Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".
4.1.3. Методика проведения исследования
4.1.3.1. Выделение ГММ, штамма-реципиента или контрольного
(референтного) штамма
Чистую культуру ГММ, штамма-реципиента или контрольного
(референтного) штамма выделяют, пользуясь общепринятыми в
микробиологии методами на рекомендованной для данного вида ГММ и
штамма-реципиента питательной среде. Например, выделение чистой
культуры ГММ вида термофильных стрептококков должно осуществляться со
среды типа M17 по ГОСТ 51331-99, а лактобактерий - со среды MRS по
ГОСТ 51339-99.
4.1.3.2. Постановка реакции биохимической идентификации ГММ,
штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма
Из чистой 18 - 24-часовой культуры готовят суспензию в стерильной
дистиллированной воде. Суспензию тщательно гомогенизируют. Суспензию
доводят до определенной мутности по шкале McFarland в зависимости от
исследуемого вида ГММ и штамма-реципиента. Неправильно приготовленная
суспензия (слишком густая или очень жидкая) может привести к получению
ложных результатов.
Параллельно суспензию ГММ, штамма-реципиента или контрольного
штамма высевают на питательные среды для проверки чистоты культуры, ее
ростовых свойств и/или постановки дополнительных тестов.
Планшет для идентификации извлекают из полиэтиленовой упаковки и
на прилагаемом к планшету бланке регистрируют номер ГММ,
штамма-реципиента и контрольного штамма.
Суспензию бактерий тщательно встряхивают и в каждую лунку
инокулируют определенный объем суспензии (0,1 - 0,2 куб. см) в
зависимости от фирмы-изготовителя и вида исследуемого ГММ и
штамма-реципиента.
После инокуляции в ряд лунок может добавляться стерильное
вазелиновое масло, полностью закрывающее внесенную суспензию клеток
для создания анаэробных условий.
После инокуляции планшет накрывают крышкой и инкубируют 5 - 24
часа при оптимальной температуре для исследуемого вида ГММ (например,
25 - 28 град. С - дрожжи, 42 град. С - лактобациллы).
По окончании инкубации проверяют рост и чистоту культуры методом
посевов на селективные жидкие или плотные питательные среды.
В некоторые лунки (например, ферментация индола) могут быть
добавлены реактивы. Учет результатов на бета-галактозидазу проводят
дважды: через 3 - 5 часов и через 18 - 24 часа. Результаты учитывают
визуально с помощью таблицы "Интерпретация реакций" и заносят в
бланки.
Идентификацию проводят с помощью таблиц и книг-каталогов кодов
соответствующих фирм.
Стабильность фенотипических свойств ГММ и штамма-реципиента
проверяют методом пассирования ГММ и штамма-реципиента на жидких и
плотных питательных средах и дальнейшим через 3 - 5 пассажей
трехкратным тестированием биохимических свойств ГММ и
штамма-реципиента. Трехкратное совпадение всех исследованных
биохимических реакций, выявленное при неоднократном пассировании
культур (не менее 10 пассажей), будет свидетельствовать о стабильности
фенотипических признаков ГММ и штамма-реципиента. Вариабельность
результатов по 1 - 2 реакциям будет являться свидетельством
необходимости постановки дополнительных тестов на стабильность фено- и
генотипических признаков у ГММ и штамма-реципиента. Вариабельность
результатов по большему числу реакций будет служить свидетельством
нестабильности фенотипических признаков у ГММ.
4.1.3.3. Определение чувствительности к антимикробным препаратам
ГММ, штаммареципиента и контрольного штамма
Чувствительность к антимикробным препаратам может быть в ряде
случаев хорошим маркером фенотипических свойств ГММ и
штамма-реципиента. В определенных случаях, а именно тестирования
пробиотиков, определение чувствительности к антимикробным препаратам
является обязательным тестом в микробиологической и
молекулярно-генетической оценке ГММ.
Основой для выбора антибактериальных препаратов, подлежащих
включению в исследование, являются данные о природной устойчивости или
чувствительности отдельных видов ГММ или их групп, о распространении
среди них приобретенной резистентности, а также о клинической
эффективности антибиотиков.
Современные стандартизованные методы оценки
антибиотикорезистентности подразделяются на методы серийных разведений
и диффузионные. В зависимости от вида ГММ и штамма-реципиента,
предназначения ГММ тестирование будет выполняться как методом серийных
разведений, так и диффузионным методом.
4.1.3.3.1. Подготовка к анализу
А. Метод серийных разведений
Постановка метода серийных разведений для оценки
антибиотикорезистентности включает следующие этапы:
а) приготовление растворов антибиотиков;
б) приготовление питательных сред с растворами антибиотиков;
в) приготовление суспензии исследуемого ГММ, штамма-реципиента и
контрольного штамма, стандартизация суспензии и инокуляция;
г) инкубация;
д) интерпретация результатов исследования.
Общими и очень важными этапами в методе серийных разведений
являются: приготовление растворов антибиотиков, питательных сред,
смешивание растворов антибиотиков и питательных сред.
4.1.3.3.2. Приготовление растворов антибиотиков
Используют основные растворы антибиотиков (пригодные для
хранения) и рабочие, используемые "ex tempore" для приготовления
питательных сред.
Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1000 мкг/мл
и выше. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов
готовят с учетом их активности. Расчет навески антибиотика для
приготовления основного раствора проводят по формуле:
Вес (мг) =
Объем растворителя (мл) х Необходимая концентрация (мкг/мл)
= -----------------------------------------------------------.
Активность субстанции (содержание антибиотика в мкг/мл)
Из основных растворов готовят рабочие двукратные концентрации
антибиотиков. Для приготовления рабочих растворов используется
стерильная дистиллированная вода. Расчет навески антибиотика для
приготовления основного раствора в случае, если активность антибиотика
измеряется в ЕД, производится аналогично.
4.1.3.3.3. Приготовление сред, содержащих антибиотики для
серийных разведений
Различают два основных варианта метода серийных разведений в
бульоне: макрометод (в пробирках) и микрометод (в планшетах). Рабочие
растворы антибиотиков для обоих методов готовят по одинаковой схеме.
Отличием является то, что серийные разведения антибиотика делают не в
дистиллированной воде, а в жидкой питательной среде. Жидкая
питательная среда, прошедшая контроль качества, готовится в
соответствии с инструкцией изготовителя.
При постановке методов серийных разведений проводят контроль
роста культуры на среде без антибиотика, а качество среды и
антибиотиков контролируют с использованием референтных штаммов данного
вида. Контролируется также чистота суспензии ГММ, использованного для
инокуляции, путем высева на неселективные среды.
4.1.3.3.4. Учет результатов
Учет результатов при постановке макро- и микрометодов проводят
визуально по появлению видимой мутности или спектрофотометрически. За
МПК принимают концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого
роста.
Б. Дискодиффузионный метод
Постановка дискодиффузионного метода оценки
антибиотикорезистентности включает следующие этапы:
- приготовление питательных сред;
- приготовление суспензии микроорганизма и инокуляция;
- наложение дисков;
- инкубация;
- учет результатов.
Для получения правильных результатов необходимо жестко соблюдать
правила хранения и использования коммерческих дисков.
4.1.3.3.5. Приготовление питательных сред
Приготовление чашек Петри с плотной питательной средой связано с
некоторыми особенностями. Плотную питательную среду готовят в
соответствии с инструкцией изготовителя. Перед заполнением чашки Петри
расплавленной питательной средой ее устанавливают на строго
горизонтальную поверхность, выверенную по уровню. Толщина агарового
слоя должна быть 4,0 мм, что достигается при внесении в чашку Петри
диаметром 100 мм 25 - 30 мл агаровой среды. Соблюдение указанных
требований связано с тем, что размер и форма зоны ингибиции роста
зависят от глубины и равномерности агарового слоя.
После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для
застывания. Перед инокуляцией суспензии чашки с плотной питательной
средой контролируют на отсутствие конденсата жидкости на внутренней
поверхности крышек.
4.1.3.3.6. Приготовление суспензии и инокуляция
Для приготовления инокулята используют 18 - 20-часовую агаровую
или 5 - 6-часовую бульонную культуру исследуемого ГММ. Суспензию
доводят до мутности стандарта McFarland 0,5 (конечная концентрация
7
около 1 - 2 х 10 КОЕ/куб. см).
Приготовленный инокулят в количестве 1 - 2 мл вносят на
поверхность чашки Петри, равномерно по поверхности агара распределяют
покачиванием. Избыток суспензии удаляют пипеткой. Приоткрытые чашки
подсушивают при комнатной температуре в течение 10 - 15 минут.
4.1.3.3.7. Наложение дисков
Через 15 - 20 минут после инокуляции на поверхность питательной
среды вносят диски с антибиотиками. Диски наносят с помощью
автоматического распределителя дисков или стерильным пинцетом. На одну
чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с
расстоянием между краем чашки и диска, а также между дисками 15 - 20
мм. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для
чего их следует аккуратно прижать пинцетом.
4.1.3.3.8. Инкубация и учет результатов
Чашки после наложения дисков помещают в термостат и инкубируют,
перевернув их вверх дном, 18 - 20 часов при оптимальной температуре
для исследуемого ГММ.
После окончания инкубации проводят учет результатов, измеряя
диаметр зоны задержки роста с точностью до 1 мм. Для этого пользуются
штангенциркулем или кронциркулем, раздвигая их концы до видимой зоны
задержки роста и затем измеряя зону задержки в мм с помощью линейки.
|
Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".