3.3.1. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА. ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИННЫМ ШТАММАМ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Не задано. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 12.02.07 МУ 3.3.1.2161-07

5.12. Определение поликлональной активности В-лимфоцитов

     Для получения   этого   показателя   определяют   число   клеток,
продуцирующих   антитела   к   эритроцитам  барана  (АОК).  Необходимо
подчеркнуть, что иммунизация морских свинок эритроцитами барана в этих
опытах не проводится, а определяют количество спонтанных "фоновых" АОК
в селезенке.  Увеличение их количества после введения вакцины является
показателем   поликлональной   активации  В-лимфоцитов.  Число  АОК  в
селезенке определяют методом локального гемолиза в геле.
     Выявление антителообразующих клеток методом локального гемолиза в
геле производят следующим образом.
     Эритроциты барана  (ЭБ)  трижды  отмывают 0,9%-м раствором натрия
хлорида рН 7,2,  осаждая центрифугированием  при  (400  +/-  20)  g  в
течение 7 мин.,  добавляют к 0,9%-му раствору агарозы <*> из расчета 2
        7
- 3 х 10 эритроцитов в 1 мл. Полученную рабочую смесь разливают по 2,5
мл  в  пробирки,  помещенные  в  водяную  баню при температуре 43 - 44
град.С. В  каждую  пробирку  добавляют  по  0,2  мл взвеси исследуемых
                                 7
клеток селезенки (концентрация 10  кл./мл), перемешивают и выливают на
чашку  Петри,  равномерно  распределяя  по  дну.  Через  5 мин.  чашки
помещают в термостат при температуре (37 +/- 0,5) град.С на 1 ч. Затем
в каждую чашку вносят путем наслаивания по 2,5 мл разведенного в 5 раз
средой 199 комплемента морской свинки,  сухого или разведенного  в  10
раз  свежезамороженного  комплемента.  После  30  мин.  инкубации  при
температуре (37 +/- 0,5) град.С подсчитывают  число  зон  гемолиза  на
                                               6
каждой чашке.  Рассчитывают число АОК на 1 х 10  ядросодержащих клеток
селезенки.  Рассчитывают  индекс  поликлональной  стимуляции  (ИПС) по
формуле:
                             6
          число АОК на 1 х 10  ядросодержащих клеток в опыте
    ИПС = --------------------------------------------------.
                         6
          число АОК на 10  ядросодержащих клеток в контроле

--------------------------------
     <*> Приготовление 0,9%-го раствора агарозы: навеску сухой агарозы
(см.  табл.) смешивают с  дистиллированной  водой,  смесь  кипятят  на
водяной  бане  до  полного  растворения  агарозы;  емкость с раствором
переносят в водяную баню с температурой  43  -  44  град.С,  добавляют
10-кратный  раствор Хенкса,  рН раствора доводят до 7,2 1%-м раствором
KH PO или NaOH (по цвету индикатора, присутствующего в растворе Хенкса
  2  4
и имеющего при значениях рН 6,8 - 7,0 желтовато-оранжевый цвет,  7,2 -
7,4 - розовато-красный цвет,  при значениях рН выше  7,4  -  малиновый
цвет).

------------------------------------------------------------------
|Количество| Масса |      Объем       |Объем концентрата раствора|
|  чашек   |агарозы| дистиллированной |   Хенкса (10-кратный)    |
|          |       |       воды       |                          |
|----------|-------|------------------|--------------------------|
|10        |225 мг |22,5 мл           |2,5 мл                    |
------------------------------------------------------------------

     Результаты  исследований  для  морских  свинок,  иммунизированных
             3         4
дозами 5 х 10  и 5 х 10  м.к., отражают в таблице:

------------------------------------------------------------------
|            |                6 |         |                      |
|   Сутки    | Число АОК на 10  |  Р с К  | Индекс поликлональной|
|            |                  |         |      стимуляции      |
|------------|------------------|---------|----------------------|
|Контроль (К)|                  |         |                      |
|------------|------------------|---------|----------------------|
|3           |                  |         |                      |
|------------|------------------|---------|----------------------|
|7           |                  |         |                      |
|------------|------------------|---------|----------------------|
|14          |                  |         |                      |
|------------|------------------|---------|----------------------|
|28          |                  |         |                      |
------------------------------------------------------------------