3.3.1. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА. ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИННЫМ ШТАММАМ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Не задано. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 12.02.07 МУ 3.3.1.2161-07

5.8. Определение количества В-лимфоцитов
                     иммунофлюоресцентным методом

     Принцип метода   основан   на   том,   что   В-лимфоциты    несут
поверхностные    иммуноглобулины,   которые   выявляются   в   реакции
иммунофлюоресценции с помощью антииммуноглобулиновых антител, меченных
флюорохромом.
     В пробирки,  помещенные на ледяную баню,  вносят 0,1  -  0,25  мл
                                6
суспензии  лимфоцитов  (5  х  10  лимф./мл) в растворе Хенкса с 1 - 5%
раствором бычьего  сывороточного  альбумина.  Затем  добавляют  равный
объем  иммуноглобулинов  диагностических  флуоресцирующих  антивидовых
против иммуноглобулинов морской свинки в рабочем  разведении  (раствор
антител  готовят в забуференном 0,9%  растворе натрия хлорида).  Смесь
инкубируют и помешивают в течение 30 мин.  при (4 +/-  0,5)  град.С  в
присутствии 0,25% раствора азида натрия, после чего суспензию клеток 3
раза отмывают,  добавляя к осадку раствор Хенкса и  центрифугируя  (10
+/- 1) мин.  при (450 +/- 20) g. Последнее (третье) отмывание проводят
охлажденным до 4 град.С забуференным 0,9%  раствором  натрия  хлорида,
так  как  раствор Хенкса и среда 199 обладают оптической активностью и
могут искажать результаты микроскопии. Осадок ресуспендируют в 0,05 мл
забуференного  0,9%  раствора  натрия  хлорида  и наносят на тщательно
вымытое  и  обезжиренное  предметное  стекло  (из   нефлуоресцирующего
стекла)   с   проведенными   парафиновым   стеклографом  окружностями,
ограничивающими исследуемый  материал.  Накрывают  покровным  стеклом,
окантовывают  вазелином  и  микроскопируют  с  помощью люминесцентного
микроскопа,  используя светофильтры,  рекомендованные инструкцией  для
ФИТЦ,  и  масляную  иммерсионную  систему.  При  микроскопии учитывают
клетки,  имеющие  кольцевое  или  точечное   (гранулярное)   свечение.
Диффузно  окрашенные  клетки  не  учитываются.  Параллельно  с помощью
фазово-контрастного устройства проводят подсчет  количества  клеток  в
каждом  поле зрения.  Относительное процентное содержание В-лимфоцитов
определяют после подсчета 200 - 300 клеток в препарате по формуле:

                           Х = В х 100 / А,

     где:
     А - общее количество клеток;
     В - количество клеток со специфическим свечением.
     Для подсчета  абсолютного  содержания   В-лимфоцитов   используют
следующую формулу:

                        Д = А х Б х В / 10000,

     где:
     Д - абсолютное содержание В-лимфоцитов в 1 л крови;
     А - количество лейкоцитов в 1 л крови;
     Б - процентное содержание лимфоцитов в пуле лейкоцитов крови;
     В - процент В-лимфоцитов в пуле лимфоцитов крови.
     Результаты исследований отражают в таблице:

------------------------------------------------------------------
|     Сутки    | Абсолютное содержание |Относительное содержание |
| исследования |                       |           (%)           |
|              |-----------------------|-------------------------|
|              |В-лимфоциты|   р с К   |В-лимфоциты |   р с К    |
|--------------|-----------|-----------|------------|------------|
|Контроль (К)  |           |           |            |            |
|--------------|-----------|-----------|------------|------------|
|1             |           |           |            |            |
|--------------|-----------|-----------|------------|------------|
|3             |           |           |            |            |
|--------------|-----------|-----------|------------|------------|
|7             |           |           |            |            |
|--------------|-----------|-----------|------------|------------|
|14            |           |           |            |            |
|--------------|-----------|-----------|------------|------------|
|28            |           |           |            |            |
------------------------------------------------------------------