МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Методика. Главный государственный санитарный врач РФ. 06.03.04 МУК 4.2.1903-04

7. Проведение анализа

     7.1. Проведение асимметричной мультиплексной ПЦР
     7.1.1.  Реакционную  смесь  для  амПЦР,  полученную  по  6.3.1.2,
микродозатором вносят в чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью
0,2 или 0,5 куб. см по 27 куб. мм в каждую.
     7.1.2.    Анализируемую    ДНК,   выделенную   по   6.2,   вносят
микродозатором по 3 куб. мм в микроцентрифужные пробирки с реакционной
смесью  для амПЦР по 7.1.1. При использовании амплификатора ДНК по 4.3
[3]  без  подогрева  крышки  в  каждую  микроцентрифужную  пробирку  с
реакционной  смесью  вносят  по  30 куб. мм вазелинового масла по ГОСТ
3164  для предохранения реакционной смеси от испарения водной фазы при
амПЦР.  В  этом  случае  анализируемую  ДНК  вносят  под слой масла, в
результате чего образуются водная и масляная фазы.
     7.1.3.  В  две  другие  микроцентрифужные пробирки микродозатором
вносят  по  3 куб. мм раствора заведомо трансгенной ДНК (положительный
контроль)   и   раствора  заведомо  нетрансгенной  ДНК  (отрицательный
контроль).
     7.1.4.  Все микроцентрифужные пробирки со смесями, полученными по
7.1.2, и растворами, подготовленными по 7.1.3, помещают в амплификатор
ДНК и проводят амПЦР по программе, указанной в табл. 2.

                                                             Таблица 2

                      ПРОГРАММА ПРОВЕДЕНИЯ амПЦР

-----------------------------------------------------------------------
| Шаг программы  | Температура, | Время         |   Число циклов      |
|                | град.С       |  инкубации    |                     |
|----------------|--------------|---------------|---------------------|
| 1              |  95          | 5 мин.        |   1                 |
|                |--------------|---------------|                     |
|                |  95          | 30 с          |                     |
|----------------|--------------|---------------|---------------------|
| 2              |  62          | 30 с          |   37                |
|                |--------------|---------------|                     |
|                |  72          | 30 с          |                     |
|----------------|--------------|---------------|---------------------|
| 3              |  72          | 5 мин.        |   1                 |
-----------------------------------------------------------------------

     7.2. Гибридизация на биологическом микрочипе
     7.2.1. В  необходимое   количество   микроцентрифужных   пробирок
микродозатором   вносят   по  24  куб.  мм  гибридизационного  буфера,
приготовленного по 6.1.4.  Затем к гибридизационному буферу  добавляют
по   12  куб.  мм  водной  фазы  ПЦР-смеси,  полученной  в  результате
проведения амПЦР по 7.1.4,  и перемешивают в течение  20  -  30  с  на
аппарате  для  встряхивания  по 4.10 с частотой вращения не менее 1500
   -1
мин. для получения гибридизационной смеси.
     7.2.2. Из  каждой   микроцентрифужной   пробирки   микродозатором
отбирают   по   28   куб.   мм  гибридизационной  смеси  (для  каждого
биологического  микрочипа),  полученной  по  7.2.1,  и   помещают   на
поверхность  биологического  микрочипа  через  отверстие в пластиковой
крышке.  Гибридизацию проводят в термостате  [4]  при  температуре  37
град.С в течение 18 ч.
     7.2.3. После окончания гибридизации пластиковые  крышки  снимают,
каждый  биологический микрочип трижды промывают дистиллированной водой
по ГОСТ 6709 при температуре 25  град.С  и  высушивают  при  комнатной
температуре.
     Схема    метода    идентификации   генетически   модифицированных
источников (ГМИ) растительного происхождения приведена в прилож. Б (не
приводится).