулиновой сыворотки принимают ее
наибольшее разведение (в нашем примере 1:80 - 4 ряд), которое выявляет
неполные антитела в максимальном титре (1:3200). Для реакции Кумбса
антиглобулиновая сыворотка применяется в удвоенном титре (1:40).
Схема 3
РЕЗУЛЬТАТЫ РЕАКЦИИ КУМБСА
------------------------------------------------------------------
| N | Разведение | Разведения сыворотки, |
|рядов |антиглобулиновой| содержащей неполные антитела |
| | сыворотки |----------------------------------------|
| | | 1:400 | 1:800 |1:1600 |1:3200 | 1:6400 |
|------|----------------|-------|-------|-------|-------|--------|
|1 |1:10 |4+ |4+ |4+ |4+ |- |
|------|----------------|-------|-------|-------|-------|--------|
|2 |1:20 |4+ |4+ |4+ |4+ |- |
|------|----------------|-------|-------|-------|-------|--------|
|3 |1:40 |4+ |4+ |4+ |4+ |- |
|------|----------------|-------|-------|-------|-------|--------|
|4 |1:80 |4+ |4+ |3+ |2+ |- |
|------|----------------|-------|-------|-------|-------|--------|
|5 |1:100 |4+ |3+ |2+ |- |- |
|------|----------------|-------|-------|-------|-------|--------|
|6 |1:150 |4+ |3+ |- |- |- |
|------|----------------|-------|-------|-------|-------|--------|
|7 |1:200 |3+ |2+ |- |- |- |
|------|----------------|-------|-------|-------|-------|--------|
|8 |1:250 |- |- |- |- |- |
------------------------------------------------------------------
5.2.4. Реакция пассивной гемагглютинации
(РПГА)
РПГА является специфичным и высоко чувствительным методом
выявления бруцеллезных антител в сыворотке крови человека. Для
постановки РПГА необходимо иметь: а) бруцеллезный эритроцитарный
антигенный диагностикум; б) контрольные (несенсибилизированные)
эритроциты; в) нормальную сыворотку кролика; г) бруцеллезную
сыворотку.
Для титрования испытуемых сывороток применяется нормальная
сыворотка кролика, инактивированная при 56 ЬC в течение 30 минут и
разведенная физиологическим раствором 1:100.
Испытуемую сыворотку разводят физиологическим раствором 1:25 (0,1
мл сыворотки +2,4 мл физиологического раствора) и инактивируют в
течение 30 минут при 56 ЬC. Перед исследованием сыворотку адсорбируют
50% взвесью контрольных эритроцитов. К 1,2 мл инактивированной
сыворотки добавляют 0,2 мл 50% эритроцитов, встряхивают и оставляют на
30 минут при комнатной температуре. Затем смесь центрифугируют при
1000 об./мин. в течение 2 минут.
Можно оставить сыворотки с эритроцитами на ночь в холодильнике
(+4 ЬC), в этом случае исключается центрифугирование.
Эритроцитарный диагностикум перед применением разводят
физиологическим раствором (pH 7,0 - 7,2) согласно указанию на этикетке
и получают 2,5%-ную взвесь, которая применяется в РПГА. Контрольные
(несенсибилизированные эритроциты также разводят согласно указанию на
этикетке и применяют полученную 2,5%-ную взвесь для контроля
сывороток).
Техника постановки РПГА.
Реакцию ставят в прозрачных полистироловых пластинках с лунками.
Каждую сыворотку исследуют не менее чем в 6 - 8 разведениях, начиная с
1:50. Сначала нормальную разведенную 1:100 инактивированную сыворотку
кролика разливают во все лунки по 0,5 мл. Затем в первую лунку
(контроль сыворотки) вносят 0,5 мл испытуемой сыворотки,
предварительно инактивированной и разведенной 1:25, перемешивают и 0,5
выливают. Во вторую лунку также добавляют 0,5 мл испытуемой сыворотки
(1:25), перемешивают, переносят 0,5 мл в третью лунку и титруют
сыворотку до конца ряда, из последней лунки 0,5 мл выливают. Таким
образом получают ряд последовательных двукратных разведений испытуемой
сыворотки, начиная с 1:50, в объеме 0,5 мл.
В первые лунки (контроль сыворотки) добавляют микропипеткой по
0,05 мл контрольных эритроцитов. Затем в каждую лунку, начиная со
второй, с помощью микропипетки добавляют по 0,05 мл диагностикума.
Пластины осторожно встряхивают до полного перемешивания содержимого
лунки, следя, чтобы не было разбрызгивания жидкости, и оставляют при
комнатной температуре. Учет реакции проводят через 2 - 3 часа.
При постановке РПГА предусматриваются следующие контроли:
а) контроль качества нормальной сыворотки кролика (1:100)
проводят в двух лунках. К 0,5 мл сыворотки добавляют в первую лунку
0,05 мл 2,5% взвеси диагностикума, во вторую - 0,05 мл контрольных
эритроцитов;
б) качество диагностикума проверяют путем титрования
специфической бруцеллезной сыворотки, начиная с разведения 1:50 до
1:100000. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05 мл 2,5% взвеси
диагностикума.
Реакция считается специфической, если в контролях исследуемых и
контрольной сыворотки отсутствует гемагглютинация, а титр
специфической сыворотки в реакции будет соответствовать титру,
указанному на этикетке флаконов эритрицитарного диагностикума.
Оценка реакции проводится по следующей схеме:
4+ - эритроциты покрывают все дно лунки равномерным слоем, иногда
наблюдается зонтик.
3+ - эритроциты выстилают все дно лунки тонким равномерным слоем,
но площадь его меньше, чем при 4-крестовой реакции, размеры зонтика
также меньше.
2+ - агглютинат небольшой, расположен в центре лунки.
1+ - вокруг осадка эритроцитов в центре виден небольшой
агглютинат.
Отрицательная реакция - осадок эритроцитов на дне лунки в виде
пуговки или маленького кольца.
За титр сыворотки принимают ее последнее разведение с оценкой
реакции не менее чем 3+. Оценка результатов исследования сывороток на
бруцеллез в РПГА у людей: титр 1:50 - реакция сомнительная, титр 1:100
и выше - реакция положительная. При записи результатов РПГА следует
указывать титр сыворотки.
Техника постановки РПГА микрометодом.
РПГА может быть выполнена в микрообъемах с помощью микротитратора
типа Такачи (или круглодонных микропланшетах с микропипетками),
который позволяет проводить титрование в объемах 25 и 50 мкл. Техника
постановки реакции, последовательность всех операций такая же, как и
при использовании макрометода. Следует учитывать то, что
чувствительность микрометода обычно на одно разведение ниже, чем
макрометода.
Для постановки реакции в микротитраторе с помощью
пипетки-капельницы в каждую лунку вносят разводящую жидкость в объеме
50 мкл. Затем с помощью титраторов с головкой объемом 50 мкл забираем
исследуемую сыворотку, погружая в нее головку. Титратор с сывороткой
переносят в первую лунку и делают несколько вращательных движений в
обе стороны. Затем титратор переносят в следующую лунку и повторяют
манипуляцию. Титрование можно проводить одновременно в нескольких
рядах. После титрования всего ряда титратор промывают дистиллированной
водой путем вращательных движений, удаляют воду из головки с помощью
тампона и обжигают ее на пламени горелки.
В лунки после титрования добавляют 25 мкл эритроцитарного
диагностикума, разведенного 1:10, пластины слегка встряхивают до
получения гомогенной взвеси. Учет проводят через 2 - 3 часа по
аналогичной схеме, как и при использовании макрометода.
5.2.5. Иммуноферментный анализ (ИФА)
Метод используют для диагностики всех форм заболевания, а также
при эпидемиологическом обследовании населения и при отборе лиц для
вакцинации против бруцеллезной инфекции.
Для постановки ИФА используют диагностическую тест-систему,
иммуноферментную для определения бруцеллезных антител. Выявление
специфических антител в сыворотках людей происходит за счет
взаимодействия бруцеллезного антигена (ЛПС), адсорбированного на
полистироловом планшете (плоскодонном) с антителами исследуемой
сыворотки. Образовавшийся комплекс "антиген + антитело" выявляют с
помощью антител против иммуноглобулинов человека, меченных
пероксидазой хрена.
Тест-система представляет собой набор ингредиентов для проведения
ИФА на твердофазном носителе и включает в себя: бруцеллезный ЛПС (либо
планшет, сенсибилизированный этим антигеном), антитела против
иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой (конъюгат),
контрольные (положительную и отрицательную) сыворотки человека, набор
солей, необходимых для приготовления буферных растворов, субстрат -
ортофенилиндиамин (ОФД). Твин-20, бычий сывороточный альбумин (БСА),
планшеты для ИФА однократного применения.
Техника постановки ИФА.
1. Сенсибилизация твердой фазы. В лунки планшета вносят с помощью
дозатора по 200 мкл раствора бруцеллезного антигена в концентрации 10
мкг/мл в 0,02М растворе фосфатно-солевого буфера (ФСБ), pH 7,2.
Адсорбцию антигена на планшетах проводят в течение 2 часов в
термостате при температуре 37 ЬC или при 4 ЬC в течение 18 часов.
Затем антиген удаляют встряхиванием планшета с последующей трехкратной
отмывкой (по 5 мин.) раствором ФСБ, содержащим 0,1% детергента -
твит-20.
2. Внесение исследуемого материала. Испытуемые сыворотки,
разведенные 1:200, вносят по 100 мкл в первую лунку ряда и далее
последовательно путем двукратных разведений на ФСБ + твин, содержащий
1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), раститровывают. Параллельно
на каждом планшете ставят отрицательный и положительный контроль.
Планшеты встряхивают и выдерживают при 37 ЬC в течение 1 часа. После
чего жидкость удаляют и отмывают планшеты, как указано в п. 1.
3. Внесение конъюгата. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл
раствора конъюгата в рабочем разведении (конъюгат разводят на ФСБ +
твин и 1% БСА). Планшеты помещают в термостат на 40 мин., после чего
жидкость удаляют, а планшеты отмывают 4 - 5 раз, как указано в п. 1.
4. Проявление реакции. В каждую лунку вносят по 100 мкл
субстратного раствора, содержащего 0,04% ОФД и 0,04% H2O2 в 0,1М
цитратно-фосфатном буфере, pH 5,5. Инкубацию проводят при комнатной
температуре 15 - 30 мин. и останавливают реакцию внесением 50 мкл 0,5
моль/л серной кислоты.
5. Учет и оценка результатов ИФА. Результат реакции можно
учитывать визуально с помощью сравнивания окраски в опытных и
контрольных лунках, а также с помощью спектрофотометра типа Multiskan
при длине волны 492 нм. Появление желто-оранжевого окрашивания в
опытных лунках при его отсутствии в лунках с отрицательными контролями
свидетельствует о положительной реакции. При фотометрическом учете
результатов проба считается положительной, если оптическая плотность
(ОП) в 2 и более раз превосходит наивысшее значение ОП отрицательных
контролей.
Диагностическим титром в ИФА считается разведение сыворотки более
чем 1:400.
Использование ИФА в эпидемиологической практике.
При проведении массовых обследований на бруцеллез для постановки
ИФА может быть использована не сыворотка крови, а цельная кровь. Для
этого кровь из пальца, с помощью микропипетки, в объеме 10 мкл
вносится в микропробирку с физиологическим раствором в объеме 1 мл.
Пробирку встряхивают и затем либо центрифугируют при 1000 об./мин. 5
мин., либо дают отстояться в холодильнике при 4 ЬC в течение 18 часов.
Таким образом получают разведение сыворотки 1:200. Для постановки ИФА
используют надосадочную жидкость. ИФА как скрининг-тест можно ставить
в 2 лунках микропланшета, при получении сомнительного или
положительного результата ИФА повторяют в количественном варианте с
последующей раститровкой надосадочной жидкости. При получении
положительного результата необходимо исследовать сыворотку крови.
5.2.6. Непрямой иммунофлюоресцентный
метод
При использовании непрямого ИФМ для обнаружения антител к
бруцеллам заранее готовят мазки из 1 - 2 суточной агаровой культуры
9
возбудителя (1 x 10 мкл/мл). На одном предметном стекле делают 8
мазков, фиксируют их в этиловом спирте в течение 30 мин., высушивают
на воздухе и помещают во влажную камеру. Исследуемую сыворотку
разводят 2-кратно, начиная с разведения 1:2 до 1:320, и наносят
пастеровской пипеткой на мазки, начиная с большего разведения. Влажную
камеру с препаратом помещают в термостат при 37 ЬC на 30 мин. Мазок
отмывают от несвязавшихся антител и после подсыхания его вновь
помещают во влажную камеру, докрашивая антивидовой люминисцирующей
сывороткой в рабочем разведении. Дальнейшая обработка препарата
ведется, как при прямом иммуннофлюоресцентном методе (см. раздел 4).
После просмотра препарата под люминесцентным микроскопом устанавливают
титр антител в исследуемой сыворотке.
В качестве контролей служат препараты, в которых бруцеллы
обработаны бруцеллезной сывороткой (положительный контроль) и
сывороткой, не содержащей антитела к бруцеллам (отрицательный
контроль). Диагностическим титром считается титр не менее 1:4.
5.3. Тесты, выявляющие повышенную
сенсибилизацию организма
к бруцеллезному антигену
5.3.1. Кожно-аллергическая проба Бюрне
Внутрикожная аллергическая проба основана на способности
организма, сенсибилизированного бруцеллезным антигеном, специфически
отвечать местной реакцией (отек, болезненность) на внутрикожное
введение бруцеллезного аллергена. Реакция специфична, но выявляется у
больных позднее, чем антитела, и сохраняется очень долго, иногда
годами, после исчезновения клинических симптомов. Необходимо иметь в
виду, что аллергическая реакция может быть положительной в случаях
бессимптомной инфекции, а также у привитых живой бруцеллезной вакциной
и у лиц, длительно контактировавших со специфическим антигеном.
Техника постановки пробы.
Бруцеллезный аллерген вводится внутрикожно в количестве 0,1 мл.
Инъекция делается с соблюдением асептики на ладонной поверхности
предплечья шприцом с тонкой иглой (техника, тождественная реакции
Манту, Шика и Дика). Учет реакции производится через 24 - 48 часов
после введения аллергена путем осмотра и ощупывания кожи. В некоторых
случаях аллергическая реакция становится положительной к 72 часам.
При положительной реакции на месте введения аллергена появляется
красноватая или бледная болезненная отечность удлиненной или овальной
формы. Отек может быть хорошо контурирован с ясным возвышением над
уровнем нормальной кожи. При слабо выраженной реакции отек
распознается только при ощупывании (сравнить с аналогичным участком
кожи на другой руке). Гиперемию кожи при отсутствии отека принимают за
отрицательный результат. При учете реакции отмечается размер отека в
сантиметрах (длина и ширина), степень болезненности через 24 и 48
часов. При отрицательном результате следует учитывать реакцию и через
72 часа.
Оценка реакции.
Наличие выраженного отека кожи на месте введения аллергена
считается положительной аллергической реакцией. Отсутствие
болезненности и гиперемии при наличии отека не исключает положительной
оценки пробы.
Реакция, появившаяся и исчезнувшая ранее шести часов после
введения аллергена, считается неспецифической.
У людей, высокосенсибилизированных к бруцеллезному антигену,
возможна общая реакция организма на введение бруцеллина с повышением
температуры, ознобом, головной болью и недомоганием.
Оценка реакции: слабо положительная - слабо выраженный отек не
более 2 см в диаметре, положительная - отек размером от 2 до 6 см в
диаметре, резко положительная - отек свыше 6 см, иногда
сопровождающийся лимфааденитом и общей реакцией организма.
5.3.2. Реакция лизиса лейкоцитов
Введение специфического антигена в сенсибилизированный организм
небезразлично для обследуемого. В этой связи заслуживает внимания
эффективный метод выявления гиперчувствительности замедленного типа
методом in vitro с помощью реакции лизиса лейкоцитов (РЛЛ). РЛЛ
основана на учете разрушения лейкоцитов сенсибилизированного организма
под влиянием специфического антигена, регистрируемого методом in
vitro. РЛЛ обладает строгой специфичностью, дает возможность
количественного учета степени сенсибилизации организма, позволяет
получить ответ через 3 - 4 часа после взятия крови.
Техника постановки РЛЛ.
РЛЛ проводится в пробирках из химически чистого стекла. В
качестве антигена используется взвесь убитых нагреванием бруцелл
(может быть использован вакцинный штамм В.abortus 19BA) в концентрации
7
1 x 10 мкл/мл.
Кровь для исследования берется в количестве 1 мл и вносится в
колбочку с гепарином из расчета 75 - 80 ме гепарина на 1 мл крови. По
0,4 мл гепаринизированной крови помещается в 2 пробирки. В первую
пробирку добавляют 0,1 мл бруцеллезного антигена (опытная пробирка),
во вторую - 0,1 мл физраствора для установления неспецифического
лизиса лейкоцитов (контрольная пробирка). Пробирки встряхивают в
течение 2 - 3 мин., после чего проводят подсчет лейкоцитов в камере
Горяева по принятому в гематологии методу. Затем пробирки помещают в
термостат на 2 часа при 37 ЬC и периодически встряхивают их через 15 -
20 мин. После инкубации пробирки вновь встряхивают в течение 2 - 3
мин. и проводят подсчет лейкоцитов. Подсчет производится не менее 2 -
3 раз для каждой пробирки, а затем выводится среднее их количество.
Наличие лейкоцитов после инкубации в опытной и контрольной пробирках
подсчитывается по формуле: количество лейкоцитов после инкубации x
100% количество лейкоцитов до инкубации.
Показатель специфического лизиса лейкоцитов (ПСЛ) подсчитывается
путем определения разницы - процент уменьшения лейкоцитов в опытной
пробирке минус процент уменьшения лейкоцитов в контроле. ПСЛ
выражается отрицательной величиной и колеблется в пределах от -10 до
-30%. ПСЛ меньше -10% свидетельствует о неспецифическом лизисе.
5.4. Индикация бруцелл в объектах
внешней среды, пищевых продуктах
и патологическом материале
Наиболее достоверным методом обнаружения возбудителя бруцеллеза в
пищевых продуктах, воде, патологическом материале являются
бактериологический и биологический методы, описанные выше. Для
быстрого обнаружения возбудителя бруцеллеза в первичных посевах,
пищевых продуктах, воде и патологическом материале рекомендуются
следующие методы: микроскопия препаратов, прямой иммунофлюоресцентный
метод, реакция нейтрализации антител (РНАт), ИФА и полимеразная цепная
реакция (ПЦР).
5.4.1. Микроскопия
Мазки, приготовленные из первичных посевов, из центрифугата или
фильтрата (при исследовании воды, молока), и препараты-отпечатки из
патологического материала после фиксации окрашивают по Граму или
Козловскому и просматривают в световом микроскопе.
5.4.2. Реакция иммунофлюуоресценции
(РИФ), прямой метод
При исследовании патологического материала от больных людей и
животных, а также из объектов внешней среды может быть эффективен
прямой иммунофлюоресцентный метод, позволяющий выявлять как живые, так
и нежизнеспособные бактерии по свечению в них специфического антигена.
Для обнаружения бруцелл применяют флюоресцирующие бруцеллезные
антитела.
А) Приготовление препаратов для люминесцентной микроскопии.
При исследовании воды готовят мазки (не менее 3 - 4) из осадка
после центрифугирования и с мембранных фильтров. Мазки фиксируют в
метиловом спирте 10 - 15 минут.
Мазки, приготовленные из проб цельного молока, сливок и осадка,
после центрифугирования обезжиривают эфиром в течение 20 минут и
дополнительно фиксируют 96Ь спиртом в течение 20 минут.
Мазки, приготовленные из мясного экстракта или осадка, фиксируют
96Ь спиртом в течение 20 минут.
Из селезенки белых мышей, которым был введен исследуемый
материал, готовят препараты-отпечатки, которые фиксируют 96Ь спиртом в
течение 15 - 20 минут при 37 ЬC или метиловым спиртом 15 минут при
комнатной температуре.
При исследовании материала от абортированных плодов, различных
экссудатов и органов инфицированных животных и людей готовят
препараты-отпечатки, прикладывая предметное стекло к поверхности
свежего среза. Затем препараты подсушивают на воздухе и фиксируют
этиловым спиртом в течение 15 - 20 минут при 37 ЬC или метиловым
спиртом при комнатной температуре 15 минут.
Б) Обработка препаратов флуоресцирующими антителами.
На фиксированные мазки наносят каплю бруцеллезной сыворотки. Для
гашения неспецифического свечения фона применяют бычий альбумин,
меченый родамином, который придает клеткам и другим органическим
частицам тусклое оранжево-красное свечение. Перед обработкой
препаратов бруцеллезную люминесцирующую сыворотку и альбумин разводят
до удвоенного рабочего разведения, указанного на этикетке (например,
если рабочее разведение равно 1:20, то разводят 1:10). После этого
альбумин и сыворотку смешивают в равных объемах и наносят на
исследуемый препарат, который помещают во влажную камеру (чашка Петри
с влажной фильтровальной бумагой на дне) на 15 - 20 минут, затем
промывают проточной водопроводной водой в течение 10 минут и
высушивают на воздухе. На препарат наносят каплю забуференного
глицерина (9 частей глицерина и 1 часть забуференного физиологического
раствора), покрывают покровным стеклом и исследуют под люминисцентным
микроскопом.
В) Микроскопия препаратов.
Для микроскопии используется люминисцентный микроскоп МЛ-2 при
силе тока 4,5, объективы 90 и 100 и окуляры 5x или 7x (в зависимости
от освещенности препарата). Светофильтры следует располагать следующим
образом: (от источника света) СЭС-14-14, БС-8-2, ФЗ-1-2. Окулярный
фильтр Т-2Н или Ж-18, вспомогательная линза - 1,6. При микроскопии
препаратов следует пользоваться нефлюоресцирующим маслом.
В положительных случаях, т.е. когда в исследуемом материале
имеются бруцеллы, в микроскопе на темном или оранжево-красном фоне
видны клетки с ярким зеленым свечением по периферии. Центральная часть
клетки не светится. Конгломераты бруцеллезного антигена имеют также
яркое зеленое свечение.
Для оценки интенсивности специфического свечения используют
четырехкрестовую систему.
Сверкающая флюоресценция зеленого цвета с четко выраженной формой
клетки - четыре креста. Яркая флюоресценция зеленого цвета - три
креста. Заметная, но слабо выраженная флюоресценция, - два и один
крест.
Положительным результатом считается флюоресценция, оцениваемая на
четыре и три креста при наличии 2 - 3 клеток в каждом поле зрения
препарата.
5.4.3. Реакция нейтрализации
антител (РНАт)
РНАт является модификацией реакции пассивной гемагглютинации и
основана на нейтрализации антител специфическим антигеном, находящимся
в исследуемом материале. Тем самым специфическая сыворотка лишается
способности агглютинировать эритроциты, сенсибилизированные
специфическим антигеном.
РНАт применяется для обнаружения бруцеллезного антигена в
патологическом материале, пищевых продуктах и объектах внешней среды.
Подготовка исследуемого материала.
Материал, подозрительный на зараженность бруцеллами, перед
постановкой реакции следует обезвредить путем прогревания при 100 ЬC
(в кипящей водяной бане) в течение 10 минут. Жидкости (вода, молоко)
прогревают в нативном виде. После прогревания воду и молоко
центрифугируют при 3000 об./мин. 2 часа и берут для исследования
осадок. Кусочки органов, брынзу и другой материал предварительно
измельчают и растирают в ступке с добавлением 9 объемов
физиологического раствора, полученную суспензию прогревают. Прогретую
суспензию фильтруют через 2 слоя марли или бумажный фильтр и исследуют
фильтрат или же центрифугируют его и берут для реакции надосадочную
жидкость и осадок.
Реакцию ставят в полистироловых пластинах с лунками, которые
должны быть тщательно вымыты, т.к. реакция отличается высокой
чувствительностью и присутствие даже следов антигена может исказить ее
результаты. Для постановки РНАт нужны те же ингредиенты, что и для
РПГА, и, кроме того, взвесь убитых бруцелл в концентрации
8
5 x 10 мкл/мл и бруцеллезная сыворотка с высоким титром
гемагглютинирующих антител.
Бруцеллезную сыворотку предварительно титруют в РПГА, определяя
ее предельное разведение, дающее реакцию не менее чем 3+. Это
разведение принимают за одну сывороточную гемагглютинирующую единицу.
Для РНАт берут разведение сыворотки, соответствующее 4 единицам.
Например, если 1 единица соответствует разведению 1:25600, то 4
единицы - 1:6400. Поскольку в РНАт бруцеллезная сыворотка берется в
объеме 0,25 мл, ее следует разводить в удвоенном титре (титр 1:3200).
Реакцию ставят в 4-х рядах лунок, первый ряд - опытный (8 - 10 лунок),
остальные - контрольные (6 лунок).
В первом (опытном) ряду титруют испытуемый материал. Во втором
ряду (контроль 1) контролируется возможность неспецифической реакции
за счет тканевых антигенов или гетерогенных антител. В третьем ряду
(контроль 2) контролируется специфичность РНАт с заведомо бруцеллезным
антигеном. В четвертом ряду (контроль 3) проверяется активность
бруцеллезной сыворотки.
Если одновременно исследуют несколько проб, то для каждой пробы
ставят только 1-й контроль, а второй и третий контроли ставят для всей
партии проб.
Техника постановки РНАт.
В лунки первого, второго и третьего рядов вносят нормальную
сыворотку кролика (разведенную 1:100) по 0,25 мл, а в четвертый ряд по
0,5 мл в каждую лунку, кроме первой лунки. Затем в 1-е лунки опытного
и второго (контроль 1) рядов вносят по 0,25 мл исследуемого материала
и титруют. В третий (контроль 2) ряд вносят бруцеллезный антиген в
объеме 0,25 мл и также титруют. Во все лунки 1-го (опытного) и 3-го
(контроль 2) рядов добавляют по 0,25 мл положительной бруцеллезной
сыворотки 4 сывороточных гемагглютинирующих единиц (например, 1:3200).
Во все лунки второго (контроль 1) ряда добавляют 0,25 мл
нормальной сыворотки кролика (1:100). В четвертом (контроль 3) ряду
разводят бруцеллезную положительную сыворотку в объеме 0,5 мл, начиная
с разведения, которое было использовано в первом (опытном) и третьем
(контроль 2) рядах и проверяют соответствие разведения сыворотки 4-м
сывороточным единицам (например, 1:6400). Пластины встряхивают и
ставят в термостат при 37 ЬC на 2 часа. Затем во все лунки четырех
рядов добавляют по 0,05 мл (1 капля) 2,5% взвеси бруцеллезного
эритроцитарного диагностикума. Пластины встряхивают и оставляют при
комнатной температуре на 2 - 3 часа.
Учет реакции.
При наличии бруцеллезного антигена в исследуемом материале
эритроциты выпадают в осадок в виде "пуговки" или маленького колечка -
реакция нейтрализации положительная. Если в исследуемом материале
антиген отсутствует, то специфические антитела, добавленные в реакцию,
остаются свободными и склеивают эритроциты - реакция нейтрализации
отрицательная.
За титр РНАт принимают последнее разведение исследуемого
материала, которое вызывало полное подавление гемагглютинации.
Результат РНАт считается положительным, если подавление
гемагглютинации отмечается не менее чем в первых 2 - 3 лунках.
Техника постановки РНАт в микрообъемах.
В лунки микротитровальных пластинок вливают по 0,025 мл (1 капля)
1% нормальной сыворотки кролика. Затем титратором с головкой,
вмещающей 0,025 мл, набирают исследуемый материал 1:5 - 1:10 и титруют
переносом по 0,025 мл из одной лунки в другую в 7 - 8 разведениях. Из
последней лунки 0,025 мл удаляют (так же, как в РПГА). После этого в
лунки добавляют по 0,025 мл раствора бруцеллезной сыворотки в такой
концентрации, чтобы в этом объеме содержалось четыре
гемагглютинирующие единицы сыворотки. Пластины оставляют на 1 час при
комнатной температуре и затем во все лунки добавляют по 0,025 мл
диагностикума бруцеллезного эритроцитарного в концентрации 0,5%. За
титр реакции принимают последнее разведение исследуемого материала, в
котором отмечено полное подавление гемагглютинации.
Примечания. 1. Перед работой головки используемых титраторов
следует предварительно обжечь.
2. При заборе материала для исследования и титрации нельзя
прикасаться головкой титратора к стенкам пробирок или лунок
титровальных пластинок, что может привести к удалению части жидкости.
3. Для заполнения титраторов достаточно погрузить их головки в
исследуемую жидкость и убедиться в заполнении головок жидкостью.
5.4.4. Иммуноферментный анализ (ИФА)
Метод используется для выявления бруцеллезного антигена в
объектах внешней среды, пищевых продуктах и биологических объектах, а
также для идентификации выделенных культур бруцелл. Метод
характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью,
возможностью количественной и автоматизированной оценки результатов,
воспроизводимостью и стандартностью основных ингредиентов анализа. С
3 4
помощью ИФА можно выявить бруцеллы в концентрации 1 x 10 - 1 x 10
мкл/мл или 1 - 5 нг/мл бруцеллезного растворимого антигена.
Для постановки ИФА используют иммуноферментную тест-систему для
определения бруцеллезного антигена, в которую входят: иммуноглобулины
бруцеллезные, бруцеллезный конъюгат, бруцеллезный антиген (ЛПС), набор
солей, необходимых для приготовления буферных растворов, субстрат -
ортофенилиндиамин (ОФД). Твин-20, бычий сывороточный альбумин (БСА,
полистироловые планшеты для иммунологических реакций).
Выявление бруцеллезного антигена в ИФА происходит за счет
специфического взаимодействия бруцеллезных иммуноглобулинов,
сорбированных на планшете, с бруцеллезным антигеном, содержащимся в
исследуемом материале. Образовавшийся комплекс "антиген + антитело"
выявляют с помощью конъюгата (бруцеллезные антитела, меченные
пероксидазой хрена).
Техника постановки ИФА.
1. Сенсибилизация твердой фазы. В лунки планшета вносят с помощью
дозатора по 200 мкл раствора бруцеллезных иммуноглобулинов в рабочем
разведении (20 мкг/мл) в 0,02М растворе ФСБ, pH 7,2. Планшеты помещают
в термостат на 2 часа при 37 ЬC или в холодильник на 18 часов при 4
ЬC. После окончания адсорбции иммуноглобулины удаляют из лунок
планшета встряхиванием и трехкратно отмывают раствором ФСБ, содержащим
0,1% твина-20.
2. Внесение исследуемого материала. Исследуемый материал в
разведениях (двух- или десятикратных) на ФСБ + твин, содержащий 1%
БСА, вносят по 100 мкл в каждую лунку. Параллельно с исследуемыми
образцами готовят серию последовательных разведений контрольного
образца бруцеллезного антигена в концентрациях от 1 до 1000 нг/мл и
каждое разведение антигена вносят в количестве 100 мкл в лунки
планшета. Планшеты выдерживают в термостате при 37 ЬC в течение часа,
после чего жидкость из планшета удаляют встряхиванием и планшеты
отмывают, как указано в п. 1.
3. Внесение конъюгата. В каждую лунку вносят по 100 мкл раствора
коньюгата в рабочем разведении (коньюгат разводят на ФСБ + твин,
содержащий 1% БСА). Планшеты помещают в термостат на 40 мин., а затем
отмывают, как указано в п. 1.
4. Проявление реакции. В каждую лунку вносят по 100 мкл
субстратного раствора, содержащего 0,04% ОФД и 0,04% H2O2 в 0,1М
цитратно-фосфатном буфере, pH 5,5. Планшеты помещают в темное место
при комнатной температуре на 15 - 20 мин. Реакцию останавливают
внесением в лунки 50 мкл серной кислоты в концентрации 0,5 моль/л.
5. Оценка результатов. Оценку результатов проводят по изменению
окраски субстрата (от светло-коричневой до оранжево-коричневой)
визуально или с помощью фотометра при длине волны 492 нм, сравнивая
интенсивность окраски контрольных и опытных проб. Появление
желто-оранжевого окрашивания в опытных лунках и положительном контроле
при его отсутствии в лунках с отрицательными контролями
свидетельствует о наличии в пробе бруцеллезного антигена. При
фотометрическом учете результатов анализа проба считается
положительной, если ее оптическая плотность (ОП) в 2 и более раз
превосходит наивысшее значение ОП отрицательных контролей, которое не
должно превышать 0,2.
5.4.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
В последние годы для определения ДНК бруцелл в различных объектах
используется ПЦР. В основе метода ПЦР лежит многократное копирование
(амплификация) специфического фрагмента ДНК-мишени, который является
маркерным для данного вида. ПЦР обладает высокой чувствительностью,
позволяет выявить 100 - 1000 бактериальных клеток в пробе. Важным
преимуществом перед иммунологическими тестами выявления бруцеллезного
антигена является высокая специфичность ПЦР (отсутствуют перекрестные
реакции с ДНК Е.coli, V.cholerae, F.tularensis, Y.enterocolitica 0 -
9, Y.pestis EV, S.typhimurium). Подготовку проб для исследования
(выделение ДНК) и проведение ПЦР осуществляют с помощью специального
набора, в который включены все необходимые ингредиенты. При
диагностике бруцеллеза у людей ДНК определяют в сыворотке крови,
спинномозговой и синовиальной жидкости и др. Оценку результатов ПЦР
следует проводить с учетом того, что специфический праймер для
проведения этой реакции является родовым и выявляет ДНК всех видов
бруцелл, в т.ч. и вакцинные штаммы. Это необходимо учитывать в
эндемичных по бруцеллезу регионах, где для вакцинации животных
используются живые бруцеллезные вакцины, которыми может быть
инфицирован обслуживающий их персонал.
6. РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
6.1. Печеночные среды
а) Печеночный настой.
Свежую говяжью печень освобождают от жира и пленок и пропускают
через мясорубку. Фарш заливают водопроводной водой (на 1 кг фарша - 1
л воды) и настаивают при температуре 25 - 30 ЬC в течение 3 часов или
при температуре 4 - 10 ЬC в течение 6 - 10 часов. Затем эту смесь
перемешивают и варят в автоклаве текучим паром в течение 20 минут.
Можно варить и в котле, постоянно помешивая. В процессе варки снимают
накипь, вновь все перемешивают и доваривают еще около двух часов.
После варки настой фильтруют через тонкий ватно-марлевый фильтр.
Приготовленный таким образом печеночный настой разливают по
бутылям и стерилизуют в течение 20 минут при 115 - 120 ЬC.
б) Печеночный бульон.
К 500 мл печеночного настоя добавляют 500 мл водопроводной воды,
10 г сухого пептона и 5 г химически чистого хлористого натрия. Смесь
кипятят, устанавливают pH 7,4, фильтруют через фильтровальную бумагу и
стерилизуют 20 минут при 115 - 120 ЬC, pH бульона после стерилизации
должен быть 7,1 - 7,2.
в) Печеночный агар. К 500 мл печеночного настоя добавляют 500 мл
водопроводной воды, 10 г сухого пептона, 5 г химически чистого
хлористого натрия и 25 г агар-агара, промытого водопроводной водой и
хорошо отжатого, pH среды устанавливают 7,8. Затем среду варят до
полного расплавления агара и разливают в необходимую посуду (по 1 - 2
л).
В дальнейшем среду автоклавируют при 115 ЬC в течение 20 минут,
отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, предварительно
смоченный теплой водой и вновь устанавливают pH 7,1 - 7,2.
Среду разливают в необходимую по емкости посуду и стерилизуют при
115 ЬC в течение 20 минут.
6.2. Мясопептонные среды
а) Мясная вода.
Свежее говяжье мясо освобождают от костей, жира и сухожилий и
пропускают через мясорубку. Фарш заливают водопроводной водой из
расчета 500 г фарша на 1 л воды и выдерживают в течение 15 часов в
прохладном месте.
В дальнейшем настой варят 30 - 40 минут, фильтруют через
ватно-марлевый фильтр или через полотно.
Полученную мясную воду, в случае заготовления впрок, стерилизуют
при 120 ЬC в течение 20 минут.
б) Мясопептонный бульон.
На 2 л мясной воды добавляют 10 г сухого пептона и 5 г химически
чистого хлористого натрия. Смесь подщелачивают до pH 7,4 и кипятят в
течение 20 минут. После этого фильтруют через бумажный фильтр,
разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 115 - 120 ЬC в
течение 20 минут. pH среды после стерилизации должен быть 7,2.
в) Мясопептонный агар.
К 1 л мясной воды добавляют 10 г сухого пептона, 5 г химически
чистого хлористого натрия и 25 г агар-агара. Смесь подщелачивают до pH
7,8, варят до полного расплавления агара. Затем разливают в бутыли и
стерилизуют при 110 ЬC в течение 15 - 20 минут. После стерилизации
среду отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр,
предварительно смоченный теплой водой, затем разливают в необходимую
посуду и вновь стерилизуют 15 - 20 минут при 110 ЬC, после
стерилизации вновь устанавливают pH среды до 7,2.
6.3. Сывороточно-декстрозный агар
Основой этой среды является питательный агар, который готовят
следующим образом: к 835 мл дистиллированной воды добавляют 15 г
агар-агара, 10 г пептона, 5 г химически чистого хлористого натрия и
165 мл мясной воды.
Все ингредиенты вводят в сосуд и подвергают обработке текучим
паром в течение 1 часа. Устанавливают pH 7,8. Затем сосуд ставят в
автоклав и подвергают одномоментному давлению 2 атмосферы при 121 ЬC
для выпадения в осадок фосфатов. Среду фильтруют через бумажные
фильтры, устанавливают pH 7,4, а затем разливают в мерную посуду и
стерилизуют при температуре 116 ЬC в течение 15 минут. Заготовленный
таким образом питательный агар по мере надобности расплавляют в
водяной бане или автоклаве и охлаждают до 50 ЬC. Затем к нему
добавляют нормальную инактивированную (при 56 ЬC 30 минут) лошадиную
или бычью сыворотку и раствор декстрозы, предварительно
простерилизованный путем фильтрации через фильтр Зейтца, так, чтобы
окончательная концентрация сыворотки была 5% и декстрозы - 1%.
6.4. Кровяной агар
Основой этой среды является питательный агар, применяемый при
изготовлении сывороточно-декстрозной среды.
Для приготовления кровяного агара к основной среде добавляют 5%
дефибринированной овечьей крови.
6.5. Картофельная среда
Крупный отборный картофель моют и очищают. На 1 кг картофеля
добавляют 1 л дистиллированной воды и варят до готовности картофеля.
Затем жидкость сливают, замеряют объем, доливают дистиллированной
водой до 1 л и фильтруют через двойной марлевый фильтр. После этого
добавляют следующие ингредиенты: пептон - 10 г, химически чистый
хлористый натрий - 5 г, глицерин - 30 мл и промытый агар-агар - 30 г.
Все помещают в кастрюлю и варят до полного расплавления агара: pH 7,2
устанавливают 10%-ным раствором едкого натрия.
После этого стерилизуют в автоклаве при 110 ЬC в течение 30
минут, фильтруют, добавляют 10 г глюкозы и вновь стерилизуют при 116
ЬC 30 минут. После автоклавирования к среде добавляют 10% нормальной
инактивированной стерильной лошадиной или овечьей сыворотки.
6.6. Среда "Д"
а) Бульон "Д".
К 100 мл холодной дистиллированной воды добавляют 2,5 г порошка
стандартного бульона "Д", прогревают и тщательно размешивают до
полного его растворения. Затем бульон фильтруют, разливают в
необходимую посуду и стерилизуют при 120 ЬC в течение 20 минут (pH
среды 7,1 - 7,2).
б) Агар "Д".
К 100 мл холодной дистиллированной воды добавляют 5 г порошка
стандартного агара "Д", прогревают при помешивании до полного
растворения порошка, не допуская его подгорания, затем фильтруют,
разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 120 ЬC в течение 20
минут (pH среды 7,2).
6.7. Среда-заменитель "Альбими"-агара
К 1 л дистиллированной воды добавляют 20 г сухого пептона, 20 мл
дрожжевой воды, 5 г химически чистого хлористого натрия и 20 г
агар-агара, устанавливают pH 7,3.
Затем все растворяют в автоклаве под текучим паром и фильтруют
через ватно-марлевый фильтр (предварительно смоченный теплой водой и
хорошо отжатый).
Затем добавляют 1 г глюкозы и 0,1 г бисульфита натрия,
устанавливают pH 7,2 - 7,3. Разливают в необходимую посуду и
стерилизуют 40 минут под текучим паром, а потом при 110 ЬC в течение
20 минут.
Дрожжевая вода. 1 кг хлебных дрожжей и 1 л дистиллированной воды
кипятят до растворения. Затем фильтруют через полотняный фильтр.
Хранить нужно под хлороформом в темноте не более двух недель.
6.8. Среда для культивирования
Br.ovis
Основой этой среды является печеночный или мясопептонный агар, к
которому добавляют 1% декстрозы (глюкозы) и 2% глицерина. Среду
разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 116 ЬC в течение 15
минут. Перед посевом к расплавленной и остуженной до 50 ЬC среде
добавляют 20% нормальной сыворотки крупного рогатого скота или 10%
аминопептида и 10% сыворотки.
6.9. Среда для выделения и культивирования
L-культур бруцелл
Основой этой среды является питательный агар, который готовится с
использованием: а) печеночного настоя или б) мясной воды.
Приготовление агара из расчета на 1 л среды:
а) 500 мл печеночного настоя;
500 мл водопроводной воды;
10 г сухого пептона;
б) 280 мл мясной воды;
280 мл водопроводной воды;
440 мл мартеновского пептона.
Добавляют 5 г химически чистого хлористого натрия, 30 г
агар-агара, промытого водопроводной водой, pH устанавливают 7,8.
Смесь кипятят до полного расплавления агара. Затем разливают в
бутыли и стерилизуют при 115 ЬC в течение 15 - 20 минут, отстаивают,
фильтруют через ватно-марлевый фильтр, смоченный теплой водой. После
фильтрации добавляют 10 г глицерина и 10 г глюкозы, устанавливают pH
7,2 и вновь стерилизуют при 110 ЬC в течение 20 минут.
Заготовленный таким образом агар по мере надобности (перед
посевом крови) расплавляют в водяной бане, охлаждают до 50 ЬC и к нему
добавляют 25% нормальной лошадиной сыворотки (предварительно
простерилизованной через фильтр Зейтца), 25% печеночного или
мясопептонного бульона (в соответствии с основой агара), содержащего
50 - 100 ед. пенициллина на 1 мл среды.
Посев крови, в объеме не менее 5 мл, пунктатов костного мозга и
лимфоузлов производят на питательную среду сразу же после застывания
агара и добавления бульона (метод предложен лабораторией бруцеллеза
НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ
1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии
населения" от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ.
2. Постановление Правительства Российской Федерации от 24 июля
2000 г. N 554 "Об утверждении Положения о государственной
санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации и Положения о
государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании".
3. Санитарные правила по безопасности работ с микроорганизмами.
Ч. I "Порядок выдачи разрешения на работу с микроорганизмами I - IV
групп патогенности и рекомбинантными молекулами ДНК (СП 1.2.006-93)".
4. Санитарные правила "Безопасность работы с микроорганизмами I -
II групп патогенности. СП 1.2.011-94".
5. Санитарные правила "Порядок учета, хранения, передачи и
транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности. СП
1.2.036-95".
6. Санитарные правила "Условия транспортировки и хранения
медицинских иммунобиологических препаратов. СП 3.3.2.028-95".
7. "Бруцеллез. СП 3.1.085-96, ВП 13.3.1302-96", сборник
санитарных и ветеринарных правил "Профилактика и борьба с заразными
болезнями, общими для человека и животных".
8. "Бруцеллез. Методические рекомендации по диагностике, лечению
и реабилитации больных", 1987.
Приложение
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ВИДОВ
И БИОВАРОВ РОДА BRUCELLA
--------------------------------------------------------------------------------------------------
| Вид |Биовар|Потребность|Продукция| Рост на |Агглютинация |Лизис|Основной |
| | |в CO2 |H2S | средах с |с |фагом|хозяин |
| | | | | красками |моноспецифическими|"ТБ" | |
| | | | |--------------|сыворотками | RTD | |
| | | | |тионин|основн.| | | |
| | | | | |фуксин | | | |
| | | | | | |------------------| | |
| | | | | | |А |М | R | | |
|------------|------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|-------------|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |7 |8 | 9 | 10 | 11 |
|------------|------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|-------------|
|В.abortus |1 |(+) |+ |- |+ |+ |- |- |Л |крупный |
| |------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|рогатый |
| |2 |(+) |+ |- |- |+ |- |- |Л |скот |
| |------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----| |
| |3 |(+) |+ |+ |+ |+ |- |- |Л | |
| |<*> | | | | | | | | | |
| |------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----| |
| |4 |(+) |+ |- |(+) |- |+ |- |Л | |
| | | | | |<**> | | | | | |
| |------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----| |
| |5 |- |- |+ |+ |- |+ |- |Л | |
| |------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----| |
| |6 |- |(+) |+ |+ |+ |- |- |Л | |
| |<*> | | | | | | | | | |
| |------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|-------------|
| |9 |- |+ |+ |+ |- |+ |- |Л | |
|------------|------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|-------------|
|В.melitensis|1 |- |- |+ |+ |- |+ |- |ОЛ |овцы, |
| |------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|козы |
| |2 |- |- |+ |+ |+ |- |- |ОЛ | |
| |------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----| |
| |3 |- |- |+ |+ |+ |+ |- |ОЛ | |
|------------|------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|-------------|
|В.suis |1 |- |+ |+ |(-) |+ |- |- |ОЛ |свиньи |
| | | | | |<***> | | | | | |
| |------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|-------------|
| |2 |- |- |+ |- |+ |- |- |ОЛ |свиньи, |
| | | | | | | | | | |зайцы |
| |------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|-------------|
| |3 |- |- |+ |+ |+ |- |- |ОЛ |свиньи |
| |------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|-------------|
| |4 |- |- |+ |(-) |+ |+ |- |ОЛ |олени |
| |------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|-------------|
| |5 |- |- |+ |- |- |+ |- |ОЛ |мышевидные |
| | | | | | | | | | |грызуны |
| | | | | | | | | | | |
|------------|------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|-------------|
|B.neotomae | |- |+ |- |- |+ |- |- |ОЛ |пустынные |
| | | | | | | | | |или |кустарниковые|
| | | | | | | | | |ЧЛ |крысы |
| | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | | | | |
|------------|------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|-------------|
|В.ovis | |+ |- |+ |(-) |- |- |+ |ОЛ |овцы |
|------------|------|-----------|---------|------|-------|----|-----|-------|-----|-------------|
|В.canis | |- |- |+ |- |- |- |+ |ОЛ |собаки |
|-----------------------------------------------------------------------------------------------|
|Л - полный лизис, ЧЛ - частичный лизис, ОЛ - отсутствие лизиса. |
|Концентрация - 1:50000, + (+) большинство штаммов положительные, |
|(-) большинство штаммов отрицательные. |
-------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------
<*> Для более точной дифференциации B.abortus биовар 3 и 6
используется тионин 1:25000 (биовар 3+, биовар 6-).
<**> Некоторые штаммы этого биовара (биовар 4) ингибируются
основным фуксином.
<***> Некоторые штаммы могут быть резистентны к основному
фуксину, пиронину и сафронину О.Страницы: 1 2 |