Фрагмент документа "МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ВОДОЕМОВ".
3. Методы исследований
Санитарно-бактериологическую оценку водоема проводят по следующим
показателям: МАФАнМ - мезофильно-аэробные и факультативно анаэробные
микроорганизмы (общее микробное число - ОМЧ или сапрофитные
микроорганизмы); колититр (определение титра бактерий группы кишечных
палочек) - показатель фекального загрязнения; наличие аэромонад и
псевдомонад (показатели возможного неблагополучия водоемов по
аэромонозу и псевдомонозу).
3.1. Определение микробного числа (МАФАнМ КОЕ/куб. см (г)) воды
(грунта).
Микробное число определяют чашечным методом, методом предельных
разведений или - ориентировочно - пробой с резазуринатом натрия.
3.1.1. Проба с резазуринатом натрия
Метод используют как ориентировочный, не исключающий определение
микробного числа чашечным методом или методом предельных разведений. В
зависимости от количества микроорганизмов в исследуемой пробе через
определенное время происходит изменение синего цвета раствора
резазурината натрия в фиолетовый, красный или обесцвечивание.
К 9,0 мл исследуемой воды добавляют 1,0 мл стерильного
мясопептонного бульона (МПБ) и 1,0 мл 0,01%-ного водного раствора
резазурината натрия (резазурина). Содержимое пробирок перемешивают и
пробы помещают в термостат при температуре 37 град.С. Одновременно
ставится контроль: 9 мл дистиллированной воды + 1,0 мл МПБ + 1,0 мл
0,01%-ного водного раствора резазурината натрия. Через каждый час
визуально учитывают результаты. Изменение цвета в фиолетовый через 2 -
3 часа и в красный (розовый) через 3 - 4 часа свидетельствует о
неудовлетворительном, а в фиолетовый через 4 - 5 и красный (розовый)
через 6 - 7 часов - о сомнительном, в более поздние сроки - об
удовлетворительном качестве воды. Цвет среды в контрольных пробирках
должен быть синим. Раствор резазурината натрия готовят перед
использованием.
3.1.2. Чашечный метод
Сущность метода заключается в высеве определенного объема
исследуемой воды или ее разведений в чашки Петри в глубину агара и
последующем подсчете выросших колоний. При этом исходят из того, что
каждая колония является результатом размножения одной клетки. Работа
этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев в
чашки Петри, подсчет выросших колоний.
Разведения готовят в стерильном физрастворе, пользуясь постоянным
коэффициентом разведения, равным 10.
Для приготовления разведений физраствор разливают по 9,0 (4,5) мл
в стерильные сухие пробирки. Затем 1,0 (0,5) мл исследуемой воды,
взятой стерильной пипеткой, переносят в пробирку с физраствором - это
первое разведение 1:10. Полученную в первом разведении суспензию
тщательно перемешивают стерильной пипеткой. Этой же пипеткой берут 1,0
(0,5) мл полученного разведения и переносят во вторую пробирку с
физраствором - это второе разведение 1:100. Таким же образом готовят и
последующие разведения.
Заранее приготовленный МПБ подогревают на водяной бане до 45
град.С. Стерильные чашки Петри раскладывают на столе и подписывают на
крышках номер пробы, дату посева и степень разведения. Из каждой пробы
воды и ее разведений производят посев по 1,0 мл параллельно на две
чашки с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний.
С флаконов, содержащих исследуемую воду, снимают бумажные
колпачки, вынимают пробки, горлышки фламбируют, после чего воду
тщательно перемешивают осторожным продуванием воздуха через стерильную
пипетку. Эту операцию производят перед приготовлением разведений.
Стерильной пипеткой отбирают 1 мл воды (и ее разведений), вносят
в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку. При этом для каждой
пробы воды и для каждого разведения используется отдельная стерильная
пипетка. Посевы из разведений можно делать одной пипеткой, но начинать
следует обязательно из большего разведения.
После внесения воды (и ее разведений) в эти чашки, с соблюдением
условий стерильности, заливают остуженный питательный агар в
количестве 10,0 - 12,0 мл. Воду быстро смешивают с агаром, осторожно
наклоняя или вращая чашку. Необходимо полностью заливать дно чашки,
избегая попадания среды на края и образования пузырьков воздуха. Чашки
оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. Чашки с
посевом помещают в термостат вверх дном. Посевы выращивают при
температуре 27 град.С в течение 5 суток.
Подсчет колоний, выросших на поверхности и в глубине агара,
производят при помощи лупы. Если в чашке с наиболее высоким
разведением выросло свыше 300 колоний и анализ нельзя повторить, то
допускается подсчет колоний при помощи счетной пластинки с лупой при
сильном боковом освещении. Подсчитывают не менее 20 квадратов площадью
в 1 кв. см в разных местах чашки, выводят среднее арифметическое число
колоний на 1 кв. см, величину которого умножают на площадь чашки по
формуле:
2
S = пи R ,
где R - радиус чашки (см).
Результат подсчета колоний на каждой чашке выражают в количестве
бактерий в 1,0 мл с учетом произведенных разведений. За окончательное
количество бактерий в 1,0 мл исследуемой воды или разведений принимают
среднее арифметическое из результатов подсчета на двух параллельных
чашках.
Учет количества колоний можно вести, ориентируясь на одну чашку,
в случаях, если на другой: а) при посеве из разведения выросло менее
20 колоний; б) ползучий рост бактерий, распространившийся на всю
поверхность чашки или значительные зоны, маскирует рост других
колоний; в) количество колоний превышает 300.
3.1.3. Метод предельных разведений
Метод включает приготовление разведений, посев в жидкую
питательную среду МПБ, регистрацию наличия или отсутствия роста после
инкубации и расчет наиболее вероятного числа клеток в единице объема
исследуемой воды по таблице Мак-Креди (см. Приложение 1).
Чашечный метод определения количества микробных клеток
обеспечивает большую точность по сравнению с методом предельных
разведений, однако, при посеве на МПА в чашки иногда происходит
зарастание агара микрофлорой, обладающей ползучим ростом. В этом
случае метод предельных разведений является более приемлемым.
Приготовление разведений производится точно так же, как и для
чашечного метода. Посев в мясопептонный бульон производится при
соблюдении условий стерильности в количестве 1,0 мл каждого разведения
параллельно в 3 - 5 пробирок, содержащих по 5,0 мл МПБ. Результаты
учитывают через 5 суток. После инкубации при температуре 27 град.С
регистрируют наличие или отсутствие роста микроорганизмов визуально
(помутнение среды, образование пленки, осадка). Наиболее вероятное
количество микробных клеток в единице объема определяют с помощью
таблицы, разработанной на основании методов вариационной статистики
Мак-Креди (см. Приложение 1).
3.2. Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП)
Обнаружение в воде кишечных палочек следует рассматривать как
показатель поступления в пруды животноводческих или городских сточных
вод, а их количество позволяет судить о степени этого загрязнения.
Наличие и количественный учет кишечных палочек определяют бродильным
методом. Сущность метода заключается в посеве определенных объемов
анализируемой воды в среды накопления и подращивания при температуре
37 +/- 0,5 град.С с последующими пересевом на плотную питательную
среду Эндо и дифференциацией выросших бактерий. Пробы воды и их
разведения высевают по 1,0 или 0,5 мл (в зависимости от количества
среды в соотношении 1:10) в глюкозопептонную среду (ГПС) или среду
ВНИИВС. Посевы инкубируют при температуре 43 +/- 5 град.С в течение 24
ч. Отсутствие помутнения, образование кислоты и газа в ГПС или
помутнение и изменение цвета среды ВНИИВС из сиреневого в салатный
дают основание предположить наличие бактерий группы кишечной палочки.
В этих случаях производят пересев на среду Эндо. Посевной материал
следует брать с таким расчетом, чтобы выросли изолированные колонии.
Для этого производят пересев бактериологической петлей штрихами по
поверхности среды. Чашки с посевами помещают в термостат и инкубируют
при температуре 37 +/- 0,5град. С в течение 24 - 48 ч.
При росте на среде Эндо темно-красных колоний с металлическим
блеском их принадлежность к БГКП подтверждают микроскопированием
мазков, окрашенных по Граму, и постановкой оксидазного теста. Наличие
мелких неспорообразующих грамотрицательных палочек в мазках и
отрицательный оксидазный тест позволяют дать заключение о содержании
кишечной палочки в анализируемой пробе воды.
Для постановки оксидазного теста берут петлей 2 - 3 изолированные
колонии, выросшие на среде Эндо, и наносят штрихом на фильтровальную
бумагу, смоченную соответствующим реактивом (см. Приложение 3, п. 6).
При отрицательной реакции на оксидазный тест фильтровальная бумага не
изменяет цвета в течение 1 - 2 мин. после нанесения бактериальной
массы. При активной реакции на оксидазу фильтровальная бумага синеет в
течение 1 - 2 мин.
Определение титра БГКП (колититра) проводят установлением
наименьшего количества воды, в котором находится одна кишечная
палочка.
3.3. Индикация и количественный учет условно-патогенной для рыб
микрофлоры
3.3.1. Индикация и количественный учет аэромонад
Наличие А. hydrophila определяют следующим образом. Пробы воды и
их разведения высевают по 0,2 мл на среду Эндо с молоком. Посевы
инкубируют в термостате при температуре 28 +/- 0,5 град. С в течение
24 - 48 ч. Рост матовых, слегка выпуклых колоний с зоной просветления
позволяет предположить наличие аэромонад. Для подтверждения производят
микроскопирование мазков, окрашенных по Граму, и проверяют на
оксидазную активность. Наличие мелких неспорообразующих
грамотрицательных палочек в мазках и положительный оксидазный тест
позволяют дать заключение о содержании в исследуемой воде аэромонад.
Двухэтапный метод. Пробы воды и их разведения высевают по 0,5 мл
в жидкую среду накопления, в состав которой входят: сульфат магния,
К НРО , желатин, крахмал (среда А-1). Через 24 ч инкубирования посевов
2 4
в термостате при температуре 30 град.С производят пересев на плотную
дифференциально-элективную среду, в состав которой кроме перечисленных
компонентов (среда А-1) входят: водный раствор кристаллического
фиолетового и трифенилтетрахлорид (среда А-2). Посевы на плотной
элективной среде инкубируют в термостате при температуре 28 - 30
град.С в течение 42 - 48 ч. Характеристика колоний аэромонад на
плотной дифференциально-элективной среде (среда А-2): крупные с
вишневым центром и узким бесцветным ободком.
центром и узким бесцветным ободком.
3.3.2. Индикация и количественный учет псевдомонад
Наличие Р. fluorescens определяют трехэтапным методом:
1. Накопление в жидкой среде обогащения.
2. Выделение на плотной селективно-дифференциальной среде.
3. Идентификация с использованием ограниченного набора наиболее
необходимых тестов.
Первый этап: из разведений проб воды производят посев в среду
обогащения - жидкую среду с трифенилтетразолхлоридом (ТТХ) (состав
среды см. в Приложении 3). 8%-ный водный раствор ТТХ в
дистиллированной воде прибавляют к среде в соотношении 1:10. Посевы
инкубируют при температуре 42 град.С в течение 24 - 42 ч.
Второй этап: из среды обогащения производят пересев на плотную
селективно-дифференциальную среду "блеск", разлитую в чашки Петри. Для
получения изолированных колоний целесообразнее производить высев
бактериологической петлей. Засеянные чашки помещают в термостат при
температуре 28 - 37 град.С на 24 - 42 ч. Колонии Р. fluorescens либо
сплошь покрыты золотистым налетом, либо имеют многочисленные
вкрапления, обрамленные светло-красным ободком или бесцветным
венчиком. Характерным признаком является появление золотистого или
металлического блеска. Наиболее типичные колонии на среде "блеск"
подвергают идентификации путем высевов: на среду Кинга-А; специальную
среду для определения оксидации мальтозы с бромтимоловым синим; среду
для определения теста Хью-Лейфсона (оксидация и ферментация) с
феноловым красным, среду для определения нитрат-нитритредуктазы и на
реакцию цитохромоксидазы по Гэби и Хедли.
|
Фрагмент документа "МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ВОДОЕМОВ".