МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ
ОРГАНИЗМОВ (ГМО) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ
ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МЕТОДИКА
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ
ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА
17 октября 2005 г.
N МУК 4.2.2008-05
(Д)
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
17 октября 2005 года
Дата введения -
с момента утверждения
1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян -
руководитель, Е.Ю. Сорокина, О.Н. Чернышева, Н.А. Кашина); ФГУЗ
"Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзор России
(Т.В. Воронцова, Т.Н. Потапова); Инновационная корпорация "Биозащита"
(И.В. Панкин).
2. Рекомендован к утверждению Комиссией по государственному
санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по
надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены и введены в действие Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной
службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека Г.Г. Онищенко 17 октября 2005 г.
4. Введены впервые.
1. Область применения
1.1. Настоящие методические указания подготовлены для
идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (далее -
ГМО) растительного происхождения в пищевых продуктах с применением
ферментного анализа на биологическом микрочипе и его последующей
обработки на аппаратно-программном комплексе "ДЕГМИГЕН-001".
1.2. Методические указания разработаны в соответствии с
Федеральным законом от 30.03.1999 N 52-ФЗ (в редакции от 09.05.2005 N
45-ФЗ) "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения",
Законом Российской Федерации от 07.02.1992 N 2300-1 (в редакции от
21.12.2004 N 171-ФЗ) "О защите прав потребителей", Постановления
Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N 322 "Об утверждении
Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека", Постановления Правительства
Российской Федерации от 15.09.2005 N 569 "О Положении об осуществлении
государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской
Федерации", Постановления Правительства Российской Федерации от
24.07.2000 N 554 (в редакции от 15.09.2005 N 569) "Об утверждении
Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом
нормировании".
1.3. Методические указания предназначены для органов и учреждений
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и
благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности
продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также других
испытательных лабораторий, аккредитованных в порядке, установленном
Правительством Российской Федерации.
1.4. Методические указания разработаны для одновременного
определения в одном лабораторном испытании пяти различных маркеров
рекомбинантной ДНК при проведении скрининга с целью выявления ГМО
растительного происхождения в пищевых продуктах, в том числе в
продовольственном сырье.
2. Общие положения
Методические указания содержат описание метода определения ГМО
растительного происхождения в пищевых продуктах с помощью набора
реагентов для выявления и идентификации ГМО растительного
происхождения с применением ферментного анализа на биологическом
микрочипе. Метод основан на идентификации рекомбинантной ДНК с
использованием метода асимметричной мультиплексной полимеразной цепной
реакции (далее - амПЦР) и последующей гибридизацией продуктов этой
амПЦР с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе.
Метод одновременно устанавливает наличие или отсутствие в
анализируемой пробе не менее пяти различных рекомбинантных
последовательностей ДНК: трех регуляторных (35 S, nos и ocs) и двух
селективных (gus, nptII). Идентификация этих последовательностей
позволяет проводить предварительную проверку пищевых продуктов на
наличие ГМО растительного происхождения. Чувствительность метода - не
-12
менее 10 г (1пг) ДНК.
3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы
3.1. Аппаратура и инструменты.
3.1.1. Амплификатор ДНК типа "Терцик-мс-2" под микроцентрифужные
пробирки вместимостью 0,2, 0,5 куб. см со скоростью нагрева/охлаждения
активного элемента не менее 1,5 град.С/с ТУ 9642-001-4648062-98.
3.1.2. Комплекс аппаратно-программный для анализа биологических
микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001" ТУ 9443-001-02699501-2003.
3.1.3. Компьютерная программа "Аrrа" для анализа изображений,
полученных с помощью комплекса "ДЕГМИГЕН-001".
3.1.4. Биологический микрочип с иммобилизованными
олигонуклеотидами ТУ 4320-002-71321417-2004 (Приложение 1 А).
3.1.5. Термостат суховоздушный типа ТВ3-25 с рабочей температурой
42 град.С, рабочий диапазон от 20 град.С до 60 град.С, точность
поддержания температуры +/- 1 град.С ТУ 42-61961.
3.1.6. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-01 2-го
класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности
однократного взвешивания не более +/- 0,0001 г.
3.1.7. Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа Эппендорф
вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120 град.С,
количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания
температуры - 0,2 град.С, разность температур между соседними ячейками
- не более 0,5.
3.1.8. Камера морозильная по ГОСТ 26678-85, обеспечивающая
температуру минус 20 град.С.
3.1.9. Холодильник бытовой по ГОСТ 26678-85.
3.1.10. Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф с частотой
-1
вращения не менее 13000 мин.
3.1.11. Аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость
-1
вращения 250 - 3000 мин. .
3.1.12. Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной
воды по ГОСТ 6709-72.
3.1.13. Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5 -
10,0 куб. мм (шаг - 0,1 куб. мм, точность +/- 2,5% - 10,0%,
воспроизводимость 3% - 7%); 0,5 - 50,0 куб. мм (шаг - 0,5 куб. мм,
точность +/- 2,0% - 5,0%, воспроизводимость 2,5% - 5%); 20,0 - 200,0
куб. мм (шаг - 1,0 куб. мм, точность +/- 1,5% - 2,0%,
воспроизводимость 2% - 3%); 100 - 1000 куб. мм (шаг - 5 куб. мм,
точность +/- 1,0% - 1,5%, воспроизводимость 1% - 2%); 2000 - 10000
куб. мм (шаг - 10 куб. мм, воспроизводимость 1% - 2%).
3.1.14. Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 ТУ 16-535-84
или других видов.
Примечание: Допускается использование другой аппаратуры и
инструментов с аналогичными техническими характеристиками, разрешенных
для применения в установленном порядке.
3.2. Лабораторная посуда и материалы.
3.2.1. Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76.
3.2.2. Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82. Колбы стеклянные мерные
плоскодонные конические вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 куб. см,
ГОСТ 12738-77.
3.2.3. Чашки Петри по ГОСТ 25336-82.
3.2.4. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25,
100, 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.
3.2.5. Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью
0,2; 0,5; 1,5 куб. см.
3.2.6. Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом
дозирования до 10; 20; 200; 1000; 10000 куб. мм.
3.3. Реактивы и реагенты.
3.3.1. Додецилсульфат натрия (SDS).
3.3.2. Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77.
3.3.3. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х.ч. ТУ
6-09-11-1721-83.
3.3.4. Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА). Корпорация "Сигма
Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287.
3.3.5. Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652-00.
3.3.6. Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72.
3.3.7. Вода деионизованная ОСТ 11.029.003-80.
3.3.8. 3%-ный раствор пероксида водорода.
Примечание: Допускается использование других реактивов с
аналогичными техническими характеристиками; препараты импортного
производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000
или EN 29000.
3.3.9. Набор реагентов для выявления и идентификации ГМО
растительного происхождения на биологическом микрочипе состоит из
набора для выделения ДНК, набора для проведения амПЦР и набора для ДНК
гибридизации и ферментного анализа. Наборы рассчитаны на сто реакций.
3.3.10. Набор реагентов для пробоподготовки (бисер - 30 г,
лизирующий реагент - 60 куб. см (2 флакона), сорбент - 2 куб. см (2
пробирки), солевой буфер (10-кратный) - 10 куб. см, экстракционный
раствор - 10 куб. см) ТУ 2643-003-71321417-2004. Порядок приготовления
рабочего раствора солевого буфера описан в 4.1. Остальные реагенты
готовы к использованию.
3.3.11. Набор реагентов для амПЦР ТУ 2643-003-71321417-2004
(включает в себя: сухие смеси реагентов (100 пробирок, каждая пробирка
содержит Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты и хлорид
магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед., 200 мкМ и
2,5 мМ, а также оптимизированную буферную систему для проведения одной
стандартной ПЦР); растворитель; минеральное масло; "+" контроль
амплификации - 1 пробирка, 0,5 куб. см, праймеры на 35S-промотор
вируса мозаики цветной капусты:
- 35S_п 5` CGG СТА СТС CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT ТТС AGA AGA
(39 н.о.);
- 35S_o* 5` CCA TTT TCC TTT TTT ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG A
(40 н.о.);
праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:
- gus_ 5` АСС GTA ССТ CGC АТТ АСС СТТ ACG CTG AAG AGA (33 н.о.);
- gus_o* 5` TGC CCG СТТ CGA AAC CAA TGC СТА AAG AGA (30 н.о.);
праймеры на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium
tumefaciens:
- nos_п 5` GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG АСА GA (32 н.о.);
- nos_o* 5` GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35
н.о.);
праймеры на маркерный ген nptII из транспазона Тn5 бактериального
происхождения:
- npt_п 5` GTG АСС CAT GGC GAT GCC TGC TTG С (25 н.о.);
- npt_o* 5` АСС CAG CCG GCC АСА GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.);
праймеры на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium
tumefaciens:
- ocs_п 5` AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC СТА ААА GA (32 н.о.);
- ocs_o* 5` CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA (32 н.о.).
Праймеры расфасованы в 10 пробирках по 0,5 куб. см.
Примечание: 35S_п; gus_п; nos_п; nptII_п; ocs_п - обозначают
прямые праймеры; 35S_o*; gus_o*; nos_o; nptII_o*; ocs_o* - обозначают
обратные праймеры, меченные биотином; н.о. - нуклеотидные остатки.
3.3.12. Набор реагентов для ДНК гибридизации и ферментного
анализа ТУ 2643-003-71321417-2004: 20xSSC - 50 куб. см;
диаминобензидин (ДАБ) - 100 таблеток; коньюгат пероксидазы хрена со
стрептавидином - 0,1 куб. см с концентрацией 1 мг/куб. см, 1 пробирка.
Примечание: Срок годности набора реагентов - 12 месяцев со дня
изготовления. Основную часть реагентов, упакованную в картонную
коробку, хранят в сухом темном месте при температуре от +2 град.С до
+8 град.С. В отдельных пластиковых пакетах при температуре -20 град.С
хранят праймеры, положительный контроль и конъюгат стрептавидин -
пероксидазы.
4. Подготовка к анализу. Приготовление растворов
4.1. Приготовление 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).
В мерной колбе на 100 куб. см растворить 18,62 г
этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 куб.
см дистиллированной воды. Раствором 30%-ной гидроокиси довести рН
раствора до 8,0, дистиллированной водой - объем раствора до метки,
перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной
температуре до года.
4.2. Приготовление 10%-ного раствора SDS.
Растворить 10 г SDS в 90 куб. см дистиллированной воды. Хранить
при комнатной температуре не более 1 года.
4.3. Приготовление рабочего раствора солевого буфера.
Содержимое флакона с 10-кратным солевым буфером (10 куб. см) (из
набора реагентов) перенести из флакона в цилиндр, довести
бидистиллированной водой до отметки 100 куб. см и 96%-ным этиловым
спиртом - до отметки 300 куб. см и перемешать. Рабочий раствор
солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при
температуре 4 град.С.
5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа
Отбор проб проводят по государственным стандартам,
устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой
продукции: ГОСТ 5904-82, 9163-90, 12292-00, 10852-86, 12430-66,
13979-86, 26313-84, 22617.0-77, 27668-88, 26312-84, 9792-73, 7631-85,
12036-85, 51447-99, 135869.3-86, 13440-89, 17109-88, 19341-73,
26809-86, 27668-88, 27853-88, 28741-90, 29142-91, 13634-90, 15877-70,
17110-71, 17109-88, ГОСТ Р 50436-92, 50437-92, 51926-02, ГОСТ Р ИСО
2170-97.
6. Проведение анализа. Выделение ДНК
6.1. В одноразовые центрифужные пробирки типа eppendorf на 1,5
куб. см внести 300 мг бисера и 70 - 80 мг анализируемого материала.
Добавить 0,5 мл 5 мМ Na2-cоль ЭДТА и термостатировать при 65 град.С в
течение 30 - 60 мин. Время инкубации составляет 30 минут для
процессированных продуктов (мука, чипсы, детское питание и др.) и до
60 мин. для зерна. Через каждые 10 - 15 минут гомогенизировать пробу
срезанным наконечником (для каждой пробы использовать индивидуальный
наконечник).
6.2. К содержимому пробирки добавить 400 куб. мм лизирующего
реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до максимально
однородного состояния. Пробу термостатировать при 65 град.С 60 - 120
мин.
6.3. После термостатирования пробу, при необходимости, еще раз
гомогенизировать, добавить 500 куб. мм бидистиллированной воды и
перемешать на вортексе.
6.4. Центрифугировать пробу 1 мин. при 5000 g (12000 об./мин.).
Прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку.
6.5. Добавить 20 куб. мм сорбента из набора реагентов (перед
использованием сорбент следует интенсивно встряхнуть на вортексе).
Пробирку поместить на ротатор и перемешивать на вортексе 10 минут (10
- 20 об./мин.).
6.6. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.
6.7. Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант. К осадку
добавить 200 куб. мм лизирующего реагента из набора реагентов и
перемешать на вортексе до однородного состояния. Центрифугировать
пробу 10 секунд при 5000 g.
6.8. Удалить супернатант. К осадку добавить 1 куб. см рабочего
раствора солевого буфера из набора реагентов, перемешать содержимое
пробирки переворачиванием 5 - 10 раз. Центрифугировать пробу 10 секунд
при 5000 g.
6.9. Удалить супернатант не задевая осадка.
6.10. К осадку добавить 1 куб. см рабочего раствора солевого
буфера, перемешать на вортексе, центрифугировать пробу 10 секунд при
5000 g и осторожно удалить супернатант.
6.11. Повторить предыдущий пункт еще раз.
6.12. Подсушить осадок при 65 град.С в течение 4 - 5 минут.
6.13. К осадку добавить 50 куб. мм экстракционного раствора из
набора реагентов. Отбор раствора из исходного флакона проводить при
постоянном помешивании, не допуская выпадения в осадок гранул
ионообменной смолы.
6.14. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5 - 10
секунд до гомогенного состояния, затем термостатировать 10 минут при
65 град.С.
6.15. Еще раз суспендировать пробу на вортексе, центрифугировать
1 мин. при 5000 g.
6.16. Супернатант, содержащий очищенную ДНК, перенести в чистую
пробирку и хранить при -20 град.С до проведения ПЦР анализа. При
отборе раствора ДНК необходимо избегать захвата осадка, содержащего
сорбент.
Примечание: Кроме описанного выше сорбционного метода выделения
ДНК, возможно использование метода выделения с помощью СТАВ
(гексадецилтриметиламмониум бромид), описанного в методических
указаниях по определению генетически модифицированных источников в
продуктах питания растительного происхождения методом полимеразной
цепной реакции (МУК 4.2.1902-04 "Определение генетически
модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом
полимеразной цепной реакции").
7. Амплификация
7.1. Перед проведением реакции вынуть из холодильника необходимое
количество микропробирок с сухими реагентами из набора реагентов.
Промаркировать соответствующим образом: "-" контроль", "исследуемые
пробы", "+" контроль".
7.2. Добавить во все пробирки по 5 куб. мм праймеров.
7.3. Добавить во все пробирки по 10 куб. мм растворителя.
7.4. В пробирку, которая служит отрицательным контролем, добавить
5 куб. мм бидистиллированной воды. В опытные пробирки добавить по 5
куб. мм исследуемой ДНК. В пробирку с положительным контролем добавить
5 куб. мм раствора контрольной ДНК.
7.5. Добавить во все пробирки по 20 куб. мм минерального масла
(масло не используется в случае, если амплификатор имеет
термостатируемую крышку).
7.6. Подготовленные для проведения реакции пробирки перенести в
термоблок программируемого термостата и запустить программу
амплификации в соответствии с режимами, приведенными в таблице 1.
Таблица 1
ПРОГРАММА ПРОВЕДЕНИЯ АМПЦР
------------------------------------------------------------------
| Шаг программы |Температура | Время | Количество |
| |град. С |инкубации, сек.| циклов |
|-----------------|---------------|---------------|--------------|
|1. |94 |180 |1 |
|-----------------|---------------|---------------|--------------|
|2. |94 |30 |42 |
|-----------------|---------------|---------------| |
|3. |62,5 |30 | |
|-----------------|---------------|---------------|--------------|
|4. |72 |180 |1 |
------------------------------------------------------------------
Примечание: Для пипетирования жидкостей без примесей
рекомбинантной ДНК (праймеры, растворитель, вода) необходимо иметь
отдельный комплект микродозаторов, не используемых при пробоподготовке
или работах с ДНК-содержащими препаратами. При подготовке смесей для
проведения амПЦР каждую пробирку открывают только перед отбором или
внесением проб, а по окончании манипуляции сразу же закрывают.
Запрещается открывать одновременно несколько микропробирок с пробами и
оставлять их открытыми на длительное время.
7.7. После завершения реакции микропробирки необходимо передать в
помещение, в котором будет проводиться гибридизация. Отбор пробы для
гибридизации проводится из-под слоя минерального масла, в случае его
использования.
7.8. Подготовка проб для амПЦР и их гибридизации с применением
ферментного анализа на биологическом микрочипе в одном помещении не
допускается. Реакционные смеси после амплификации содержат в высоких
концентрациях фрагменты ДНК, контаминация которыми помещений,
оборудования и реактивов может привести к получению ложноположительных
результатов.
8. Проведение ДНК гибридизации
8.1. Приготовить рабочие разведения раствора 20xSSC (3 М NaCl,
0,3 М цитрат натрия, рН 7,4): 2xSSC, 0,l% SDS; 0,lxSSC; 0,lxSSC, 0,1%
SDS; 0,01xSSC. Для приготовления 100 куб. см раствора можно
воспользоваться таблицей 2.
Таблица 2
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ SSC
------------------------------------------------------------------
| Раствор | 20хSSC | 10%-ный SDS | Н О дист. |
| | | | 2 |
|-------------------|-------------|----------------|-------------|
|2xSSC, 0,1% SDS |10 куб. см |1 куб. см |89 куб. см |
|-------------------|-------------|----------------|-------------|
|0,1хSSC |0,5 куб. см |- |99,5 куб. см |
|-------------------|-------------|----------------|-------------|
|0,1xSSC, 0,1% SDS |0,5 куб. см |1 куб. см |98,5 куб. см |
|-------------------|-------------|----------------|-------------|
|0,01хSSC |0,05 куб. см |- |99,95 куб. см|
------------------------------------------------------------------
8.2. Микропробирки с продуктами амплификации ДНК центрифугировать
1 - 2 секунды для сбора пробы на дне пробирки и держать далее только в
вертикальном положении. Добавить в каждую микропробирку 5 куб. мм
20хSSC и 0,2 куб. мм 10% SDS, перемешать и центрифугировать 1 - 2
секунды. Распределить полученную смесь по поверхности микрочипа,
содержащей зоны иммобилизованных олигонуклеотидов.
8.3. Поместить микрочип во влажную камеру (например, в чашку
Петри со смоченным дистиллированной водой бумажным фильтром) и
поставить на 1 час в воздушный термостат с температурой 42 град.С.
8.4. По окончании реакции капли смыть буфером 2хSSC, 0,1% SDS и
затем тщательно промыть чип следующими растворами:
- 2xSSC, 0,l% SDS - 1 раз 5 минут;
- 0,1хSSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 минут;
- 0,1хSSC - 5 раз по 1 минуте;
- 0,01хSSC в течение 10 секунд.
9. Проведение ферментного анализа
9.1. Исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200
раз буфером 1хSSC, содержащим 1% BSA (бычий сывороточный альбумин), из
расчета 25 куб. мм на микрочип. Например, необходимо проанализировать
5 микрочипов. Для этого потребуется 25 х 5 = 125 куб. мм раствора
конъюгата. Готовят с небольшим избытком, 150 куб. мм раствора. Для
этого 1,5 мг BSA растворяют в 150 куб. мм 1хSSC, а затем добавляют
0,75 куб. мм исходного конъюгата.
9.2. Нанести 25 - 30 куб. мм разведенного конъюгата на рабочую
зону микрочипа и поместить его на 30 минут во влажную камеру при
комнатной температуре.
9.3. Смыть конъюгат раствором 1хSSC.
9.4. Залить микрочип раствором 2xSSC и промыть 5 минут.
9.5. Промыть микрочип раствором 1хSSC.
9.6. Непосредственно перед применением приготовить раствор
субстрата - диаминобензидина (ДАБ). Для этого растворить таблетку ДАБ
в 1 куб. см буфера 0,1хSSC, добавить 30 куб. мм 3%-ного раствора
пероксида водорода и перемешать. Раствор использовать немедленно.
9.7. Залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата и
выдержать от 2 до 10 минут при комнатной температуре. В случае
положительной реакции появляются коричневые пятна окисленного
субстрата.
9.8. Промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли
воды и поместить в термостат 42 град.С на 5 - 10 минут. После сушки
микрочип с окрашенными зонами необходимо хранить в темном месте.
10. Сканирование биологических микрочипов
10.1. В соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым
в комплекте с аппаратно-программным комплексом "ДЕГМИГЕН-001",
подготовить сканер микрочипов к работе.
10.2. Поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать
его и закрыть рамку.
10.3. Запустить программу сканирования, функционирующую в
диалоговом режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к
сканированию и только после этого вставить рамку с микрочипом в
приемное окно детектора.
10.4. После завершения сканирования микрочипа необходимо
сохранить изображение (Приложение 1 Б), присвоив файлу соответствующее
имя.
10.5. Для завершения работы с программой сканирования следует
нажать в диалоговом окне клавишу "ВЫХОД".
11. Анализ изображений биочипов
11.1. Запустить программу обработки изображения микрочипа "Аrrа".
11.2. Ввести оцифрованное изображение в программу, для этого
нужно выбрать опцию меню "Файл", и затем открыть изображение. В
появившемся диалоговом окне выбрать формат, в котором представлены
изображения, и выбрать в списке нужный файл, после чего изображение
появится в основном окне программы.
11.3. Провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры
измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого
выбрать опцию меню "Анализ" и затем - "Разметка матрицы". Разметка
начинается с рисования прямоугольника, боковые стороны которого
проходят через центры узлов крайних столбцов. Для этого нужно щелкнуть
левой кнопкой мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки. Затем, держа
кнопку нажатой, переместить правую нижнюю вершину появившегося
прямоугольника в центр нижнего правого узла.
11.4. В результате предварительной разметки на экране появится
четырехугольник с внутренними линиями, расположенными равномерно, в
соответствии с заданным числом столбцов матрицы.
11.5. Чтобы завершить разметку и закрыть диалоговое окно, нужно
нажать клавишу "Принять".
11.6. После завершения базовой разметки проводят автоматическую
коррекцию положения зондов. Для этого в меню выбирается опция
"Настройки/Автоматическая подстройка".
11.7. Для анализа результатов нужно выбрать опцию меню "Анализ" -
"Показать результаты".
11.8. По окончании измерений программа предоставляет возможность
подготовки и распечатки протокола испытаний (Приложение 2). Для этого
нужно выбрать опцию меню "Файл" и затем - "Заполнить протокол". После
этого появится окно с формой для заполнения. После того как она будет
заполнена, нажать кнопку "Выход".
12. Интерпретация результатов
12.1. Появление регистрируемого компьютерной программой Аrrа
оптического сигнала в одной, нескольких или во всех пяти зонах
гибридизации, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает
на присутствие рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о наличии ГМО
растительного происхождения в анализируемом образце (пробе).
12.2. Отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех пяти
гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды,
указывает на не содержание рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о
том, что анализируемый образец (проба) не имеет ГМО растительного
происхождения.
12.3. Появление оптического сигнала в зоне гибридизации при
использовании отрицательного контроля амплификации, свидетельствует о
получении ложноположительного результата. Причиной может быть
загрязнение реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо
обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором 1
H соляной кислоты, заменить реактивы на свежеприготовленные и
повторить анализ.
12.4. Отсутствие оптического сигнала при использовании
положительного контроля амплификации свидетельствует о получении
ложноотрицательного результата. Причиной могут быть потеря активности
одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с
применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. В этом
случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить
анализ.
13. Организация рабочих мест
Организация рабочих мест для проведения исследований, описанных в
настоящих методических указаниях, проводится в соответствии с МУК
4.2.1902-04 "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ)
растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции".
Приложение 1
ПРИМЕР ГИБРИДИЗАЦИОННОЙ КАРТИНЫ ПРОДУКТОВ АМПЦР
НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
А
----------------------------------------------------------------------
| 35S gus nos nрtII ocs | М.П. |
| | |
| ------ ------ ------ ------ ------ | |
| | | | | | | | | | | | |
| ------ ------ ------ ------ ------ | |
| ------ ------ | |
| |K(-)| |K(-)| | |
| ------ ------ | |
| ------ ------ ------ ------ ------ | |
| |K(+)| |K(+)| |K(+)| |K(+)| |K(+)| | |
| ------ ------ ------ ------ ------ | |
| | |
----------------------------------------------------------------------
Б
----------------------------------------------------------------------
| 35S gus nos nрtII ocs | М.П. |
| | |
| ------ ------ | |
| ОП | | | | | |
| ------ ------ | |
| | |
| К- | |
| | |
| ------ ------ ------ ------ ------ | |
| К+ | | | | | | | | | | | |
| ------ ------ ------ ------ ------ | |
| | |
----------------------------------------------------------------------
А - схема негелевого биологического микрочипа для идентификации
ГМИ растительного происхождения;
Б - гибридизационная картина на экране компьютера, полученная в
результате анализа генетически модифицированной сои, содержащей
промотор 35S и терминатор nos.
Приложение 2
ФОРМА ПРОТОКОЛА ИСПЫТАНИЙ ПО ИДЕНТИФИКАЦИИ
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ (ГМО)
РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЕРМЕНТНОГО
АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ
Серия АБ N 0000000
N --------- от "--" ---------- 200- г.
Продукция -------------------------------------------------------
Производитель сырья или продукции -------------------------------
Предъявитель сырья или продукции --------------------------------
Отбор проб произведен в соответствии с нормативным документом на
соответствующую группу сырья или продукции ---------------------------
Акт отбора проб и техническое задание на испытания N -- от ------
Испытания проведены на основании требований
Номер образца ---------------------------------------------------
Характеристика испытуемого образца (маркировка, вид и состояние
упаковки, этикетки, штрих-кода)
в образцах N ---- отсутствует, а в образце N ---- присутствует
Маркировка: -----------------------------------------------------
Годен до ---------------- Штриховой код -------------------------
Результаты испытаний
------------------------------------------------------------------
| Номер | Трансгенные последовательности |
| образца |------------------------------------------------------|
| | 35S | gus | nos | nptII | ocs |
|---------|------------|-----------|------------|--------|-------|
| | | | | | |
------------------------------------------------------------------
Результаты анализа ----------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------
Исполнители:
--------------------- ---------------------
(подпись) (подпись)
--------------------- ---------------------
(подпись) (подпись)
Руководитель испытательной лаборатории -----------------------
(подпись)
М.П. -----------------------
(Фамилия, инициалы)
Заключение распространяется на образец, представленный на
испытания.
НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ (в редакции от
09.05.2005 N 45-ФЗ) "О санитарно-эпидемиологическом благополучии
населения".
2. Закон Российской Федерации от 07.02.1992 N 2300-1 (в редакции
от 21.12.2004 N 171) "О защите прав потребителей".
3. Постановление Правительства Российской Федерации от 24.07.2000
N 554 (в редакции от 15.09.2005 N 569) "Об утверждении Положения о
государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании".
4. Постановление Правительства Российской Федерации от 15.09.2005
N 569 "О Положении об осуществлении государственного
санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации".
5. Постановление Правительства Российской Федерации от 30.06.2004
N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека".
6. Постановление Главного государственного санитарного врача
Российской Федерации от 08.11.2000 N 14 "О порядке проведения
санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной
из генетически модифицированных источников".
7. Постановление Главного государственного санитарного врача
Российской Федерации от 31.12.2004 N 13 "Об усилении надзора за
пищевыми продуктами, полученными из ГМИ".
8. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Продовольственное сырье и пищевые
продукты. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности
пищевых продуктов".
9. ГОСТ 5904-82с "Изделия кондитерские. Правила приемки, методы
отбора и подготовки проб".
10. ГОСТ 9163-90 "Консервы мясные и мясорастительные "Сосиски".
Технические условия".
11. ГОСТ 12292-2000 "Консервы рыбные с растительными гарнирами.
Технические условия".
12. ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы
отбора проб".
13. ГОСТ 12430-66 "Продукция сельскохозяйственная. Методы отбора
проб при карантинном досмотре и экспертизе".
14. ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила
приемки, методы отбора проб".
15. ГОСТ 22617.0-77 "Семена сахарной свеклы. Правила приемки и
методы отбора проб".
16. ГОСТ 27668-88 "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб".
17. ГОСТ 26312.1-84 "Крупа. Правила приемки и методы отбора
проб".
18. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины,
баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц.
Правила приемки и методы отбора проб".
19. ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские
беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки,
органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для
лабораторных испытаний".
20. ГОСТ 12036-85 "Семена сельскохозяйственных культур. Правила
приемки и методы отбора проб".
21. ГОСТ Р 51447-99 "Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб".
22. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".
23. ГОСТ 19341-73 "Консервы рыбные. Печень рыб с растительными
добавками. Технические условия".
24. ГОСТ 26809-86 "Молоко и молочные продукты. Правила приемки,
методы отбора и подготовка проб к анализу".
25. ГОСТ 27668-88 "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб".
26. ГОСТ 27853-88 "Овощи соленые и квашеные, плоды и ягоды
моченые. Приемка, отбор проб".
27. ГОСТ 28741-90 "Продукты питания из картофеля. Приемка,
подготовка проб и методы испытаний".
28. ГОСТ 29142-91 "Семена масличных культур. Отбор проб".
29. ГОСТ 13634-90 "Кукуруза. Требования при заготовках и
поставках".
30. ГОСТ 15877-70 "Кукуруза сахарная консервированная.
Технические условия".
31. ГОСТ 17110-71 "Соя (промышленное сырье). Требования при
поставках. Технические условия".
32. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".
33. ГОСТ Р 50436-92 "Зерновые. Отбор проб зерна".
34. ГОСТ Р 50437-92 "Бобовые культуры в мешках. Отбор проб".
35. ГОСТ Р 51926-2002 "Консервы. Икра овощная. Технические
условия".
36. ГОСТ ИСО 2170-97 "Зерновые и бобовые. Отбор проб молотых
продуктов". |