Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".
6. Подготовка к проведению анализа
6.1. Приготовление растворов
6.1.1. Приготовление раствора NaOH концентрации 40 г/куб. дм.
В стеклянную плоскодонную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 100
куб. см помещают 4,0 г сухой гидроокиси натрия по ГОСТ 4328 и
растворяют в 100 куб. см особо чистой стерильной воды по 4.30. После
охлаждения раствора до комнатной температуры его переливают в
специальную щелочеустойчивую пластиковую плотно закрывающуюся емкость.
Срок хранения при комнатной температуре - не более одного года.
6.1.2. Приготовление раствора ЭДТА концентрации 186,12 г/куб. дм.
В стеклянную плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см помещают
18,61 г ЭДТА по 4.24, растворяют в 80 куб. см особо чистой стерильной
воды при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке [6]. Затем
раствором гидроокиси натрия по 6.1.1 доводят рН раствора до 8,0.
Полученный раствор переливают в мерную колбу по ГОСТ 12738
вместимостью 100 куб. см и особо чистой стерильной водой доводят объем
этого раствора до метки. Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678
при температуре 4 - 5 град.С - не более 6 мес.
6.1.3. Приготовление 70%-го раствора этилового спирта.
В мерную колбу вместимостью 200 куб. см по ГОСТ 12738 вносят 140
куб. см 96%-ного этилового спирта высокой степени очистки по ГОСТ Р
51652, добавляют 52 куб. см особо чистой стерильной воды и
перемешивают. Срок хранения при температуре 4 - 5 град.С - не более 6
мес.
6.1.4. Приготовление гибридизационного буфера.
В стеклянный стакан или плоскодонную колбу вместимостью 300 - 500
куб. см помещают точно отмеренные количества: 44,33 (+/- 0,01) г
гуанидин тиоцианата - по 4.33 [14], 4,88 (+/- 0,01) г
N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N`-[2-этансульфоновой кислоты] натриевой
соли (HEPES) по 4.34 [15]. Затем стеклянной пипеткой по ГОСТ 29227
вместимостью 5 куб. см приливают 3,75 (+/- 0,05) куб. см раствора
ЭДТА, приготовленного по 6.1.2, и цилиндром вместимостью 250 куб. см
добавляют 200 куб. см особо чистой стерильной воды. Стакан с раствором
помещают на магнитную мешалку по 4.9 [6] и перемешивают до полного
растворения компонентов. Доводят значение рН буфера до 7,5 (+/- 0,1)
добавлением раствора гидроокиси натрия, приготовленного по 6.1.1.
Полученный раствор из стакана переносят в мерную колбу вместимостью
250 куб. см, доводят объем до метки особо чистой стерильной водой и
разливают по 50 куб. см в плоскодонные колбы с притертыми пробками.
Срок хранения при температуре 2 - 8 град.С - не более 12 мес.
6.1.5. Приготовление раствора Трис-HCl концентрации 242,2 г/куб.
дм.
В колбу вместимостью 100 куб. см помещают 24,22 г Трис
(оксиметил) аминометана по 4.25 [11] и растворяют приблизительно в 80
куб. см особо чистой стерильной воды. Концентрированной соляной
кислотой по ГОСТ 3118 доводят рН раствора до 7,5, а объем - до 100
куб. см особо чистой стерильной водой. Срок хранения при комнатной
температуре - не более 6 мес.
6.1.6. Приготовление раствора NaCl концентрации 146,2 г/куб. дм.
В плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 14,62 г
хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в 70 - 80 куб. см особо
чистой стерильной воды, затем полученный раствор переносят в мерную
колбу вместимостью 100 куб. см и особо чистой стерильной водой доводят
до метки. Срок хранения при комнатной температуре - не более одного
года.
6.1.7. Приготовление раствора 20%-ного додецилсульфата натрия
(SDS) [12].
В стеклянную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 20 г сухого
додецилсульфата натрия по 4.27 и добавляют 80 куб. см особо чистой
стерильной воды. Растворяют при плавном перемешивании на магнитной
мешалке и одновременном нагревании до температуры 40 - 50 град.С до
полного растворения. Срок хранения при комнатной температуре - не
более одного года.
6.1.8. Приготовление буфера экстракции.
В мерной колбе вместимостью 50 куб. см смешивают 5 куб. см
раствора Трис-HCl, приготовленного по 6.1.5, 5 куб. см раствора NaCl,
приготовленного по 6.1.6, 1,25 куб. см раствора 20%-ного SDS,
приготовленного по 6.1.7, и 2,5 куб. см раствора ЭДТА, приготовленного
по 6.1.2; каждый раствор отбирают отдельной стеклянной пипеткой. Объем
раствора доводят до 50 куб. см особо чистой стерильной водой. Срок
хранения при температуре 4 - 5 град.С - не более двух недель, в
морозильной камере по ГОСТ 26678 при температуре минус 20 град.С - не
более одного года.
6.1.9. Раствор Taq-полимеразы по 4.31 хранят при температуре
минус 20 град.С не более одного года. Не допускается хранение раствора
Taq-полимеразы ниже температуры минус 23 град.С.
6.2. Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК)
6.2.1. Две навески каждого анализируемого продукта массой 60 - 80
мг помещают в две чистые стерильные микроцентрифужные пробирки по 4.15
вместимостью 1,5 куб. см, в течение 15 - 20 с доводят до состояния
однородной смеси пестиком по ГОСТ 21400 при комнатной температуре и
сразу микродозатором добавляют по 400 куб. мм буфера экстракции,
приготовленного по 6.1.8.
6.2.2. Микроцентрифужные пробирки со смесью, приготовленной по
6.2.1, интенсивно встряхивают в течение 5 с на аппарате для
встряхивания по 4.10 [7], быстро нагревают на водяной бане [19] до
температуры 65 град.С и выдерживают при этой температуре 15 - 20 мин.,
периодически осторожно перемешивая содержимое.
6.2.3. Микроцентрифужные пробирки со смесью, приготовленной по
6.2.2, центрифугируют при комнатной температуре в настольной
-1
центрифуге по 4.8 [5] при частоте вращения 13000 мин. в течение 5 мин.
6.2.4. Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.3, отбирают по
300 куб. мм и переносят в чистые микроцентрифужные пробирки,
содержащие по 300 куб. мм изопропилового спирта по ГОСТ 9805.
Содержимое перемешивают, выдерживают 5 мин. при комнатной температуре
-1
и центрифугируют 5 мин. при частоте вращения 13000 мин. .
6.2.5. Надосадочную жидкость по 6.2.4 тщательно удаляют
микродозатором, а осадок ДНК, полученный по 6.2.4, промывают 1 куб. см
70%-ного этилового спирта, приготовленного по 6.1.3 и охлажденного до
температуры 0 - 4 град.С, центрифугируют аналогично 6.2.4. Полученную
надосадочную жидкость вновь тщательно удаляют, а осадок ДНК
подсушивают при комнатной температуре до полного удаления этилового
спирта, но не более 30 мин.
6.2.6. Осадок ДНК, полученный по 6.2.5, перерастворяют в 40 - 50
куб. мм особо чистой стерильной воды. Полученный раствор ДНК
используют для проведения амПЦР. Срок хранения раствора ДНК при
температуре минус 20 град.С - не более одного года.
6.3. Подготовка асимметричной мультиплексной ПЦР
6.3.1. Приготовление реакционной смеси для амПЦР <*>.
--------------------------------
<*> Реакционную смесь для амПЦР готовят непосредственно перед
анализом при температуре не выше 20 град.С.
6.3.1.1. В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 куб. см
микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 3
куб. мм 10х буфера реакционного для ПЦР по 4.32; 3 куб. мм смеси
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов по 4.36 [16], 2,5 куб. мм фермента
Taq-полимеразы по 4.31 [13] (концентрацией 5 ед. акт./куб. мм) <*>, а
также водный раствор праймеров по 4.40 [20] в следующих концентрациях
(нг/куб. дм):
35S_п/35S_оф - 15,32/81,02;
gus_п/gus_оф - 3,75/37,59;
nos_п/nos_оф - 3,61/84,74;
npt_п/npt_оф - 7,51/36,01;
ocs_п/ocs_оф - 8,18/41,41.
--------------------------------
<*> Срок хранения Taq-полимеразы после разведения при температуре
от 2 до 8 град.С - не более 2 ч.
Смесь разбавляют особо чистой стерильной водой до объема 27 куб.
мм (из расчета на одну анализируемую пробу) и осторожно перемешивают в
течение 3 - 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования
пены. Общий объем реакционной смеси для амПЦР готовят с учетом числа
анализируемых проб и двух контрольных проб: положительный контроль
(заведомо трансгенная ДНК по 4.37) и отрицательный контроль (заведомо
нетрансгенная ДНК по 4.38).
6.3.1.2. Реакционную смесь для амПЦР, полученную по 6.3.1.1,
осаждают кратковременным (10 - 15 с) центрифугированием на настольной
-1
центрифуге при частоте вращения 1500 - 3000 мин. и сразу же используют
для проведения анализа.
6.3.2. Все этапы амПЦР должен проводить квалифицированный,
специально обученный персонал в соответствии с требованиями [22]. Для
проведения амПЦР допускается использовать только стерильную
лабораторную посуду и новые стерильные микроцентрифужные пробирки. При
проведении амПЦР каждую микроцентрифужную пробирку открывают только
перед отбором или внесением анализируемой пробы, а по окончании
манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно
несколько микроцентрифужных пробирок с анализируемыми пробами и
оставлять их открытыми длительное время. Каждую анализируемую пробу
отбирают микродозатором с новым стерильным наконечником с фильтром.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".