Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".
5.2.1. ПЦР-идентификация ДНК ГММ в готовых
продуктах питания
5.2.1.1. Выделение ДНК ГММ из тестируемого продукта
В выборе метода выделения ДНК определяющую роль играет содержание
жиров в продуктах питания. При повышенном содержании жиров проводится
дополнительная экстракция суспензией неполярных растворителей с водой.
Это позволяет перевести содержащуюся в пищевом продукте ДНК в водную
фазу, в которой и производится дальнейшая очистка.
Обычная длина ПЦР фрагмента при выявлении ДНК ГММ не превышает
1000 пар оснований, поэтому в основу нижеследующих методик легли
процедуры выделения и очистки, позволяющие получить достаточно чистые
препараты ДНК для проведения ПЦР. Вторым критерием отбора методик
явилось требование минимизации времени, затрачиваемого на выделение
одного препарата ДНК.
1. 0,5 г образца пищевого продукта гомогенизируют при помощи
тефлонового пестика в 0,5 мл буфера А (100 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 50 mM
NaCl, 10 мМ р-меркаптоэтанола).
2. После гомогенизации добавляют 100 мкл 20% SDS. Смесь тщательно
перемешивают и инкубируют 20 - 30 мин. при 65 град. С.
3. Охлаждают до 4 град. С, добавляют 0,3 мл 5 М ацетата калия,
перемешивают в вортексе и центрифугируют 10 мин. при 15000 об./мин.
при комнатной температуре.
4. К надосадку добавляют 1 мл смолы Wizard MaxiPreps и инкубируют
смесь 10 мин. при 25 град. С.
5. Затем фильтруют полученную смесь сквозь мини-колонку,
промывают 2 мл 80%-ного изопропанола, центрифугируют (15000 об./мин.,
2 мин.) и удаляют оставшийся в мини-колонке изопропанол.
6. Добавляют в мини-колонку 50 мкл дистиллированной воды,
подогретой до 65 град. С.
7. Инкубируют мини-колонку с водой 10 мин. при 65 град. С,
центрифугируют (15000 об./мин., 2 мин.) и переносят раствор ДНК в
чистую стерильную пробирку.
В зависимости от содержания ДНК в конкретном пищевом продукте на
проведение единичной полимеразно-цепной реакции в объеме 50 мкл
требуется от 2 до 20 мкл полученного препарата ДНК.
Образцы пищевых продуктов с повышенным содержанием масла перед
выделением ДНК требуется подвергнуть дополнительной экстракции
эмульсией хлороформа в воде.
Для этого 0,5 г исследуемого продукта гомогенизируют в смеси 0,5
мл буфера А и 0,5 мл хлороформа и инкубируют гомогенат 20 мин. при 56
град. С. Затем охлаждают его до 4 град. С и центрифугируют 10 мин. при
15000 об./мин. на микроцентрифуге при комнатной температуре. Водную
фазу собирают и переносят в чистую пробирку. Далее продолжают, начиная
с пункта 2 вышеизложенной методики.
5.2.1.2. Выбор праймеров для проведения ПЦР
Для точного определения наличия ДНК вставки в штаммах ГММ
фирмой-заявителем должна быть представлена информация о нуклеотидной
последовательности целевого гена и его регуляторных элементов, а также
о структурных элементах и маркерах вектора.
Это требование вводится для того, чтобы можно было точно
идентифицировать наличие конкретной генетической конструкции. В таком
случае синтетические олигонуклеотиды для проведения ПЦР будут
синтезированы таким образом, чтобы выявить факт наличия генетических
модификаций. Длина используемых при анализе специфических праймеров
должна составлять не менее 20 пар нуклеотидов с целью избежания
появления в результате ПЦР неспецифических продуктов реакции.
В случае, когда подобная информация по каким-то причинам не может
быть представлена (например, фирма - изготовитель продуктов питания
закупает используемые в технологическом процессе штаммы
микроорганизмов у специализированного производителя), необходимо
проводить проверку на присутствие в выделяемой из тестируемой
продукции ДНК наборами праймеров, позволяющими подтвердить видовую
идентификацию штамма и выявить наличие возможных генетических
модификаций. Рекомендуемые стратегии выявления генетических
модификаций предлагают использовать для этих целей наиболее часто
употребляемые векторные последовательности: селективные гены (гены
антибиотикорезистентности, бактериоцинов или ауксотрофные селективные
маркеры), неэкспрессируемые последовательности (полилинкеры, промоторы
или терминаторы), а также последовательности мигрирующих элементов.
Обнаружение таких последовательностей будет свидетельствовать о
возможных незадокументированных генетических модификациях, что
потребует проведения дополнительных исследований, подтверждающих или
опровергающих это предположение.
5.2.1.3. Выбор условий проведения ПЦР
Для ПЦР-анализа ДНК, выделенной из продуктов питания, подбираются
оптимальные условия проведения реакции для каждой конкретной пары
праймеров, обеспечивающие максимальную чувствительность и
специфичность анализа, исключающую наличие перекрестных реакций с
неспецифическими ДНК.
Выбор условий проведения ПЦР включает подбор оптимального
соотношения компонентов реакционной смеси, структуры программы
амплификации (временных и температурных характеристик каждого этапа
амплификации) и адекватного метода детекции результатов.
5.2.1.4. Проведения ПЦР
Для проведения ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза,
соответствующий ей десятикратный ПЦР-буфер, растворы четырех
дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и выбранной пары праймеров. В типичных
экспериментах реакционную смесь объемом 50 мкл составляют так, чтобы
она содержала 350 нг геномной ДНК, 1,5 мМ каждого из четырех
дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, 1 ед. Taq-полимеразы. Затем к
реакционной смеси добавляют 30 пкМ пары олигонуклеотидных праймеров в
буферном растворе следующего состава: 67 мМ Трис-HCl буфер (рН 8,0 при
25 град. С), содержащий 16,6 мМ сульфат аммония, 67 мМ MgCl, 10 мМ
2-меркапто-этанол, 6,7 мкМ ЭДТА и бычий сывороточный альбумин в
концентрации 170 мкг/мл. Далее на каждую пробу наслаивают по 50 мкл
минерального масла и реакцию проводят по специально подобранным
программам в многоканальном амплификаторе ДНК.
При необходимости возможно проведение мультиплексной ПЦР для
анализа нескольких важных фрагментов вставки, а также второго раунда
ПЦР с внутренней парой праймеров (nested PCR) для повышения
специфичности реакции.
Продукты амплификации анализируют с помощью электрофореза в
пластине 6%-ного полиакриламидного геля (2,5 ч при 200 В).
ДНК-маркерами служит стандартный набор фрагментов ДНК плазмиды pBR322,
полученный под действием рестриктазы Alu 1. Окрашивание фрагментов ДНК
осуществляется этидиум бромидом. Анализ результатов и фотографирование
электрофореграммы осуществляют в условиях ультрафиолетовой подсветки
на трансиллюминаторе. Допустимо анализ продуктов ПЦР производить путем
электрофореза в 2%-ном агарозном геле с последующей видео- или
фотодетекцией, полученной на трансиллюминаторе картины. Фотоотпечатки
или оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее
600 точек на дюйм, должны быть приложены к протоколу проведения
испытаний.
Приложение
|
Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".