Фрагмент документа "4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".
3.3. Определение "рабочей дозы" тест-культур
Поскольку количество жизнеспособных клеток тест-культуры от смыва
к смыву варьирует, предварительно необходимо определить "рабочую дозу"
тест-культуры, т.е. наибольшее разведение суспензии, вызывающее
обесцвечивание метиленового синего в определенное время в термостате
при температуре (37 +/- 1) ёС. Следует учитывать, что время
обесцвечивания метиленового синего обратно пропорционально количеству
клеток в смыве.
Для постановки реакции выбрано время обесцвечивания, равное 1 ч.
Это время, будучи величиной постоянной, выявляет в суспензиях
различной плотности одну и ту же клеточную нагрузку для каждой
тест-культуры в отдельности. "Рабочую дозу" тест-культур устанавливают
по дегидрогеназной активности клеток.
3.3.1. Методика определения "рабочей дозы" тест-культуры.
Полученную взвесь тест-культур титруют путем последовательных
двукратных разведений в объеме 1 мл питательного бульона. Пробирки с
тест-культурой встряхивают и помещают в термостат при температуре (37
+/- 1) град.С на 3 ч. Затем для создания условий, близких к
анаэробным, в каждую пробирку вносят по 2 мл растопленного и
охлажденного до температуры (45 +/- 1) ёС 1%-ного питательного агара с
метиленовым синим и глюкозой (оба ингредиента асептично вносят в
растопленный 1%-ный питательный агар из расчета: на 100 мл среды 0,4
мл 0,5%-ного водного раствора метиленового синего и 1 мл 40%-ного
раствора глюкозы). Пробирки встряхивают и вновь инкубируют в
термостате при температуре (37 +/- 1) ёС в течение 1 - 2 ч, после чего
учитывают результат (табл. 1). Дыхательные ферменты бактериальных
клеток тест-культур восстанавливают метиленовый синий в анаэробных
условиях, и содержимое пробирок, имеющее синий цвет, обесцвечивается.
Разведение тест-культуры в последней пробирке с обесцвеченным
метиленовым синим (+) принимают за "рабочую дозу". Функциональная
активность дегидрогеназ тест-культур стабилизируется через сутки после
получения смыва, который хранится в холодильнике в течение 1 недели.
Поэтому "рабочую дозу" первый раз определяют через сутки, а затем -
через 3 дня.
Таблица 1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ "РАБОЧЕЙ ДОЗЫ" ТЕСТ-КУЛЬТУР
-----------------------------------------------------------------------------
| Тест-культуры |Время,| Учет интенсивности клеточного дыхания |
| | ч |---------------------------------------------------|
| | | Разведения тест-культур |
|----------------|------|---------------------------------------------------|
| | |1:2|1:4|1:8|1:16|1:32|1:64|1:128|1:256|1:512|1:1024|
|----------------|------|---|---|---|----|----|----|-----|-----|-----|------|
|B.subt., |1 |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |- |
|вар. 6633 | | | | | | | | | | | |
|----------------|------|---|---|---|----|----|----|-----|-----|-----|------|
|B.subt, вap. L |1 |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |
| 2 | | | | | | | | | | | |
|----------------|------|---|---|---|----|----|----|-----|-----|-----|------|
|B.mycoides 537 |1 |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |- |- |
|----------------|------|---|---|---|----|----|----|-----|-----|-----|------|
|Micrococcus |1 |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |- |- |- |
|luteum ATCC 9341| | | | | | | | | | | |
-----------------------------------------------------------------------------
Обозначения: знак плюс (+) - полное обесцвечивание метиленового
синего, знак минус (-) - отсутствие обесцвечивания.
Максимальное разведение тест-культур, вызывающее полное
обесцвечивание метиленового синего и выявленное через 1 ч инкубации в
термостате при 37 град.С, принимают за "рабочую дозу".
В среднем, "рабочая доза" тест-культур определяется у:
Вас. subtilis, вар. 6633 в разведении 1:256
Вас. subtilis, вар. L в разведении 1:512
2
Вас. mycoides 537 в разведении 1:128
Micrococcus luteum ATCC 9341 в разведении 1:64.
|
Фрагмент документа "4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ".