Фрагмент документа "4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".
3.4. Количественное определение концентрации
антибиотиков и расчет активности
При определении концентрации антибиотика в пищевых продуктах
параллельно ставят контрольный ряд с известным содержанием антибиотика
в пробирках. Для этого навеску стандарта антибиотика (1 мг) растворяют
в 1 мл соответствующего буфера, получая, таким образом, основной
раствор стандарта 1000 мкг/мл. Затем основной раствор десятикратно
разводят до получения 100 мкг/мл и 10 мкг/мл. Далее концентрации, с
которых начинается титрование стандарта в контрольном ряду (2,0; 1,0;
0,5 мкг/мл и т.д.), разводят соответствующими буферными растворами.
Титрование стандарта антибиотика и испытуемых образцов проводят
путем двукратных разведений в объеме 0,5 мл мясопептонного бульона.
Последняя пробирка в контрольном ряду не содержит антибиотик и служит
контролем дегидрогеназной активности клеток тест-культуры.
После этого во все пробирки вносят 0,5 мл взвеси, содержащей
двойную "рабочую дозу" тест-культуры, т.е. предпоследнее разведение
тест-культуры, вызывающее обесцвечивание метиленового синего через 1
ч. В результате микробная нагрузка в пробирках уменьшается вдвое и
соответствует "рабочей дозе" тест-культуры.
Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре (37
+/- 1) град.С на 3-часовую экспозицию тест-культуры с антибиотиком.
Затем в каждую пробирку добавляют по 2 мл 1%-ного мясопептонного агара
с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок вновь смешивают и
инкубируют при температуре (37 +/- 1) град.С в термостате.
Если в исследуемом объекте содержится антибиотик, то он блокирует
дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культур и вызывает их
гибель. В этих пробирках метиленовый синий не обесцвечивается (синий).
О степени активности антибиотика судят по его минимальной
концентрации, которая вызывает полное подавление дегидрогеназ клеток
тест-культур через 1 или 2 ч инкубации в термостате при температуре
(37 +/- 1) град.С по сравнению с контролем.
3.4.1. Определение концентрации бензилпенициллина, стрептомицина
и тетрациклина.
Приготовление стандарта бензилпенициллина
Во флакон, содержащий 500000 ЕД натриевой соли бензилпенициллина
товарного препарата для инъекций, добавляют 10 мл 0,066 М фосфатного
буфера, рН 7,0. Концентрация исходного раствора пенициллина составляет
50000 ЕД/мл. Далее получают 5000 ЕД/мл, разводя этот раствор в 10 раз.
К 1 мл этого раствора прибавляют 4 мл 0,066 М фосфатного буфера, рН
7,0. Получают основной раствор пенициллина - 1000 ЕД/мл. Затем
разводят десятикратно 0,066 М фосфатным буфером, рН 7,0 до 100 и 10
ЕД/мл. После этого 0,5 мл последнего разведения, т.е. 5 ЕД/мл,
добавляют в 1-ю пробирку с заранее разлитым по 0,5 мл мясопептонным
бульоном. Получают разведение пенициллина в 1-й пробирке - 2,5 ЕД/мл.
Далее делают двукратные разведения антибиотика в 0,5 мл мясопептонного
бульона. Во все пробирки добавляют 0,5 мл взвеси, содержащей двойную
"рабочую дозу" тест-культуры. В результате микробная нагрузка во всех
пробирках уменьшается вдвое и соответствует "рабочей дозе"
тест-культуры, при этом концентрация пенициллина в 1-й пробирке
уменьшается еще в 2 раза и соответствует 1,25 ЕД/мл. Таким образом,
получают разведения пенициллина:
в 1-й пробирке 1,25 ЕД;
во 2-й пробирке 0,62 ЕД;
в 3-й пробирке 0,31 ЕД;
в 4-й пробирке 0,15 ЕД;
в 5-й пробирке 0,07 ЕД;
в 6-й пробирке 0,035 ЕД;
в 7-й пробирке 0,017 ЕД;
в 8-й пробирке 0,008 ЕД;
в 9-й пробирке 0,004 ЕД.
Последняя 10-я пробирка не содержит антибиотик и служит контролем
дегидрогеназной активности тест-культуры (табл. 2).
Таблица 2
КОНЦЕНТРАЦИЯ СТАНДАРТА БЕНЗИЛПЕНИЦИЛЛИНА
-----------------------------------------------------------------------------
| Время | Учет интенсивности клеточного дыхания |Контроль|
| обесцвечивания | Разведение антибиотика в ЕД/мл |тест- |
| метиленового | |культуры|
| синего, ч | | |
|----------------|-------------------------------------------------|--------|
| |1,25|0,62|0,31|0,15|0,07|0,035|0,015|0,007|0,0035| К |
|----------------|----|----|----|----|----|-----|-----|-----|------|--------|
| 1 |- |- |- |- |+/- |+ |+ |+ |+ |+ |
|----------------|----|----|----|----|----|-----|-----|-----|------|--------|
| 2 |- |- |- |- |- |+ |+ |+ |+ |+ |
-----------------------------------------------------------------------------
Обозначения: (+) - полное обесцвечивание метиленового синего,
(+/-) - частичное обесцвечивание метиленового синего, (-) - отсутствие
обесцвечивания.
Приготовление стандарта стрептомицина
Во флакон, содержащий 500000 ЕД стрептомицина сульфата товарного
препарата для инъекций, добавляют 10 мл 0,066 М, фосфатного буфера, рН
6,0 - 6,2. Концентрация исходного раствора стрептомицина составляет
50000 ЕД/мл. Далее исходный раствор разводят в 10 раз 0,066 М,
фосфатным буфером, рН 7,8 - 8,0. Получают раствор 5000 ЕД/мл.
Последующие разведения готовят на 0,066 М фосфатном буфере, рН
7,8 - 8,0, аналогично вышеописанной схеме к бензилпенициллину.
Приготовление стандарта тетрациклина
Для приготовления исходных растворов антибиотиков могут быть
использованы лекарственные препараты антибиотиков или стандарты
препаратов с известной активностью. В первичном растворе каждого
антибиотика учитывают его активность в 1 мг (при использовании
стандарта препарата) или содержание активного вещества в лекарственной
форме (например, 100000 ЕД во флаконе). Основную концентрацию 1000
ЕД/мл или 1000 мкг/мл готовят, разводя препарат во флаконе, содержащем
100000 ЕД тетрациклина, в 100 раз.
При активности стандарта тетрациклина 850 мкг/мл в 10 мг навески
содержится 8500 мкг антибиотика.
Для получения первого разведения основного раствора стандарта
антибиотика в 1000 мкг устанавливают необходимый объем растворителя:
850 х 10 = 8500:1000 = 8,5 мл. Таким образом, навеску тетрациклина 10
мг растворяют в 8,5 мл 0,01 Н HCl и получают концентрацию основного
раствора 1000 мкг/мл. Приготовленный основной раствор может храниться
в холодильнике в течение 7 дней.
Далее основной раствор 1000 мкг/мл разводят десятикратно
цитратно-соляно-кислым буфером, рН 6,0 - 6,2, до 100 и 10 мкг/мл. Все
последующие разведения готовят также на цитратно-соляно-кислом буфере,
рН 6,0 - 6,2, и проводят расчеты активности стандарта тетрациклина
аналогично схеме расчета по пенициллину и стрептомицину.
|
Фрагмент документа "4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".