Страницы: 1 2
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ.
ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ПРИ ИССЛЕДОВАНИЯХ МЕТОДОМ
ПЦР МАТЕРИАЛА, ИНФИЦИРОВАННОГО МИКРООРГАНИЗМАМИ
I - II ГРУПП ПАТОГЕННОСТИ
МЕТОДИКА
ГЛАВНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНИТАРНЫЙ ВРАЧ РФ
5 декабря 2003 г.
N МУ 1.3.1794-03
(Д)
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
5 декабря 2003 года
Дата введения -
с момента утверждения
1. Разработаны: Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России
(М.П. Шевырева, Ю.М. Федоров); Центром по генной диагностике особо
опасных инфекционных заболеваний Минздрава России на базе Российского
научно-исследовательского противочумного института "Микроб" (В.В.
Кутырев, А.Н. Куличенко, Н.А. Осина, И.Н. Шарова, М.Н. Ляпин, И.Г.
Дроздов); Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Е.Н.
Беляев, И.В. Брагина, А.А. Ясинский, Э.Ф. Опочинский, Т.В. Воронцова,
М.В. Зароченцев); ЦНИИ эпидемиологии Минздрава России (В.И.
Покровский, Н.А. Семина, Г.А. Шипулин, Е.Н. Родионова); Противочумным
центром Минздрава России (В.Е. Безсмертный, С.М. Иванова, Ю.А. Панин);
ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Т.А. Бектимиров, Р.А. Волкова, М.С.
Воробьева, Л.В. Саяпина); Ростовским-на-Дону научно-исследовательским
противочумным институтом (И.Ю. Сучков, С.О. Водопьянов, Б.Н.
Мишанькин); Ставропольским научно-исследовательским противочумным
институтом (Е.И. Еременко, А.Ф. Брюханов, О.И. Цыганова); Иркутским
научно-исследовательским противочумным институтом (С.В. Балахонов,
М.Ю. Шестопалов); ГНЦ биотехнологии и вирусологии "Вектор" (Г.М.
Игнатьев, Н.Л. Максимов, А.А. Неверов, В.А. Терновой, С.В. Нетесов);
Биоком (А.Б. Комаров).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному
санитарно-эпидемиологическому нормированию при Министерстве
здравоохранения Российской Федерации (протокол N 20 от 2 декабря 2003
г.).
3. Утверждены и введены в действие Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра
здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 5 декабря 2003 г.
4. Введены впервые.
1. Область применения
1.1. Методические указания предназначены для органов и учреждений
государственной санитарно-эпидемиологической службы, а также могут
быть использованы юридическими лицами, независимо от
организационно-правовых форм и форм собственности, и индивидуальными
предпринимателями, выполняющими в установленном порядке работы с
объектами и материалами, содержащими или подозрительными на содержание
микроорганизмов I - II групп патогенности:
- диагностические (исследование объектов окружающей среды и
клинического материала, в том числе от больных с подозрением на ТОРС);
- экспериментальные;
- производственные (работы по производству и контролю
генодиагностических препаратов при условии соблюдения требований GMP).
1.2. Методические указания определяют принципы организации
лабораторий и этапы выполнения ПЦР-анализа: взятие проб, первичная
обработка, хранение, условия транспортирования, обеззараживание
материала, выделение нуклеиновых кислот, проведение ПЦР (ОТ-ПЦР), учет
и регистрация результатов при исследовании биологического материала,
пищевых продуктов, материала из объектов окружающей среды.
1.3. Методические указания регламентируют выполнение исследований
с использованием ПЦР-анализа, осуществляемого сертифицированными
тест-системами и оборудованием и предусматривающего учет результатов
методом электрофореза или гибридизационно-ферментного анализа (ГиФА).
2. Нормативные ссылки
2.1. Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с
микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)" СП
1.3.1285-03.
2.2. Санитарно-эпидемиологические правила "Порядок выдачи
санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения
работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I - IV групп
патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными
микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами" СП
1.2.1318-03.
2.3. Санитарные правила и нормы "Правила сбора, хранения и
удаления отходов лечебно-профилактических учреждений" СанПиН
2.1.7.728-99.
2.4. Методические указания "Обеззараживание исследуемого
материала, инфицированного бактериями I - IV групп патогенности, при
работе методом ПЦР" МУ 3.5.5.1034-01. М., 2001.
2.5. "Методические указания по детекции патогенной микрофлоры в
клиническом материале, пищевых продуктах, объектах внешней среды и
генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной
реакции". Госкомсанэпиднадзор России, 18.10.96, N 01-19/123-17.
2.6. Методические указания "Лабораторная диагностика сибирской
язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного
происхождения и объектах внешней среды". МЗ СССР, 01.09.86, и
Госагропром СССР, 01.09.86.
2.7. Методические указания "Лабораторная диагностика холеры" МУ
4.2.1097-02. М., 2002.
2.8. Методические указания "Профилактика и лабораторная
диагностика бруцеллеза у людей" МУ 3.1.7.1189-03. М., 2003.
2.9. Методические указания "Сбор, учет и подготовка к
лабораторному исследованию кровососущих членистоногих - переносчиков
возбудителей природно-очаговых инфекций" МУ 3.1.1027-01. М., 2002.
2.10. "Методические рекомендации по проведению работ в
диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной
реакции". М., 1995.
2.11. Временные методические рекомендации "Лабораторная
диагностика "атипичной пневмонии" (SARS) методом ПЦР", утв. Минздравом
России 03.05.03.
2.12. Руководство по профилактике чумы. Саратов: Слово, 1992.
2.13. Руководство "Использование ультрафиолетового излучения для
обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях" Р 3.1.683-98, МЗ
РФ.
2.14. Инструкция по проектированию санитарно-эпидемиологических
станций. СН 535-81. М.: Стройиздат, 1982.
3. Общие положения
3.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амплификации
(многократном увеличении числа копий) фрагмента ДНК-мишени в условиях
in vitro и позволяет обнаружить специфичный участок генома
микроорганизма.
3.2. Аналитическая чувствительность тест-систем для выявления ДНК
2 4
(РНК) микроорганизмов методом ПЦР составляет 1 х 10 - 1 х 10 м.к.
(геномных эквивалентов)/мл, специфичность - 85 - 100%, возможно
исследование любого биологического материала и объектов окружающей
среды, время выполнения анализа 4 - 8 ч.
3.3. Для выявления ДНК (РНК) микроорганизмов I - II групп
патогенности ПЦР-анализ используют:
- в качестве экспрессного метода при исследовании материала от
больного (подозрительного на заболевание) и индикации патогенных
биологических агентов (ПБА) в объектах окружающей среды;
- как ускоренный предварительный тест при выполнении
культурального и биологического методов исследования и для
идентификации подозрительных культур;
- для определения эпидемиологической значимости изолятов на
основании выявления генетических маркеров вирулентности, например
ctxA- и tcpA-генов у возбудителя холеры;
- эпидемиологического мониторинга;
- в научных целях для генотипирования штаммов или их
ретроспективного анализа.
4. Требования к организации работ
4.1. Проведение исследований по выявлению ДНК (РНК)
микроорганизмов I - II групп патогенности сопряжено с необходимостью
одновременного обеспечения правил биологической безопасности работ и
требований к организации и проведению ПЦР-анализа с целью
предотвращения контаминации исследуемых проб нуклеиновыми кислотами
(НК).
4.2. Противоэпидемический режим работы при ее организации и
выполнении должен быть обеспечен в соответствии с СП 1.3.1285-03
"Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности
(опасности)", регламентирующими работу с микроорганизмами I - II групп
патогенности.
4.3. Все этапы исследования материала, зараженного или
подозрительного на зараженность вирусами I группы, проводят в условиях
максимально изолированных лабораторий с использованием изолирующих
средств индивидуальной защиты или в боксах биологической безопасности
III класса в защитном костюме IV типа, дополненном резиновыми
перчатками.
4.4. Исследования материала, инфицированного микроорганизмами I -
II групп патогенности, методом ПЦР проводят в организациях, имеющих
лицензию на деятельность, связанную с возбудителями инфекционных
заболеваний человека, в лабораториях, имеющих
санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения
соответствующих работ (с указанием конкретных видов микроорганизмов).
В этой же лаборатории могут проводиться ПЦР-исследования с
микроорганизмами III - IV групп патогенности.
4.5. Допускается проведение исследований крови методом ПЦР на
бруцеллез, парентеральные вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекцию в
лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о
возможности проведения работ с возбудителями III группы патогенности,
выданное в установленном порядке.
4.6. Передачу исследуемого материала в другие организации
проводят в соответствии с п. п. 2.1.2 и 2.8.20 СП 1.3.1285-03
"Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности
(опасности)".
4.7. Работу по ПЦР-диагностике организует специалист с высшим
образованием, прошедший обучение на лицензированных курсах
специализации (повышения квалификации) по работе с ПБА I - II групп
патогенности и по ПЦР-диагностике.
5. Требования к помещению и оборудованию ПЦР-лабораторий
5.1. Помещения, в которых проводят исследования на наличие НК
микроорганизмов I - II групп патогенности, размещают в "заразной" зоне
лаборатории, проводящей диагностические и другие исследования с
указанными микроорганизмами. При наличии возможности помещения
располагают в виде отдельного блока. При строительстве новых или
реконструкции имеющихся помещений лабораторию ПЦР размещают в отдельно
стоящем здании (изолированной части здания) с соблюдением требований
СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп
патогенности (опасности)" и учетом особенностей устройства
вентиляционной системы ПЦР-лаборатории, изложенных в п. 5.19 настоящих
Методических указаний.
5.2. Рабочая зона ПЦР-лаборатории в соответствии с этапами
ПЦР-анализа должна включать следующий минимальный набор
последовательно расположенных самостоятельных помещений (прилож. 1)
<*> или отдельно выделенных рабочих зон (в составе других
функциональных помещений):
- приема, разборки, первичной обработки материала;
- подготовки проб, выделения нуклеиновых кислот (НК);
- приготовления реакционных смесей, проведения ПЦР и обратной
транскрипции (ОТ);
- учета результатов методом электрофореза или ГиФА.
------------------------------------
<*> Не приводится.
5.3. Комнату выделения НК располагают вблизи от комнаты приема
материала, а помещение для учета результатов - по возможности в
отдалении от других перечисленных помещений для обеспечения условий,
исключающих занос в них продуктов амплификации (ампликонов) с
воздушным потоком.
5.4. Не допускается выполнение ПЦР-исследований в помещениях для
проведения работ с использованием культуральных (накопление патогенных
биологических агентов) и генно-инженерных методов, в том числе
связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных
плазмид.
5.5. Зону приема, регистрации, сортировки, первичной обработки
материала (объединение или разделение проб, центрифугирование,
инактивацию и т.д.) располагают в комнате приема материала блока для
работы с инфицированными животными или в отдельной боксированной
комнате. В этих же помещениях может проводиться обработка проб к
другим видам исследований (бактериологическое, вирусологическое,
серологическое и т.д.). При наличии возможности в помещении
устанавливают бокс биологической безопасности III класса защиты
(допускается также использование бокса 2ШНЖ, например, фирмы "Изотоп"
и др.) или бокс безопасности II класса защиты.
5.6. Зону по подготовке проб и выделению нуклеиновых кислот
размещают в боксированном помещении (микробиологический бокс с
предбоксом) или в комнате заражения и вскрытия животных. Работу
проводят в боксе биологической безопасности II или III класса. В
рабочей зоне располагают оборудование и предметы, необходимые только
для предварительной обработки, выделения НК (примерный перечень
представлен в Прилож. 2).
5.7. Зону приготовления реакционных смесей и проведения ОТ и
ПЦР-амплификации располагают в боксированном помещении или боксе
биологической безопасности II класса (или ПЦР-боксе) - для подготовки
реакционных смесей для ОТ и ПЦР.
5.8. Работу по подготовке реакционных смесей для ПЦР и ОТ-ПЦР
проводят до доставки в бокс проб, поступающих из зоны выделения НК.
Смесь может быть приготовлена также за пределами помещений
лаборатории, предназначенных для работы с заразным материалом,
например в комнате (боксе) для розлива питательных сред.
5.9. При необходимости этап подготовки проб и выделения
нуклеиновых кислот может выполняться в одной комнате с этапом ПЦР при
наличии в ней бокса биологической безопасности II или III класса
защиты для выделения НК и бокса биологической безопасности II класса
(или ПЦР-бокса) - для подготовки реакционных смесей для ОТ и ПЦР.
Каждый бокс рассматривается как соответствующая рабочая зона.
5.10. Зону детекции результатов располагают в боксированном
помещении. При отсутствии боксированного помещения работу проводят в
отдельной комнате, при возможности в ПЦР-боксе.
5.11. При одновременном использовании двух методов детекции
продуктов амплификации - электрофоретического и ГиФА - следует
выделить отдельные помещения или две рабочие зоны. Оборудование и
принадлежности для каждого вида анализа маркируют применительно к
каждой зоне. Обмен посудой и пипетками между зонами не допускается.
5.12. Помещения ПЦР-лаборатории покрывают кафелем (пол, стены)
или масляной краской (стены, потолок), устойчивой к действию моющих и
дезинфицирующих средств.
5.13. Во всех помещениях устанавливают бактерицидные лампы.
Рекомендуется дополнительная установка переносного ультрафиолетового
бактерицидного облучателя-рециркулятора.
5.14. Окна должны быть плотно закрыты. Для защиты рабочих столов
от попадания прямого солнечного света используют светозащитные пленки
из материала, устойчивого к дезинфицирующим средствам. Использование
жалюзи не рекомендуется из-за адсорбции пыли.
5.15. Каждая рабочая зона должна иметь свой набор мебели,
лабораторного оборудования, реагентов, автоматических пипеток,
наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, защитной одежды, обуви,
резиновых перчаток, уборочного инвентаря и пр., используемых только в
данной комнате (рабочей зоне).
5.16. Имущество каждой рабочей зоны должно иметь маркировку
указанной зоны. Применение его в других помещениях или для других
видов исследований не допускается.
5.17. В рабочих зонах должен быть свой набор холодильников
(Прилож. 2):
- в комнате приема материала от 4 до 8 ёС, минус 20 ёС и минус 70
ёС (при необходимости длительного хранения материала);
- в комнате выделения нуклеиновых кислот от 4 до 8 ёС и минус 20
ёС для хранения набора выделения НК; от 4 до 8 ёС - для хранения
препаратов НК; не допускается хранение проб материала или препаратов
НК в одном холодильнике с компонентами набора для выделения НК;
- в комнате ПЦР-амплификации от 4 до 8 ёС и минус 20 ёС - для
хранения наборов обратной транскрипции и амплификации НК;
- в комнате детекции продуктов амплификации от 4 до 8 ёС - для
хранения наборов электрофоретической детекции и ГиФА.
5.18. Помещения ПЦР-лаборатории оборудуют приточно-вытяжной или
вытяжной вентиляцией, соответствующей требованиям п. п. 2.3.16 и 2.4.3
СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп
патогенности (опасности)".
5.19. При выполнении ПЦР воздухообмен внутри и между помещениями
может повышать опасность контаминации проб из-за вероятности
проникновения молекул НК и продуктов амплификации через фильтры.
Снижение этой опасности достигается указанной ниже системой вентиляции
лаборатории:
- следует полностью исключить воздухообмен между помещением для
детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) и остальными
комнатами ПЦР-лаборатории, а также другими помещениями организации
(давление воздуха в пост-ПЦР-помещении должно быть ниже, чем в
указанных помещениях);
- при смежном расположении комнаты приема материала и комнаты
выделения нуклеиновых кислот давление в последней должно быть не ниже,
чем в комнате приема материала;
- если обе названные комнаты, входящие в пре-ПЦР-помещение, имеют
смежное расположение с помещением для проведения ПЦР, давление воздуха
в них должно быть ниже, чем в ПЦР-помещении; при отдаленном размещении
ПЦР-помещения давление воздуха в нем должно быть не ниже, чем в
пре-ПЦР-помещении.
5.20. Разница в давлении воздуха в помещениях ПЦР-лаборатории
создается за счет различий в кратности воздухообмена в них. Расчеты
кратности воздухообмена с учетом требований проведения ПЦР-анализа и
требований "Инструкции по проектированию санитарно-эпидемиологических
станций" СН 535-81 (М.: Стройиздат, 1982) приведены в таблице:
---------------------------------------------------------------------
| Наименование помещения | Кратность |
| | воздухообмена |
| | (куб. м/ч) |
|-----------------------------------------------|-------------------|
| | приток | вытяжка |
|-----------------------------------------------|--------|----------|
| Зона приема и первичной обработки материала | 5 | 6 |
|-----------------------------------------------|--------|----------|
| Зона подготовки проб и выделения нуклеиновых | 5 | 6 |
| кислот | | |
|-----------------------------------------------|--------|----------|
| Зона приготовления реакционных смесей, | 5 | 5 |
| проведения ПЦР и ОТ-ПЦР | | |
|-----------------------------------------------|--------|----------|
| Зона учета результатов методом электрофореза | 5 | 7 |
| или ГиФА | | |
---------------------------------------------------------------------
5.21. При отсутствии системы вентиляции, указанной в п. п. 5.18 -
5.19, уменьшение вероятности контаминации проб достигается мерами по
ограничению воздухообмена между помещениями ПЦР-лаборатории.
5.22. При необходимости в ПЦР-лаборатории могут быть установлены
кондиционеры в соответствии с п. 2.4.5 СП 1.3.1285-03 "Безопасность
работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)".
6. Требования к проведению работ
6.1. Взятие материала производят согласно
инструктивно-методическим документам, регламентирующим выполнение
исследований для каждого вида возбудителя инфекций (Прилож. 3),
инструкциям к тест-системам и в соответствии с СП 1.3.1285-03
"Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности
(опасности)".
6.2. Транспортирование исследуемого материала и промежуточных
продуктов ПЦР-анализа из одного помещения в другое при невозможности
передачи их в смежные комнаты через шлюзовые передаточные окна
осуществляют в плотно закрывающихся контейнерах, обрабатываемых
дезинфицирующими средствами после каждого переноса проб.
6.3. Доставку проб для исследования, а также их хранение
осуществляют в закрывающихся металлических или пластмассовых
контейнерах, на дне которых размещают адсорбирующий материал (марлевая
салфетка, ткань, вата и пр.), смоченный раствором дезинфицирующего
средства. Контейнер помещают в сумку-холодильник или в контейнер с
хладагентами.
6.4. Манипуляции, сопровождающиеся риском образования аэрозоля
(встряхивание, центрифугирование и т.д.) при обработке материала и
выделении нуклеиновых кислот, выполняют в боксах биологической
безопасности II или III класса.
6.5. Приборы, оборудование и средства измерения должны быть
аттестованы (поверены), технически исправны, иметь технический паспорт
и рабочую инструкцию по эксплуатации.
6.6. Наконечники должны строго соответствовать автоматическим
пипеткам, пробирки для амплификации - термоциклерам (в соответствии с
инструкцией фирмы-производителя прибора). Обязательной является смена
наконечников для автоматических пипеток после завершения каждой
манипуляции.
7. Требования к защитной одежде
7.1. Выбор типа защитного костюма проводится в строгом
соответствии с СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами
I - II групп патогенности (опасности)" и определяется видом
возбудителя, рабочей зоной ПЦР, оснащением ее боксами биологической
безопасности (Прилож. 3).
7.2. Прием и первичную обработку материала, доставленного на
исследование (объединение или разделение проб, центрифугирование,
инактивацию и т.д.), выполняют в защитном костюме I - II или IV типа,
дополненном перчатками и, при необходимости, респиратором.
7.3. В помещении подготовки проб и выделения НК при исследовании
материала, инфицированного бактериями I - II групп, подвергнутыми
инактивации на этапе подготовки проб, работу проводят в боксе
биологической безопасности II класса в костюме IV типа, дополненном
резиновыми перчатками.
7.4. В связи с отсутствием регламентированных методов инактивации
вирусов II группы работу с материалом, зараженным или подозрительным
на зараженность возбудителями КГЛ, ТОРС, ГЛПС, ОГЛ, проводят в боксе
биологической безопасности III класса защиты в костюме IV типа и
резиновых перчатках или в боксе биологической безопасности II класса в
костюме I типа. Работу с другими вирусами II группы проводят в боксе
биологической безопасности II класса в защитном костюме IV типа,
дополненном резиновыми перчатками и респиратором.
7.5. На этапах проведения ПЦР, учета результатов работу проводят
в следующих видах защитной одежды:
- с обеззараженным материалом - в костюме IV типа, дополненном
резиновыми перчатками;
- с пробами, инфицированными возбудителями КГЛ, ТОРС, ГЛПС, ОГЛ,
- в костюме I типа или в боксе биологической безопасности II класса в
костюме IV типа, дополненного резиновыми перчатками и респиратором.
Работу с другими вирусами II группы проводят в защитном костюме IV
типа, дополненном респиратором и резиновыми перчатками.
7.6. В пост-ПЦР-помещении должны работать сотрудники, не занятые
на этапах подготовки проб и постановки ПЦР, при входе в помещение
надевают бахилы или сменную обувь.
7.7. Надевание и снятие защитной одежды производят в предбоксах.
В каждом из них должен быть отдельный комплект защитной одежды и
обуви.
7.8. Наиболее загрязненной продуктами амплификации считается
защитная одежда зоны детекции, и в первую очередь, резиновые перчатки.
Перед снятием одежды необходимо заменить перчатки на чистые.
7.9. Обработку одежды из комнат подготовки проб, ПЦР-амплификации
и учета результатов проводят раздельно.
8. Требования к обработке помещений
и обеззараживанию материала
8.1. Обработку помещений проводят в соответствии с требованиями
СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп
патогенности (опасности)". В комнатах, в которых проводят работу с
выделенными НК, рабочие поверхности, штативы, оборудование следует
обеззараживать ежедневно ультрафиолетовым излучением в течение 1 ч до
начала работы и после нее, полы подвергать ежедневной влажной уборке
дезинфицирующими средствами, регламентированными указанными
санитарными правилами, или 0,2%-ным раствором ДП-2Т, обладающим также
способностью инактивировать ампликоны. Перед началом работы рабочую
поверхность столов дополнительно обрабатывают 70%-ным этиловым
спиртом. Ежемесячно проводят профилактическую обработку рабочей
поверхности столов, оборудования, штативов 0,2%-ным раствором ДП-2Т.
8.2. Дважды в год (при необходимости чаще) осуществляют обработку
автоматических дозаторов. Дозаторы разбирают, обрабатывают моющим
раствором для удаления жирового загрязнения, после чего остатки
моющего средства удаляются ветошью, смоченной водой. Затем проводят
обработку 1 N соляной кислотой; время экспозиции - 1 ч. Остатки
раствора тщательно удаляют ветошью, смоченной водой, и проводят
обеззараживание влажных поверхностей ультрафиолетовым излучением в
течение 1 ч. По окончании обработки дозаторы собирают и проводят
калибровку в соответствии с прилагаемой инструкцией по пользованию
дозаторами. Автоклавируемые дозаторы обеззараживают паром под
давлением 2,0 кГс/кв. см (0,2 МПа) при температуре 132 +/- 2 ёС в
течение 60 мин.
8.3. Обеззараживание проб проводят в соответствии с МУ
3.5.5.1034-01 "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного
бактериями I - IV групп патогенности, при работе методом ПЦР". Порядок
обеззараживания проб и режимы дезактивации при постановке ПЦР
представлены в Прилож. 4 и 5.
8.4. При возникновении контаминации (получении повторных
положительных результатов в отрицательных контролях, а также при
тестировании контрольных смывов) в помещениях проводят мероприятия по
ликвидации контаминации. Объем мероприятий зависит от масштаба
контаминации, определяемого результатами исследования смывов (Прилож.
6).
Проведение ПЦР-исследований до завершения деконтаминационных
мероприятий не допускается.
9. Проведение внутрилабораторного контроля
9.1. Внутрилабораторный контроль проводят с периодичностью,
зависящей от объема выполняемой работы. Периодичность определяется
руководителем лаборатории.
9.2. Контроль осуществляют путем исследования шифрованных
"положительных" и "отрицательных" проб. В качестве "положительных"
могут использоваться образцы, искусственно контаминированные НК, или
уже ранее исследованные пробы, хранившиеся не более 1 недели при
температуре минус 20 ёС. В этих пробах определяют НК тех же
возбудителей, что и при первичном исследовании. В качестве
"отрицательных" применяют образцы, не содержащие НК возбудителей
инфекционных заболеваний, например транспортная среда, ДНК-буфер.
9.3. Количество проб должно быть достаточным для оценки работы
сотрудников и выявления контаминированных участков лаборатории.
9.4. Для выявления возможной контаминации лаборатории
нуклеиновыми кислотами контроль проводят путем взятия смывов с
поверхностей (Прилож. 6).
Приложение 2
ПРИМЕРНОЕ РАЗМЕЩЕНИЕ ОБОРУДОВАНИЯ
В РАБОЧИХ ЗОНАХ ПЦР-ЛАБОРАТОРИИ
Для обработки материала
1. Бокс биологической безопасности III класса защиты (допускается
использование бокса 2ШНЖ, например, фирмы "Изотоп" и др.) или бокса
биологической безопасности II класса защиты.
2. Центрифуга для пробирок объемом 5 - 100 мл.
3. Центрифуга/вортекс.
4. Микроцентрифуга до 16000 g для микроцентрифужных пробирок
объемом 1,5 мл.
5. Твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл с
диапазоном рабочих температур 25 - 100 град.С.
6. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой.
7. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.
8. Одноразовые полипропиленовые микроцентрифужные пробирки с
завинчивающимися или плотно закрывающимися крышками объемом 1,5 мл.
9. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с
аэрозольным барьером до 200 и до 1000 мкл.
10. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200
мкл.
11. Штативы для наконечников, микропробирок объемом 1,5 мл.
12. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8
град.С, минус 20 град.С и минус 70 град.С (при необходимости
длительного хранения материала).
13. Емкость с дезинфицирующим раствором.
Для выделения НК
1. Бокс биологической безопасности II или III класса биозащиты.
2. Центрифуга/вортекс.
3. Микроцентрифуга от 12 до 16000 g для микроцентрифужных
пробирок объемом 1,5 мл.
4. Твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл с
диапазоном рабочих температур 25 - 100 град.С.
5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой.
6. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.
7. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно
закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл.
8. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с
аэрозольным барьером до 200 и до 1000 мкл.
9. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200
мкл.
10. Штативы для наконечников, микропробирок на 1,5 мл.
11. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8
град.С, минус 20 град.С.
Для проведения обратной транскрипции и амплификации
1. Бокс биологической безопасности II класса или настольный бокс
с бактерицидной лампой.
2. Амплификатор.
3. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.
4. Одноразовые полипропиленовые пробирки для амплификации объемом
0,5 (0,2) мл.
5. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с
аэрозольным барьером до 100 мкл, свободные от РНКаз.
6. Штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 (0,2) мл.
7. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8
град.С, минус 20 град.С.
8. Емкость для сброса отработанных расходных материалов.
Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР
1. Камера для горизонтального электрофореза.
2. Источник постоянного тока с напряжением 150 - 460 В.
3. Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра
гелей.
4. Видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации
результатов.
5. Компьютер (должен быть связан через компьютерную сеть с
компьютером, располагающимся в чистой зоне и предназначенным для
анализа результатов электрофореза).
6. Аквадистиллятор.
7. Микроволновая печь для плавления агарозы.
8. Колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы
объемом 250 мл.
9. Мерный цилиндр объемом 1 л.
10. Штатив для микропробирок на 0,5 мл.
11. Отдельная автоматическая пипетка 10 - 40 мкл.
12. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200
мкл в штативе.
13. Холодильник с камерой, поддерживающей температуру от 2 до 8
град.С.
14. Емкость для сброса отработанных расходных материалов.
15. Пластиковая емкость объемом 5 л для дезактивации буфера и
гелей, содержащих бромид этидия.
Для гибридизационно-ферментной детекции продуктов ПЦР
1. Термостат планшетный, поддерживающий температуру 37 град.С.
2. Вошер (не обязательно).
3. Планшетный спектрофотометр.
4. Компьютер (должен быть связан через компьютерную сеть с
компьютером, располагающимся в чистой зоне и предназначенным для
анализа результатов гибридизации).
5. Восьмиканальная пипетка до 200 мкл.
6. Отдельный набор одноканальных автоматических пипеток
переменного объема.
7. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема.
8. Мерный цилиндр объемом 1 л.
9. Холодильник с камерой, поддерживающей температуру от 2 до 8
град.С.
10. Емкость для сброса отработанных расходных материалов.
Приложение 3
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СРЕДСТВ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ
В РАБОЧИХ ЗОНАХ ПЦР-ЛАБОРАТОРИИ
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
| Этап ПЦР-анализа | Вирусы | Вирусы II | Чума, | Глубокие | Бруцеллез, | Риккетсиозы | Холера |
| (рабочая зона) | I | группы | сап, | микозы | туляремия, | | |
| | группы | | мелиоидоз | | сибирская | | |
| | | | | | язва | | |
| | | | | | | | |
| | | | | | | | |
| | | | | | | | |
| | | | | | | | |
| | | | | | | | |
|---------------------------|-------------|--------------------------|------------|--------------------|------------|--------------------------|---------------|
| | | КГЛ, | другие | | | | | |
| | | ТОРС, | | | | | | |
| | | ГЛПС, | | | | | | |
| | | ОГЛ | | | | | | |
|---------------------------|-------------|------------|-------------|------------|--------------------|------------|--------------------------|---------------|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
|--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| I. Блок для работы с инфицированными животными |
|--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| Прием, разбор, первичная | инфицированными животными |
| обработка клинического | в условиях максимально изолированных лабораторий |
| материала от больных с | ИСИЗ или боксы биологической безопасности III класса + |
| неясной этиологией (не | защитная одежда IV типа + РП |
| исключая наличия вирусов | |
| I группы) | |
|---------------------------|----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| Прием, разбор, первичная | ИСИЗ | при наличии возможности устанавливают бокс |
| обработка: | <*> | биологической безопасности (БББ) II или III класса |
| | или | |
| - клинического материала | БББ | |
| от больных с подозрением | III |--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| на ООИ; | класса | | | | | | | |
| | + IV | | | | | | | |
|---------------------------|-------------|------------|-------------|------------|--------------------|------------|--------------------------|---------------|
| - проб объектов | тип + | | | | | | | |
| окружающей среды | РП | | | | | | | |
| | <**> | | | | | | | |
|---------------------------|-------------|------------|-------------|------------|--------------------|------------|--------------------------|---------------|
| | | I тип | II | I тип | I тип | II | II тип | IV |
| | | | тип | | | тип | | тип |
| | | | | | | | | + РП |
|---------------------------|-------------|--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| Подготовка проб, | ИСИЗ | бокс биологической безопасности II класса |
| выделение нуклеиновых | или |--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| кислот | БББ | | | | | | | |
| | III | | | | | | | |
| | класса | | | | | | | |
| | + IV | | | | | | | |
| | тип + | | | | | | | |
| | РП | | | | | | | |
|---------------------------|-------------|------------|-------------|------------|--------------------|------------|--------------------------|---------------|
| | | I тип | II | I тип | I тип | II | II тип | IV |
| | | | тип | | | тип | | тип |
| | | | | | | | | + РП |
|--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| II. Боксированное помещение (микробиологический бокс с предбоксом) |
|--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| Прием, разбор, первичная | ИСИЗ | бокс биологической безопасности II класса |
| обработка материала | или |--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| | БББ | | | | | | | |
| | III | | | | | | | |
| | класса | | | | | | | |
| | + IV | | | | | | | |
| | тип + | | | | | | | |
| | РП | | | | | | | |
|---------------------------|-------------|------------|-------------|------------|--------------------|------------|--------------------------|---------------|
| | | I тип | IV | IV | IV | IV | IV тип | IV |
| | | | тип | тип | тип | тип | + РП + | тип |
| | | | + респиратор| + РП | + РП | + РП | респиратор | + РП |
| | | | + РП | + | + респиратор | | | |
| | | | | респиратор | | | | |
| | | | | (мелиоидоз)| | | | |
|---------------------------|-------------|--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| | | бокс биологической безопасности III класса |
|---------------------------|-------------|--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| | | IV | IV | IV | IV | IV | IV тип | IV |
| | | тип | тип | тип | тип | тип | + РП | тип |
| | | + РП | + РП | + РП | + РП | + РП | | + РП |
|---------------------------|-------------|--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| | | при отсутствии бокса биологической безопасности |
| | |--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| | | I тип | II | I тип | I тип | I тип | II тип | IV |
| | | | тип | | | | | тип |
| | | | | | | | | + РП |
|---------------------------|-------------|--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| Подготовка | ИСИЗ | бокс биологической безопасности II класса |
| необеззараженных проб, | или |--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| выделение нуклеиновых | БББ | | | | | | | |
| кислот | III | | | | | | | |
| | класса | | | | | | | |
| | + IV | | | | | | | |
| | тип + | | | | | | | |
| | РП | | | | | | | |
|---------------------------|-------------|------------|-------------|------------|--------------------|------------|--------------------------|---------------|
| | | I тип | IV | IV | IV | IV | IV тип | IV |
| | | | тип | тип | тип | тип | + респиратор + РП | тип |
| | | | + | + РП | + респиратор | + РП | | + РП |
| | | | респиратор | + | + РП | | | |
| | | | + РП | респиратор | | | | |
| | | | | (мелиоидоз)| | | | |
|---------------------------|-------------|--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| | | бокс биологической безопасности III класса |
|---------------------------|-------------|--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| | | IV | IV | IV | IV | IV | IV тип | IV |
| | | тип | тип | тип | тип | тип | + РП | тип |
| | | + РП | + РП | + РП | + РП | + РП | | + РП |
|---------------------------|----------------------------------------|------------|--------------------|------------|--------------------------|---------------|
| Подготовка обеззараженных | отсутствуют | БББ | отсутствуют | БББ | отсутствуют | БББ |
| проб, выделение | регламентированные способы | II | регламентированные | II | регламентированные | II |
Страницы: 1 2 |