Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".
4. Аппаратура, материалы и реактивы
4.1. Компьютерная программа "Imageware" для анализа изображений,
полученных с помощью "Чипдетектора-03" [1].
4.2. Комплекс аппаратно-программный для анализа флуоресценции
биологических микрочипов типа "Чипдетектор-03" [2].
4.3. Амплификатор ДНК типа "Терцик" под микроцентрифужные
пробирки вместимостью 0,2, 0,5 куб. см со скоростью нагрева/охлаждения
активного элемента не менее 1,5 град.С/с [3].
4.4. Термостат суховоздушный типа ТВЗ-25 с рабочей температурой
37 град.С, рабочий диапазон от 20 до 60 град.С, точность поддержания
температуры +/- 1 град.С [4].
4.5. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 высокого
класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности
однократного взвешивания не более +/- 0,0001 г.
4.6. Камера морозильная по ГОСТ 26678, обеспечивающая температуру
минус 20 град.С.
4.7. Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.
4.8. Микроцентрифуга настольная типа 5415С с частотой вращения
-1
не менее 13000 мин. [5].
4.9. Мешалка магнитная с подогревом [6].
4.10. Аппарат для встряхивания типа CV-1500 с частотой вращения
-1
не менее 1500 мин. [7].
4.11. рН-метр с набором электродов, с погрешностью измерений +/-
0,1 рН.
4.12. Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5 - 10,0
куб. мм (шаг - 0,1 куб. мм, точность +/- 2,5 - 10,0%,
воспроизводимость 3 - 7%); 5,0 - 50,0 куб. мм (шаг - 0,5 куб. мм,
точность +/- 2,0 - 5,0%, воспроизводимость 2,5 - 5%); 20,0 - 200,0
куб. мм (шаг - 1,0 куб. мм, точность +/- 1,5 - 2,0%, воспроизводимость
2 - 3%); 100 - 1000 куб. мм (шаг - 5 куб. мм, точность +/- 1,0 - 1,5%,
воспроизводимость 1 - 2%).
4.13. Штативы под микроцентрифужные пробирки типа RP-30 и RP-80
на 30 и 80 шт. [8].
4.14. Наконечники с фильтром для микродозаторов (микропипеток) с
переменным объемом дозирования жидкостей до 10; 20; 200; 1000 куб. мм
[9].
4.15. Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2;
0,5 и 1,5 куб. см стерильные.
4.16. Пестик или палочка стеклянные по ГОСТ 21400 для
микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 куб. см.
4.17. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные по ГОСТ 1770 на 25,
100, 250 и 1000 куб. см.
4.18. Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические по ГОСТ
25336 вместимостью 50 - 1000 куб. см.
4.19. Пипетки стеклянные градуированные по ГОСТ 29227.
4.20. Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
4.21. Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.
4.22. Кислота соляная концентрированная по ГОСТ 3118, хч.
4.23. Натрий хлористый по ГОСТ 4233, хч.
4.24. Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль дигидрат
(ЭДТА) [10].
4.25. Трис(оксиметил)аминометан [11].
4.26. Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, хч.
4.27. Спирт изопропиловый по ГОСТ 9805, хч.
4.28. Додецилсульфат натрия (SDS) [12].
4.29. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
4.30. Вода особо чистая стерильная, не содержащая ДНК, РНК и
дезоксирибонуклеаз.
4.31. Фермент термостабильный Taq-полимераза, оптимум активности
при 70 - 72 град.С [13].
4.32. ПЦР буфер десятикратный (10х; 12,1 г в 1 куб. дм Трис-НСl,
рН 8,8; 37,28 г в 1 куб. дм КСl, 5% Твин-20, 50% формамид; 142,83 мг в
1 куб. дм MgCl2.
4.33. Гуанидин тиоцианат [14].
4.34. М-[2-оксиэтил]пиперазин-N`-[2-этансульфоновая кислота]
(HEPES) [15].
4.35. Масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164.
4.36. Раствор водный дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: дАТФ, дГТФ,
дТТФ, дЦТФ с концентрацией 2 мМ каждого [16].
4.37. Раствор заведомо трансгенной ДНК (около 100 нг/куб. мм или
6
10 копий/куб. мм) [17].
4.38. Раствор заведомо нетрансгенной ДНК (около 100 нг/куб. мм
6
или 10 копий/куб. мм) [18].
4.39. Баня водяная [19].
4.40. Раствор водный праймеров "ПР-1" для амплификации
соответствующих участков генома, включающий следующие пары
праймеров:
праймеры на промотор 35S вируса мозаики цветной капусты:
35S_п 5` ССТ ССТ CGG ATT CCA TTG ССС AG (23 н.о.)
35S_оф 5` GTC CAT СТТ TGG GAC САС ТGТ CGG (24 н.о.);
праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:
gus_п 5` AAG CCG GGC AAT TGC ТGТ GCC А (22 н.о.)
gus_оф 5` GAC CGC АТС GAA ACG CAG САС G (22 н.о.);
праймеры на промотор nos из агробактерии Agrobacterium
tumefaciens:
nos_п 5` CGA TGA CGC GGG АСА AGC CGT (21 н.о.)
nos_оф 5` GAC СТТ AGG CGA CTT TTG AAC GCG С (25 н.о.);
праймеры на маркерный ген npt II из транспазона Tn5
бактериального происхождения:
npt_п 5` GTG ТТС CGG CTG TCA GCG CAG G (22 н.о.)
npt_оф 5` CGC AAG GAA CGC CCG TCG TGG (21 н.о.);
праймеры на терминатор ocs из агробактерии Agrobacterium
tumefaciens:
ocs_п 5` GCG AGA CGC СТА TGA TCG CAT GAT (24 н.о.)
ocs_оф 5` GAA ACC GGC GGT AAG GAT CTG AGC (24 н.о.).
Примечание. В обозначениях праймеров индекс "_п" означает
"прямой", индекс "_оф" означает "обратный флуоресцентномеченый"; н.о.
- нуклеотидные остатки [20].
4.41. Биологический микрочип с иммобилизованными
олигонуклеотидами, приведенными в табл. 1 [21].
Таблица 1
ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
--------------------------------------------------------------------
| Наименование | Детектируемая | Последовательность |
| олигонуклеотида | мишень | олигонуклеотида |
|-----------------|---------------|--------------------------------|
| 35S_и | промотор 35S | 5` GCC АТС ATT GCG ATA AAG G |
|-----------------|---------------|--------------------------------|
| gus_и | ген gus | 5` CTG GTA TCA GCG CGA A |
|-----------------|---------------|--------------------------------|
| nos_и | промотор nos | 5` GCT AAG CAC ATA CGT CAG AA |
|-----------------|---------------|--------------------------------|
| npt_и | ген npt II | 5` GGC AGC GCG GCT АТС |
|-----------------|---------------|--------------------------------|
| ocs_и | терминатор | 5` ТТС ТGТ ТGТ GСА СGТ ТGТ А |
| | ocs | |
--------------------------------------------------------------------
Примечание. Индекс "_и" означает "иммобилизованный". еотидами,
Биологический микрочип представляет собой стандартное предметное
стекло по ГОСТ 9284 для световой микроскопии, на поверхности которого
в определенном порядке расположены 10 микроскопических ячеек (рис. 1),
заполненных полиакриламидным гелем. Каждая из пяти верхних ячеек
содержит индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид
(35S, gus, nos, npt или ocs). Три ячейки с индексом "НК" не содержат
ранее перечисленных индивидуальных ковалентно иммобилизованных
олигонуклеотидов и выполняют роль отрицательного контроля
гибридизации. Две ячейки с индексом "М" содержат ковалентно связанный
флуоресцентный краситель и предназначены для однозначной ориентации
биологического микрочипа. Поверхность биологического микрочипа с
ячейками должна быть закрыта пластиковой крышкой с отверстиями,
которая вместе с предметным стеклом образует замкнутое пространство,
предназначенное для проведения гибридизации анализируемой пробы.
----------------------------------------------------------------------
| |
| ------------------------------------------- |
| | --|---- 1 |
| | --------- | |
| | | 35S_и |---|---- |
| | --------- | | |
| | | | |
| | --------- --------- | | |
| ----|----------------| gus_и | | nos_и |---|---| |
| | | --------- --------- | | |
| | | | | |
| | | --------- --------- | | |
| |---|----------------| npt_и | | osc_и |---|---| |
| 2 -| | --------- --------- | |- 2 |
| |---|--------------------- | | |
| | | --------- --------- --------- | | |
| |---|---| НК | | НК | | НК |---|---| |
| | | --------- --------- --------- | | |
| | | | | |
| | | --------- --------- | | |
| ----|---| М | | М |---|---- |
| | --------- --------- | |
| | | |
| ------------------------------------------- |
| |
| 1 - предметное стекло |
| 2 - гелевые ячейки |
----------------------------------------------------------------------
Рисунок 1. Схема биологического микрочипа
для идентификации генетически модифицированных источников
растительного происхождения
Допускается применение других средств измерений с
метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с
техническими характеристиками не хуже указанных выше.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".