Фрагмент документа "3.1.1. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. КИШЕЧНЫЕ ИНФЕКЦИИ. ЭНТЕРОВИРУСНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ: КЛИНИКА, ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, ПРОФИЛАКТИКА МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".
3.3. Методы лабораторной вирусологической диагностики
энтеровирусных инфекций
3.3.1. Безопасность работы в лаборатории, выполняющей
диагностические исследования энтеровирусных инфекций
Согласно российским официальным нормативным документам,
неполиомиелитные энтеровирусы отнесены к IV группе патогенности
("Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования
микроорганизмов I - IV групп патогенности". СП 1.2.036-95). Правила
устройства микробиологических лабораторий, получения разрешений на
работу с микроорганизмами и безопасности работы регламентируются СП
1.2.006-93 и СП 1.2.731-99.
Выполнение диагностических исследований энтеровирусных инфекций
допускается в лабораториях, организациях, структурных подразделениях,
имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение и лицензию на
выполнение работ с микроорганизмами III - IV групп патогенности.
Организация работы в лаборатории выполняется в соответствии с СП
1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп
патогенности и гельминтами".
Клинические материалы, которые используются для диагностических
исследований энтеровирусных инфекций, могут быть инфицированы диким
полиовирусом, поэтому при работе с ними необходимо соблюдать правила,
изложенные в следующих нормативных документах:
- СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и
транспортирования материалов, инфицированных или потенциально
инфицированных диким полиовирусом";
- СП 1.3.1325-03 "Безопасность работы с материалами,
инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом".
Основные рекомендации по работе лабораторий, выполняющих
диагностические исследования энтеровирусных инфекций, содержатся в
"Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита" (4-е издание.
ВОЗ, Женева, 2005) и в "Рекомендациях по эпидемиологическому надзору
за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита"
(ВОЗ, Женева, 2005).
Среди лиц, работающих с энтеровирусами, точно документированные
случаи лабораторных заражений являются редкими. Это - или следствие
несчастного случая, или несоблюдение соответствующих
предосторожностей. Известен случай заноса дикого вируса полиомиелита в
семью работником производства полиовирусной вакцины. Хорошее владение
техникой работы и употребление различных защитных приспособлений
значительно снижают этот риск. Наиболее частой причиной лабораторных
заражений является вдыхание аэрозолей вируссодержащих материалов,
образующихся при работе с пипетками, шприцами, при центрифугировании,
а также контакт с зараженными животными.
Работников, осуществляющих работу с инфекционными материалами,
нужно инструктировать о необходимости обращения к врачу в случае
заболевания лихорадочного типа. Следует периодически брать пробы крови
у персонала и хранить сыворотки в замороженном виде для серологических
исследований в случае заболевания. Для каждой лаборатории в
соответствии с конкретными условиями работы следует разработать
руководство по технике безопасности. Основное внимание следует уделять
необходимости сознательного и ответственного отношения к работе со
стороны персонала, а также тщательному обучению правилам безопасности
новых сотрудников, поскольку само по себе существование правил
безопасности и защитных приспособлений еще не обеспечивает
предупреждения лабораторных заражений.
Санитарными правилами СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с
микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами"
определяются требования к организации работы, включая требования к
помещениям и оборудованию лабораторий, проведению работ в лаборатории,
средствам индивидуальной защиты, содержанию животных, обеззараживанию
материала и уборке помещений, мероприятиям по ликвидации аварий и
организации контроля за выполнением требований биологической
безопасности. В этих санитарных правилах предписаны режимы
обеззараживания различных зараженных материалов (поверхностей рабочих
столов, стен и полов помещений, защитной одежды, лабораторной посуды и
вируссодержащих материалов, инструментов). В этих правилах
предписываются также режимы дезинфекции предметов, которые могут быть
контаминированы выделениями больных людей (одежда, обувь, белье,
посуда, жидкие отходы, посуда из-под выделений, санитарно-техническое
оборудование, уборочный материал, мусор, транспорт). Рекомендуются
также средства и методы дезинфекции, используемые при работе с
микроорганизмами III и IV групп патогенности и бактериологический
метод контроля эффективности работы парового стерилизатора.
3.3.2. Правила забора и транспортирования материалов от больных
для проведения вирусологических исследований
Для подтверждения вирусной этиологии заболевания необходимо
проведение лабораторного исследования, эффективность которого зависит
от правильного сбора соответствующих материалов (тканей, фекалий,
носоглоточных смывов, крови, везикулярной жидкости, спинно-мозговой
жидкости) и транспортирования их в лабораторию. Все пробы для
выделения вируса необходимо брать с соблюдением соответствующих
предосторожностей для исключения контаминации одной пробы материалом
другой пробы этого же больного или материалом пробы другого
обследуемого. Для успешного лабораторного исследования необходимо
производить как можно более ранний отбор проб.
Забор материалов осуществляется медицинскими работниками
лечебно-профилактического учреждения, куда госпитализирован больной.
Для отбора проб используют стерильную стеклянную или пластиковую
посуду.
Две пробы фекалий для выделения вируса отбирают в течение 7 дней
после начала болезни, но не позднее 14 дней, с интервалом 24 - 48 ч.
Носоглоточные/глоточные смывы отбирают в первые 3 - 4 дня от
начала заболевания. Для получения носоглоточного/глоточного смыва
можно использовать стерильную дистиллированную воду, бульон или
солевой раствор. Отбор материала с помощью глоточного тампона
производят в те же сроки. Тампоном протирают заднюю стенку глотки,
миндалин и небных дужек. Тампоны помещают в пробирку с 1 - 2 мл
раствора Хэнкса; пробу исследуют сразу или хранят в замороженном виде.
Спинно-мозговую жидкость берут в первые дни болезни в
асептических условиях стерильным шприцем только по клиническим
показаниям.
Пробы крови для серологической диагностики следует брать утром
натощак. На всех этапах взятия и обработки крови принимают меры для
предотвращения гемолиза. Первую пробу крови (5 мл) берут как можно
раньше после начала болезни, вторую - на 3 - 4-й неделе, в стадии
реконвалесценции. Параллельно кровь исследуют на выделение вируса -
возбудителя болезни.
В случае летального исхода для исследования проводят забор
секционного материала (ткани головного, спинного и продолговатого
мозга и варолиева моста, содержимое кишечника и ткань кишечной
стенки). При необходимости исследованию подвергают и другие материалы
- ткань сердечной мышцы, печени, легких, селезенки, почек,
лимфатических узлов, глаза и т.д. Пробу нужно брать как можно раньше
после смерти. Ткани берут в заранее намеченном порядке, чтобы избежать
их контаминации содержимым желудка и кишечника. Для иссечения тканей
пользуются стерильными инструментами (отдельный набор для каждой
пробы). Объем каждой пробы (кусочка) из тканей центральной нервной
системы должен составлять примерно 1 куб, см; из толстой кишки
иссекается сегмент длиной 3 - 5 см, содержащий фекальные массы.
Собранные пробы немедленно отправляют в лабораторию. Все пробы,
кроме фекалий, спинно-мозговой жидкости и крови, сразу же после взятия
помещают в транспортировочную среду. Если отправка проб задерживается,
их помещают в холодильник при температуре 4 - 8 град.C. Если время до
отправки превышает 24 ч, пробы замораживают при температуре -20 град.
или ниже. Следует сохранять их замороженными до получения
лабораторией. Сыворотки без добавления консервантов хранят в
замороженном виде. Повторное замораживание и оттаивание сывороток
(больше 4 раз) может оказывать неблагоприятное влияние на титр
антител.
Пробы помещают в пластиковые мешки так, чтобы избежать протечек и
повреждений. Все материалы должны сопровождаться соответствующими
документами - направлением на исследование с указанием наименования
учреждения, адреса, телефона, адреса электронной почты, факса и
сопроводительными документами, содержащими основные сведения о
больном.
Транспортирование проб осуществляют с соблюдением условий
"холодовой цепи" в термоконтейнерах или термосах, обеспечивающих эти
условия. При транспортировании проб руководствуются санитарными
правилами "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования
микроорганизмов I - IV групп патогенности. СП 1.2.036-95".
При отборе, хранении и транспортировании проб руководствуются
основными методическими документами:
- "Рекомендации по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами
для поддержки программы ликвидации полиомиелита" (ВОЗ, Женева, 2005);
- "Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита" (4-е
издание. ВОЗ, Женева, 2005).
3.3.3. Выделение энтеровирусов
Основными методами лабораторного подтверждения энтеровирусной
инфекции являются выделение вируса (в культуре клеток или на животных)
и обнаружение РНК энтеровирусов с помощью ПЦР. Выделение вируса хотя и
требует большего времени, дает наиболее однозначный ответ на вопрос об
этиологии заболевания и позволяет использовать выделенный вирус для
последующих эпидемиологических исследований. ПЦР обладает большей
чувствительностью, большей быстротой и позволяет выявлять вирусы, не
размножающиеся в культуре клеток. ПЦР используют при исследовании
спинно-мозговой жидкости и материалов из верхних дыхательных путей.
3.3.3.1. Культуры клеток
Универсальной культуры клеток (или культуральной системы),
пригодной для выделения всех энтеровирусов, не существует. Некоторые
штаммы энтеровирусов не обладают цитопатогенностью ни для одной из
известных культур клеток и могут быть выделены только с использованием
чувствительных лабораторных животных, что достаточно сложно в условиях
практической лаборатории. Обобщенные сведения о чувствительности
наиболее распространенных в лабораториях перевиваемых культур клеток к
различным энтеровирусам представлены в табл. 6.
Таблица 6
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК
К РАЗЛИЧНЫМ ЭНТЕРОВИРУСАМ
------------------------------------------------------------------
| Вирусы | Проявление цитопатического эффекта |
| | на культуре клеток |
| |-------------------------------------------|
| | RD | HEp-2 | L20B | BGM |
|--------------------|----------------|-------|------------|-----|
|Полиомиелита 1 - 3 |+ | + |+ | + |
|--------------------|----------------|-------|------------|-----|
|ЕСНО |+ | - |- | +/- |
|--------------------|----------------|-------|------------|-----|
|Коксаки A |+/- | - |(Коксаки A | - |
| |за исключением | |2 - 6, 8, | |
| |неразмножающихся| |10, 14) | |
| |A1, A19, A22 | | | |
|--------------------|----------------|-------|------------|-----|
|Коксаки B |- | + |- | + |
|--------------------|----------------|-------|------------|-----|
|Энтеровирусы 68 - 71|+/- | - |- | - |
------------------------------------------------------------------
Для увеличения вероятности выделения энтеровируса из исследуемого
материала целесообразно использовать не менее двух видов культур
клеток, одной из которых должна быть культура клеток RD.
Эффективность исследования материала зависит от состояния
клеточных культур: клетки должны сохранять высокую чувствительность к
энтеровирусам, аутентичность, стабильность и быть свободными от
загрязнения микроорганизмами (простейшими, бактериями, грибами,
дрожжами, микоплазмами, вирусами).
Культуры клеток должны быть получены из аттестованного
официального источника. Подробные рекомендации по работе с культурами
клеток изложены в "Руководстве по лабораторным исследованиям
полиомиелита" (4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005).
3.3.3.2. Подготовка проб для исследования в культуре клеток
Пробы фекалий. Готовят 10 - 20%-ю суспензию фекалий в
сбалансированном солевом растворе (ФСБ) с антибиотиками. Пробы
обрабатывают хлороформом, к действию которого устойчивы энтеровирусы.
Такая обработка позволяет избавиться от бактериального и грибкового
загрязнения пробы, удаляет потенциально токсичные липиды, способствует
диссоциации вирусных агрегатов.
В маркированную центрифужную пробирку последовательно добавляют
10 мл ФСБ с антибиотиками, 1 г стеклянных бус и 1 мл хлороформа.
Вносят примерно 2 г фекальной пробы, плотно закрывают пробирку и
интенсивно встряхивают в течение 20 мин. Центрифугируют с охлаждением
в течение 20 мин. при 1500 g. Надосадочную жидкость отбирают для
исследования. (Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита.
4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005.)
Тампоны. Тампоны встряхивают в транспортировочной среде для
высвобождения клеточного материала, избегая образования аэрозолей.
Полученную суспензию обрабатывают хлороформом, как описано выше.
Спинно-мозговая жидкость. Пробы спинно-мозговой жидкости
используют для исследования без дополнительной обработки. Если проба
мутная, ее осветляют центрифугированием при 1600 - 2000 g в течение 10
мин.
Тканевые пробы. Готовят 10 - 20%-ю тканевую суспензию. Для этого
ткани растирают в стерильной ступке, добавляя при необходимости
стерильный песок и небольшое количество транспортировочной среды.
Суспензию осветляют центрифугированием при 1600 - 2000 g в течение 10
мин.
3.3.3.3. Выделение и идентификация вирусов на культуре клеток
При выделении энтеровирусов с помощью чувствительных культур
клеток следует руководствоваться принципами, изложенными в
"Рекомендациях по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для
поддержки программы ликвидации полиомиелита" (ВОЗ, Женева, 2005),
"Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита" (4-е издание.
ВОЗ, Женева, 2005), МУ 4.2.2029-05 "Санитарно-вирусологический
контроль водных объектов" (Москва, 2006).
Энтеровирусы обычно идентифицируют в реакциях нейтрализации
инфекционности, связывания комплемента, преципитации,
иммунофлюоресценции или подавления гемагглютинации. Проведение всех
этих реакций возможно лишь при наличии диагностических
типоспецифических иммунных сывороток высокого титра. Наиболее
чувствительным, специфичным и распространенным способом идентификации
является реакция нейтрализации инфекционности.
В основе реакции нейтрализации инфекционности лежит
взаимодействие исследуемого вируса с гомологичной сывороткой (или
смесью антисывороток), которая нейтрализует вирус, что проявляется в
виде отсутствия ЦПЭ на культуре клеток. В опыте по нейтрализации
вирусную суспензию, содержащую 100 ТЦД , смешивают в равном объеме с
50
диагностическими сыворотками. После инкубации в течение 1 - 2 ч при 37
град.C смесь вводят в культуры клеток. Иммунная сыворотка, которая
предотвращает развитие ЦПЭ, указывает на тип вируса.
При постановке реакции нейтрализации для идентификации
выделенного агента руководствуются вышеуказанными методическими
документами.
3.3.4. Серологические методы диагностики энтеровирусных инфекций
В сыворотке пациента можно обнаружить специфические антитела
(нейтрализующие, комплементсвязывающие, преципитирующие, подавляющие
гемагглютинацию). Диагностика отдельных случаев заболевания только
серологическими методами требует большого количества исследований со
всеми известными серотипами энтеровирусов, поэтому ее предпринимают
только при наличии данных, позволяющих предполагать тип
этиологического агента (характерной клинической картины болезни,
выделения и идентификации энтеровируса от больного, наличия вспышки
заболеваний, вызванных установленным типом вируса).
Определение антител проводят с диагностической целью или при
изучении эпидемиологических аспектов инфекции.
Для диагностических целей необходимы, по крайней мере, две пробы
сыворотки, первую из которых берут как можно раньше после начала
болезни, а вторую - через 2 - 3 недели после первой. Диагноз инфекции
подтверждается значительным подъемом титра специфических антител во
второй пробе. Диагностически значимым считают 4-кратный и больший
подъем титра антител.
Для эпидемиологических исследований достаточно одной пробы
сыворотки от каждого обследуемого; внимание следует обращать на
правильный отбор обследуемых лиц и компоновку групп, чтобы получить
наиболее представительные результаты.
В настоящее время для серологической диагностики используют
преимущественно реакцию нейтрализации инфекционности. Другие методы
выявления антител (реакцию связывания комплемента, преципитацию в
агаре, подавление гемагглютинации) используют редко. В основе
определения титров антител с помощью реакции нейтрализации лежит
принцип взаимодействия известного вируса с гомологичными антителами,
присутствующими в сыворотке, что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на
культуре клеток.
Разведения сыворотки (двукратные или пятикратные до,
приблизительно, 1:2500) смешивают с равными объемами разведения
вируса, содержащего 100 ТЦД , в том объеме смеси, который будет введен
50
в культуру при заражении. Смесь выдерживают 2 ч при 37 град.C и вносят
в 2 - 3 пробирки или лунки с культурой клеток. Контроль должны
включать: а) наименьшее (1:4) разведение сыворотки для проверки
токсичности; б) контроль качества клеток со средой; в) титрование
рабочей дозы вируса. Титром сыворотки считают наибольшее разведение,
защищающее 50% зараженных культур от действия 100 ТЦД вируса.
50
3.3.5. Молекулярно-биологические методы диагностики
энтеровирусных инфекций
Основные сведения об использовании молекулярно-биологических
методов для индикации и идентификации энтеровирусов изложены в
Методических указаниях 4.2.2029-05 "Санитарно-вирусологический
контроль водных объектов".
Разработанные в последние годы молекулярно-биологические методы
индикации и типирования энтеровирусов позволяют выявить наличие
энтеровирусных геномных последовательностей в исследуемом материале
уже через несколько часов после начала работы и установить их типовую
принадлежность в большинстве случаев уже через 2 - 3 дня.
Обязательным условием для получения достоверных результатов при
проведении молекулярно-биологической диагностики является наличие
квалифицированного персонала.
Набор помещений и оборудования (ОТ-ПЦР, электрофорез),
организация работы должны исключать возможность случайной контаминации
исследуемых проб.
Главное преимущество молекулярно-биологических методов - быстрота
и достоверность выявления и типирования возбудителей. Это создает
возможность раннего этиологического диагноза и экономию на средствах
лечения и длительности пребывания в стационаре (например, при снятии
диагноза бактериального менингита или сепсиса). При быстрой постановке
этиологического диагноза возможно проведение быстрой специфической
профилактики (например, введение гамма-глобулина при вспышках
энтеровирусного менингита или увеита).
Главным недостатком традиционных методов выделения и типирования
энтеровирусов является их длительность.
Быстрота и специфичность определения принадлежности возбудителя
могут иметь исключительно важное значение при изучении вспышек
заболеваний ("молекулярная эпидемиология"). Создается надежная основа
для быстрого и точного установления источников инфекции, времени и
путей распространения возбудителя, влияния бытовых условий, соблюдения
режимов санитарии в больницах, эффективности проведения
профилактических мероприятий.
Наиболее часто ОТ-ПЦР используют для диагноза энтеровирусной
инфекции путем прямого выявления последовательностей геномной РНК
вируса в клинических пробах. Имеется множество модификаций методики,
но все методы, способные установить родовые последовательности
энтеровирусов, имеют несколько общих узловых характеристик. Наиболее
важной из них является использование праймеров для 5` нетранслируемой
области вирусного генома. Опубликованы последовательности многих
праймеров, специфичных для различных последовательностей этого региона
у разных групп энтеровирусов. Однако значительная часть праймеров не
проверена на достаточно большом числе штаммов, выделенных из
клинических материалов, чтобы проконтролировать их реактивность со
всеми серотипами и штаммами и поэтому не оценена достаточно хорошо для
использования в диагностике. Главным преимуществом панэнтеровирусной
ОТ-ПЦР является быстрое выявление энтеровируса даже с малым
количеством исследуемого материала (как, например, СМЖ) и вирусов,
которые не размножаются в культурах клеток. Главным недостатком
ОТ-ПЦР-диагностики является вариабельность результатов, зависящая
главным образом от природы исследуемой пробы. Хотя в некоторых случаях
ОТ-ПЦР способна уловить единичные копии вирусной РНК, иногда ее
чувствительность оказывается намного ниже, например, при исследовании
проб кала (но все же не ниже чувствительности культур клеток).
Молекулярное типирование энтеровирусов основано на ОТ-ПЦР и
определении нуклеотидной последовательности в области генома,
кодирующей белок капсида VP1. Серотип исследуемого изолята определяют
сравнением полученных последовательностей с имеющимися в генном банке
последовательностями прототипных энтеровирусов человека. Этот метод
несоизмеримо ускоряет типирование и может быть использован для
идентификации изолятов, которые трудно или невозможно типировать,
используя обычные иммунологические и вирусологические методы. Метод
особенно полезен для оценки родства штаммов во время вспышек.
|
Фрагмент документа "3.1.1. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. КИШЕЧНЫЕ ИНФЕКЦИИ. ЭНТЕРОВИРУСНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ: КЛИНИКА, ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, ПРОФИЛАКТИКА МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".