Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".
5.2.1. ПЦР-идентификация ДНК ГММ в готовых продуктах питания 5.2.1.1. Выделение ДНК ГММ из тестируемого продукта В выборе метода выделения ДНК определяющую роль играет содержание жиров в продуктах питания. При повышенном содержании жиров проводится дополнительная экстракция суспензией неполярных растворителей с водой. Это позволяет перевести содержащуюся в пищевом продукте ДНК в водную фазу, в которой и производится дальнейшая очистка. Обычная длина ПЦР фрагмента при выявлении ДНК ГММ не превышает 1000 пар оснований, поэтому в основу нижеследующих методик легли процедуры выделения и очистки, позволяющие получить достаточно чистые препараты ДНК для проведения ПЦР. Вторым критерием отбора методик явилось требование минимизации времени, затрачиваемого на выделение одного препарата ДНК. 1. 0,5 г образца пищевого продукта гомогенизируют при помощи тефлонового пестика в 0,5 мл буфера А (100 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 50 mM NaCl, 10 мМ р-меркаптоэтанола). 2. После гомогенизации добавляют 100 мкл 20% SDS. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 20 - 30 мин. при 65 град. С. 3. Охлаждают до 4 град. С, добавляют 0,3 мл 5 М ацетата калия, перемешивают в вортексе и центрифугируют 10 мин. при 15000 об./мин. при комнатной температуре. 4. К надосадку добавляют 1 мл смолы Wizard MaxiPreps и инкубируют смесь 10 мин. при 25 град. С. 5. Затем фильтруют полученную смесь сквозь мини-колонку, промывают 2 мл 80%-ного изопропанола, центрифугируют (15000 об./мин., 2 мин.) и удаляют оставшийся в мини-колонке изопропанол. 6. Добавляют в мини-колонку 50 мкл дистиллированной воды, подогретой до 65 град. С. 7. Инкубируют мини-колонку с водой 10 мин. при 65 град. С, центрифугируют (15000 об./мин., 2 мин.) и переносят раствор ДНК в чистую стерильную пробирку. В зависимости от содержания ДНК в конкретном пищевом продукте на проведение единичной полимеразно-цепной реакции в объеме 50 мкл требуется от 2 до 20 мкл полученного препарата ДНК. Образцы пищевых продуктов с повышенным содержанием масла перед выделением ДНК требуется подвергнуть дополнительной экстракции эмульсией хлороформа в воде. Для этого 0,5 г исследуемого продукта гомогенизируют в смеси 0,5 мл буфера А и 0,5 мл хлороформа и инкубируют гомогенат 20 мин. при 56 град. С. Затем охлаждают его до 4 град. С и центрифугируют 10 мин. при 15000 об./мин. на микроцентрифуге при комнатной температуре. Водную фазу собирают и переносят в чистую пробирку. Далее продолжают, начиная с пункта 2 вышеизложенной методики. 5.2.1.2. Выбор праймеров для проведения ПЦР Для точного определения наличия ДНК вставки в штаммах ГММ фирмой-заявителем должна быть представлена информация о нуклеотидной последовательности целевого гена и его регуляторных элементов, а также о структурных элементах и маркерах вектора. Это требование вводится для того, чтобы можно было точно идентифицировать наличие конкретной генетической конструкции. В таком случае синтетические олигонуклеотиды для проведения ПЦР будут синтезированы таким образом, чтобы выявить факт наличия генетических модификаций. Длина используемых при анализе специфических праймеров должна составлять не менее 20 пар нуклеотидов с целью избежания появления в результате ПЦР неспецифических продуктов реакции. В случае, когда подобная информация по каким-то причинам не может быть представлена (например, фирма - изготовитель продуктов питания закупает используемые в технологическом процессе штаммы микроорганизмов у специализированного производителя), необходимо проводить проверку на присутствие в выделяемой из тестируемой продукции ДНК наборами праймеров, позволяющими подтвердить видовую идентификацию штамма и выявить наличие возможных генетических модификаций. Рекомендуемые стратегии выявления генетических модификаций предлагают использовать для этих целей наиболее часто употребляемые векторные последовательности: селективные гены (гены антибиотикорезистентности, бактериоцинов или ауксотрофные селективные маркеры), неэкспрессируемые последовательности (полилинкеры, промоторы или терминаторы), а также последовательности мигрирующих элементов. Обнаружение таких последовательностей будет свидетельствовать о возможных незадокументированных генетических модификациях, что потребует проведения дополнительных исследований, подтверждающих или опровергающих это предположение. 5.2.1.3. Выбор условий проведения ПЦР Для ПЦР-анализа ДНК, выделенной из продуктов питания, подбираются оптимальные условия проведения реакции для каждой конкретной пары праймеров, обеспечивающие максимальную чувствительность и специфичность анализа, исключающую наличие перекрестных реакций с неспецифическими ДНК. Выбор условий проведения ПЦР включает подбор оптимального соотношения компонентов реакционной смеси, структуры программы амплификации (временных и температурных характеристик каждого этапа амплификации) и адекватного метода детекции результатов. 5.2.1.4. Проведения ПЦР Для проведения ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза, соответствующий ей десятикратный ПЦР-буфер, растворы четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и выбранной пары праймеров. В типичных экспериментах реакционную смесь объемом 50 мкл составляют так, чтобы она содержала 350 нг геномной ДНК, 1,5 мМ каждого из четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, 1 ед. Taq-полимеразы. Затем к реакционной смеси добавляют 30 пкМ пары олигонуклеотидных праймеров в буферном растворе следующего состава: 67 мМ Трис-HCl буфер (рН 8,0 при 25 град. С), содержащий 16,6 мМ сульфат аммония, 67 мМ MgCl, 10 мМ 2-меркапто-этанол, 6,7 мкМ ЭДТА и бычий сывороточный альбумин в концентрации 170 мкг/мл. Далее на каждую пробу наслаивают по 50 мкл минерального масла и реакцию проводят по специально подобранным программам в многоканальном амплификаторе ДНК. При необходимости возможно проведение мультиплексной ПЦР для анализа нескольких важных фрагментов вставки, а также второго раунда ПЦР с внутренней парой праймеров (nested PCR) для повышения специфичности реакции. Продукты амплификации анализируют с помощью электрофореза в пластине 6%-ного полиакриламидного геля (2,5 ч при 200 В). ДНК-маркерами служит стандартный набор фрагментов ДНК плазмиды pBR322, полученный под действием рестриктазы Alu 1. Окрашивание фрагментов ДНК осуществляется этидиум бромидом. Анализ результатов и фотографирование электрофореграммы осуществляют в условиях ультрафиолетовой подсветки на трансиллюминаторе. Допустимо анализ продуктов ПЦР производить путем электрофореза в 2%-ном агарозном геле с последующей видео- или фотодетекцией, полученной на трансиллюминаторе картины. Фотоотпечатки или оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее 600 точек на дюйм, должны быть приложены к протоколу проведения испытаний. Приложение |
Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".