4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ И САНИТАРНО-ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВОДЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Методика. Министерство здравоохранения РФ. 03.03.04 МУК 4.2.1884-04

2.11.4. Подготовка и проведение исследования

     2.11.4.1. Приготовление растворов.
     Десятикратные   концентраты   элюирующих   растворов  готовят  на
стерильной дистиллированной воде.
     1)  30,3  г триса (Tris [hydroxymethyl]aminomethane) растворяют в
300  - 400 мл воды, доводят значение рН до 9,1 концентрированной НСl и
оставляют на 1 сутки при комнатной температуре. Затем проверяют (и при
необходимости  доводят  еще  раз)  значение  рН до 9,1. Конечный объем
раствора (500,0 мл) получают добавлением дистиллированной воды.
     2) 30,3 г триса + 145 г NaCl на 500,0 мл раствора, рН 9,1.
     3)  150,0  г  мясного  экстракта  (Вееf  Extract Powder) + 350 мл
трисбуфера, рН 9,1.
     Растворы автоклавируют 15 мин. при 1 атмосфере (121 град.С).
     Рабочие   разведения   элюэнтов  получают  добавлением  9  частей
стерильной   дистиллированной   воды   к  1  части  концентрированного
раствора.
     2.11.4.2. Подготовка макропористого стекла.
     Для   повышения   сорбционных   свойств   макропористое   стекло,
представляющее собой белый порошок, обрабатывают следующим образом:
     1) 1 объем стекла заливают в колбе 1-м объемом смеси (1:1) 3%-ным
р-ром  Н2О2  и  6  М НСl и кипятят в вытяжном шкафу в течение 1 ч (без
пробки),  соблюдая  меры  предосторожности.  Полученное  МПС  отмывают
большим  количеством дистиллированной воды до нейтрального значения рН
и высушивают при 100 град.С.
     2)  1  г  подготовленного  сорбента помещают в пакет из флизелина
размером 5 x 7 см.
     2.11.4.3. Подготовка хроматографической колонки.
     Колонки обрабатывают    силиконовой    жидкостью    (Serva)   для
предотвращения адсорбции вирусов.  Для  этого  внутреннюю  поверхность
колонки  смачивают  данной  силиконовой жидкостью,  после чего колонку
выдерживают 1 ч  при  t  =  100  град.С.  Силиконовую  жидкость  можно
использовать многократно.
     2.11.4.4. Отбор проб и обработка проб.
     Пакет  с  сорбентом  закрепляют  с  помощью  лески  так, чтобы он
оказался  в  потоке воды. После экспозиции в течение 3 - 7 суток пакет
вынимают,  помещают в новый полиэтиленовый мешочек и стерильный флакон
и  транспортируют  в  лабораторию  в  сумке-холодильнике. Каждую пробу
маркируют с указанием населенного пункта, точки отбора, даты установки
и  времени  экспозиции  пакета.  Материал  доставляют  в лабораторию в
максимально  короткий  срок (не более 6 ч). Доставленные в лабораторию
пробы регистрируют в рабочем журнале.
     До проведения  элюции  вирусов  пакеты в полиэтиленовом мешке или
стерильном флаконе можно хранить в холодильнике при 4 град.С не  более
1 суток.
     В  лаборатории  пакет с сорбентом извлекают из транспортировочной
емкости  и  помещают  в  стерильную чашку Петри. Обрезают край пакета,
вымывают  стекло  стерильной дистиллированной водой (~ 5 мл) с помощью
пипетки  в эту же чашку Петри и переносят пипеткой или через воронку в
колонку  объемом 5 - 10 мл. Вирусы элюируют последовательно 3 рабочими
растворами элюэнтов по 3,0 мл каждый (рабочие разведения элюэнтов - п.
2.11.4.1), собирая их в отдельные пенициллиновые флаконы.
     В  тех  случаях,  когда  дальнейшие вирусологические исследования
проводят на   культуре   клеток,   полученные   элюаты    обрабатывают
хлороформом  и  антибиотиками  для  удаления бактериальной флоры.  Для
этого к 1 объему  элюата  добавляют  1  объем  хлороформа,  интенсивно
встряхивают 5 - 10 мин. и центрифугируют 10 мин. при 2000 об./мин. для
разделения  фракций.  Водную  фракцию  (верхнюю)  аккуратно   отбирают
пипеткой   в   стерильный  флакон  и  добавляют  1000  ЕД  пенициллина
(бензилпенициллина натриевую соль) и 10,0 мг  сульфата  стрептомицина.
Обработанные  элюаты  до  заражения  культур ткани можно хранить при 4
град.С в течение 3-х суток.  При температуре -20 град.С  элюаты  можно
хранить  в  течение  1  года.  В  случае  необходимости  многократного
исследования  элюаты  делят  на  несколько  порций,   чтобы   избежать
повторного замораживания.
     Исследования  полученных  элюатов  на  наличие  энтеровирусов  на
культуре  ткани рекомендуется проводить в соответствии с "Руководством
по вирусологическим исследованиям на полиомиелит" (ВОЗ, 1998).