Фрагмент документа "О НАДЗОРЕ ЗА ОБОРОТОМ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГМО".
IV. Молекулярно-генетический анализ
пищевой продукции, полученной с использованием
генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов
и микроорганизмов, имеющих генно-инженерно -
модифицированные аналоги, методом полимеразной
цепной реакции (ПЦР) в реальном времени
4.1. Для выявления ГММ и МГМА в пищевых продуктах методом ПЦР в
реальном времени используют следующие материалы, оборудование,
реактивы:
1) амплификатор с оптической приставкой типа Rotor Gene - 3000,
ABI Prism 7000, iCycler IQ или отечественные аналоги;
2) компьютер, совместимый с программным обеспечением
амплификаторов с оптической приставкой;
3) оптические 96-луночные планшеты типа MicroAmp;
4) оптические крышки типа MicroAmp;
5) оптически прозрачные адгезивные пленки;
6) термостат, поддерживающий температуру +45 град.C, для пробирок
объемом 1,5 мл;
7) центрифуга со скоростью вращения ротора до 12000 об./мин. для
пробирок вместимостью 1,5 и 0,5 мл типа "эппендорф";
8) встряхиватель вибрационный типа "вортекс" со скоростью
вращения до 3000 об./мин.;
9) очки/маска защитные;
10) холодильник бытовой электрический;
11) морозильная камера, обеспечивающая температуру (-20) град.C
или ниже;
12) гомогенизатор типа "SilentCrusher" или других моделей;
13) ступка фарфоровая с пестиком;
14) пинцет медицинский;
15) ножницы медицинские;
16) скальпель медицинский;
17) весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности;
18) дистиллятор;
19) анализатор потенциометрический;
20) облучатель бактерицидный настенный;
21) дозаторы с переменным объемом дозирования:
0,2 - 2,0 мм3 с шагом 0,01 мм3, 0,5 - 10,0 мм3 с шагом 0,01 мм3,
2 - 20 мм3 с шагом 0,01 мм3, 20 - 200 мм3 с шагом 0,1 мм3, 100 - 1000
мм3 с шагом 1 мм3, 2 - 10 см3 с шагом 0,1 см3;
22) пробирки типа "эппендорф" вместимостью 1,5 мл;
23) пробирки типа "эппендорф" для ПЦР вместимостью 0,5 мл;
24) наконечники полимерные объемом 1 - 200 мкл;
25) наконечники полимерные объемом 200 - 1000 мкл;
26) перчатки резиновые;
27) колбы плоскодонные конические разной вместимости;
28) цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100,
1000 см3;
29) воронки стеклянные;
30) штативы для пробирок объемом 1,5 и 0,5 мл;
31) комплект N 2 (модифицированный) реагентов для амплификации
ДНК "Набор для выделения ДНК из ферментных препаратов, стартерных и
заквасочных культур, БАД к пище";
32) реактивы:
- тритон Х-100,
- гуанидина гидрохлорид,
- ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота),
- додецилсульфат натрия,
- суспензия двуокиси кремния,
- фенол водонасыщенный,
- хлороформ водонасыщенный,
- спирт этиловый ректификованный,
- ацетат аммония,
- протеиназа K,
- магния хлорид,
- калия хлорид,
- водный раствор дезоксинуклетидтрифосфатов (0,1 М),
- креозоловый красный,
- термостабильная ДНК-полимераза,
- масло вазелиновое,
- трис-ацетат,
- ледяная уксусная кислота,
- агароза для электрофореза,
- бромистый этидий,
- вода деионизированная.
4.2. Допускаются к использованию оборудование, инструменты и
материалы аналогичного назначения других типов, разрешенные к
применению в установленном порядке и с характеристиками,
обеспечивающими проведение исследований в соответствии с данным
документом.
4.3. Выделение ДНК ГММ и МГМА из заквасочных и стартерных
культур, БАД, ферментных препаратов и пищевых продуктов осуществляют в
соответствии с п. п. 3.13 - 3.17 настоящих Методических указаний.
4.4. ПЦР в реальном времени осуществляют с использованием
модифицированного комплекта N 2 реагентов для амплификации ДНК "Набор
реагентов для выявления селективных маркеров генетически
модифицированных микроорганизмов". Модификация предусматривает
использование в реакционной смеси не только праймеров, но и
флуоресцентно-меченых зондов, а также использование контрольной ДНК
ГММ с известной концентрацией в нескольких десятикратных разведениях.
4.5. Флуоресцентно-меченые зонды представляют собой
олигонуклеотиды, комплементарные амплифицируемой
последовательности-мишени, содержащие на 5`-конце флуорофор -
донорфлуоресцентного излучения, а на 3`-конце - его акцептор
(гаситель).
Нарастание флуоресцентного свечения наблюдают после физического
разобщения флуорофора и гасителя; разобщение флуорофора и гасителя
происходит при гибридизации с амплифицируемым фрагментом ДНК за счет
5`-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы, разрушающей зонд после
его гибридизации с амплифицируемой последовательностью. Рост
регистрируемого флуоресцентного свечения происходит пропорционально
нарастанию числа ампликонов. Это позволяет регистрировать накопление
продуктов амплификации в реальном времени, а сравнение кинетики
флуоресценции ДНК-стандартов и исследуемого образца - определять
относительную концентрацию ДНК в образце.
4.6. Зонды синтезируют на автоматическом олигонуклеотидном
синтезаторе типа ASM102U фосфитамидным методом в режиме DMT-on,
используя фосфорамидиты и полимерный носитель типа Glen Reseach. Для
введения на 3`-конец зонда метки диметиламинофенилазобензойной кислоты
(DABCYL) в качестве гасителя флуоресценции используют фазу 3`-Dabcyl
CPG (типа Glen Reseach) в стандартном режиме синтеза. Введение на
5`-конец зонда флуорофора - донора флуоресценции - осуществляют
автоматическим синтезом, при использовании
6-карбоксифлуоресцеин-амидита (FAM-фосфорамидит). Первичную очистку
зондов осуществляют на колонках типа Poly-Pac, с последующей
дополнительной очисткой в полиакриламидном геле.
4.7. Для ПЦР в реальном времени используют ферменты
Taq-полимеразу Termo-Star, или Taq-полимеразу HotRescue,
инактивированные антителами, или полимеразу AmpliTaq Gold, обладающие
выраженной 5`-экзонуклеазной активностью.
4.8. Для проведения ПЦР в реальном времени используют систему,
состоящую из термоциклера (амплификатора) и флуоресцентного детектора
продуктов ПЦР в реальном времени.
4.9. Концентрацию ДНК ГММ в образце определяют путем сравнения
кинетики флуоресценции ДНК-стандартов в диапазоне разведений
контрольных препаратов (10-кратных разведений контрольной ДНК
известной концентрации) и исследуемого образца.
4.10. Амплификацию проводят по двухступенчатой программе,
объединяющей стадии отжига и элонгации в один этап; конечная
концентрация зондов в реакционной смеси - до 200 нМ.
Реакцию проводят в реакционной смеси объемом 50 мкл, включающей в
себя: десятикратный реакционный буфер, адаптированный к используемому
типу полимеразы; 250 мкМ каждого из 4 дезоксирибонуклеотидтрифосфатов;
300 нМ каждого из праймеров; 200 нМ флуоресцентно-меченого зонда; 5
ед. Taq-полимеразы.
Амплификацию проводят по программе:
1) 1 цикл - 10 мин. -95 град.C;
2) 50 циклов: 20 с - 95 град.C, 1 мин. - 65 град.C.
4.11. Для постановки ПЦР в реальном времени в используемом
приборе для амплификации создают специальный протокол в соответствии с
инструкциями по пользованию; после завершения создания протокола
проверяют наличие в списке режима компенсации базовой линии ПЦР и
отмечают используемые флуоресцентные красители. Контрольную ДНК
используют в известных разведениях определенной концентрации
(стандартах); количество повторов стандартов определяют в соответствии
с руководством по эксплуатации прибора.
4.12. Детекцию результатов ПЦР в реальном времени производят
автоматически в рамках созданного протокола в графическом и цифровом
виде. Автоматический анализ данных происходит следующим образом:
последние 95% данных, собранных на каждом шаге, фильтруются
средневзвешенным методом. Для экспериментов по амплификации выбирают
циклы базовой линии для каждой кривой (образцы) индивидуально с учетом
общего оптимального значения порога. По значениям стандартов вычисляют
стандартную кривую, на основе которой определяют концентрации ДНК ГММ
в исследуемых пробах.
|
Фрагмент документа "О НАДЗОРЕ ЗА ОБОРОТОМ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГМО".