О НАДЗОРЕ ЗА ОБОРОТОМ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГМО. Постановление. Главный государственный санитарный врач РФ. 30.11.07 80

IV. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК

     4.1. Метод выделения ДНК с помощью СТАВ:
     - навеску исследуемого гомогенизированного продукта массой 100 мг
поместить в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф на 1,5 мл;
     - добавить 300 мкл деионизированной воды, перемешать шпателем;
     - добавить  500  мкл  лизирующего СТАВ-буфера с меркаптоэтанолом,
тщательно перемешать шпателем;
     - инкубировать при 65 град.C 90 минут;
     - центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;
     - перенести 500 мкл супернатанта в чистую пробирку типа Эппендорф
вместимостью 1,5 мл;
     - добавить 500 мкл хлороформа, перемешать на вортекс 30 секунд;
     - центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;
     - перенести  500  мкл верхней фракции в чистую пробирку, добавить
500 мкл хлороформа, перемешать;
     - центрифугировать 5 минут при 13000 об./мин.;
     - перенести  верхнюю  фракцию  в  чистую  пробирку типа Эппендорф
вместимостью 1,5 мл, не захватывая слой хлороформа;
     - добавить   2   объема   СТАВ-осаждающего   буфера,   перемешать
пипетированием;
     - инкубировать 60 минут при комнатной температуре;
     - центрифугировать 5 минут при 13000 об./мин.;
     - удалить супернатант;
     - растворить осадок в 350 мкл NaCl (1,2М);
     - добавить 350 мкл хлороформа, перемешать на вортекс 30 секунд;
     - центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;
     - перенести  верхнюю  фракцию  в  чистую  пробирку типа Эппендорф
вместимостью 1,5 мл;
     - добавить 0,6 объема изопропилового спирта, перемешать;
     - центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;
     - удалить супернатант;
     - добавить  500 мкл 70%-го раствора этилового спирта и перемешать
на вортекс;
     - центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;
     - удалить супернатант;
     - подсушить  осадок  не  более 5 минут при 65 град.C для удаления
капель спирта;
     - растворить  осадок  в  100 мкл деионизированной воды, осторожно
встряхивая,  полученный  раствор ДНК готов для проведения полимеразной
цепной реакции (ПЦР);
     - хранить при минус 20 град.C.
     4.2. Сорбционный метод выделения ДНК:
     - в  центрифужные пробирки типа Эппендорф на 1,5 мл внести 300 мг
бисера  и  70  -  80 мг анализируемого материала, добавить 0,5 мл 5 мМ
Na2-соль ЭДТА и термостатировать 30 - 60 минут при 65 град.C;
     - к  содержимому  пробирки добавить 400 мкл лизирующего реагента,
перемешать   на   вортекс   до   максимально   однородного  состояния,
термостатировать при 65 град.C 60 - 120 минут;
     - перемешать  на  вортекс,  добавить  500  мкл бидистиллированной
воды, перемешать на вортекс;
     - центрифугировать   1  минуту  при  12000  об./мин.,  прозрачный
супернатант перенести в чистую пробирку;
     - добавить  20  мкл  сорбента,  пробирку поместить на ротатор или
перемешивать на вортекс 10 минут при 10 - 20 об./мин.;
     - центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.;
     - удалить  супернатант,  к  осадку  добавить  200 мкл лизирующего
реагента,    перемешать   на   вортекс   до   однородного   состояния,
центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.;
     - удалить  супернатант,  к осадку добавить 1 мл рабочего раствора
солевого  буфера,  перемешать содержимое пробирки переворачиванием 5 -
10 раз, центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.;
     - удалить супернатант, не задевая осадка;
     - к  осадку  добавить  1  мл  рабочего  раствора солевого буфера,
перемешать  на вортекс, центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.,
удалить супернатант;
     - повторить предыдущий пункт еще раз;
     - подсушить осадок при 65 град.C в течение 4 - 5 минут:
     - к  осадку  добавить  50  мкл  экстракционного  раствора,  отбор
раствора из исходного флакона проводить при постоянном помешивании, не
допуская выпадения в осадок гранул ионообменной смолы;
     - суспендировать  содержимое пробирки на вортекс 5 - 10 секунд до
гомогенного состояния, затем термостатировать 10 минут при 65 град.C;
     - повторно  суспендировать  пробу  на вортекс, центрифугировать 1
минуту при 12000 об./мин.;
     - раствор  ДНК  перенести в чистую пробирку, хранить при минус 20
град.C.