ПРЕДПРИНИМАТЕЛЬСКОЕ ПРАВО
www.businesspravo.ru
Оглавление

    
                          МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
             БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
                  ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
         МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ
      ОРГАНИЗМОВ (ГМО) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ
            ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
                        МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

                              МЕТОДИКА

             ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ
              ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

                          17 октября 2005 г.
                          N МУК 4.2.2008-05

                                 (Д)


                                                             УТВЕРЖДАЮ
                                              Руководитель Федеральной
                                             службы по надзору в сфере
                                              защиты прав потребителей
                                              и благополучия человека,
                                               Главный государственный
                                                       санитарный врач
                                                  Российской Федерации
                                                          Г.Г.ОНИЩЕНКО
                                                  17 октября 2005 года

                                                       Дата введения -
                                                 с момента утверждения

     1.   Разработаны:   ГУ   НИИ   питания   РАМН  (В.А.  Тутельян  -
руководитель,  Е.Ю.  Сорокина,  О.Н.  Чернышева,  Н.А.  Кашина);  ФГУЗ
"Федеральный  центр  гигиены  и  эпидемиологии" Роспотребнадзор России
(Т.В.  Воронцова, Т.Н. Потапова); Инновационная корпорация "Биозащита"
(И.В. Панкин).
     2.  Рекомендован  к  утверждению  Комиссией  по  государственному
санитарно-эпидемиологическому  нормированию  при Федеральной службе по
надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
     3.  Утверждены  и  введены  в  действие  Главным  государственным
санитарным  врачом  Российской  Федерации,  Руководителем  Федеральной
службы  по  надзору  в  сфере  защиты прав потребителей и благополучия
человека Г.Г. Онищенко 17 октября 2005 г.
     4. Введены впервые.

                        1. Область применения

     1.1.    Настоящие    методические   указания   подготовлены   для
идентификации  генно-инженерно-модифицированных  организмов  (далее  -
ГМО)  растительного  происхождения  в  пищевых продуктах с применением
ферментного  анализа  на  биологическом  микрочипе  и  его последующей
обработки на аппаратно-программном комплексе "ДЕГМИГЕН-001".
     1.2.   Методические   указания   разработаны   в  соответствии  с
Федеральным  законом от 30.03.1999 N 52-ФЗ (в редакции от 09.05.2005 N
45-ФЗ)   "О   санитарно-эпидемиологическом   благополучии  населения",
Законом  Российской  Федерации  от  07.02.1992 N 2300-1 (в редакции от
21.12.2004  N  171-ФЗ)  "О  защите  прав  потребителей", Постановления
Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N 322 "Об утверждении
Положения  о  Федеральной  службе  по  надзору  в  сфере  защиты  прав
потребителей  и  благополучия  человека",  Постановления Правительства
Российской Федерации от 15.09.2005 N 569 "О Положении об осуществлении
государственного  санитарно-эпидемиологического  надзора  в Российской
Федерации",   Постановления   Правительства  Российской  Федерации  от
24.07.2000  N  554  (в  редакции  от 15.09.2005 N 569) "Об утверждении
Положения      о      государственном     санитарно-эпидемиологическом
нормировании".
     1.3. Методические указания предназначены для органов и учреждений
Федеральной  службы  по  надзору  в  сфере  защиты прав потребителей и
благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности
продовольственного   сырья   и   пищевых  продуктов,  а  также  других
испытательных  лабораторий,  аккредитованных  в порядке, установленном
Правительством Российской Федерации.
     1.4.   Методические   указания   разработаны  для  одновременного
определения  в  одном  лабораторном  испытании пяти различных маркеров
рекомбинантной  ДНК  при  проведении  скрининга  с целью выявления ГМО
растительного  происхождения  в  пищевых  продуктах,  в  том  числе  в
продовольственном сырье.

                          2. Общие положения

     Методические указания содержат описание  метода  определения  ГМО
растительного  происхождения  в  пищевых  продуктах  с  помощью набора
реагентов   для   выявления   и   идентификации   ГМО    растительного
происхождения  с  применением  ферментного  анализа  на  биологическом
микрочипе.  Метод  основан  на  идентификации  рекомбинантной  ДНК   с
использованием метода асимметричной мультиплексной полимеразной цепной
реакции (далее - амПЦР) и  последующей  гибридизацией  продуктов  этой
амПЦР  с  применением  ферментного анализа на биологическом микрочипе.
Метод   одновременно   устанавливает   наличие   или   отсутствие    в
анализируемой   пробе   не   менее   пяти   различных   рекомбинантных
последовательностей ДНК:  трех регуляторных (35 S,  nos и ocs) и  двух
селективных   (gus,  nptII).  Идентификация  этих  последовательностей
позволяет проводить  предварительную  проверку  пищевых  продуктов  на
наличие ГМО растительного происхождения.  Чувствительность метода - не
        -12
менее 10   г (1пг) ДНК.

       3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы

     3.1. Аппаратура и инструменты.
     3.1.1.  Амплификатор ДНК типа "Терцик-мс-2" под микроцентрифужные
пробирки вместимостью 0,2, 0,5 куб. см со скоростью нагрева/охлаждения
активного элемента не менее 1,5 град.С/с ТУ 9642-001-4648062-98.
     3.1.2.  Комплекс  аппаратно-программный для анализа биологических
микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001" ТУ 9443-001-02699501-2003.
     3.1.3.  Компьютерная  программа  "Аrrа"  для анализа изображений,
полученных с помощью комплекса "ДЕГМИГЕН-001".
     3.1.4.     Биологический     микрочип     с     иммобилизованными
олигонуклеотидами ТУ 4320-002-71321417-2004 (Приложение 1 А).
     3.1.5. Термостат суховоздушный типа ТВ3-25 с рабочей температурой
42 град.С,  рабочий диапазон от  20  град.С  до  60  град.С,  точность
поддержания температуры +/- 1 град.С ТУ 42-61961.
     3.1.6.  Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-01 2-го
класса   точности   с   пределом  допускаемой  абсолютной  погрешности
однократного взвешивания не более +/- 0,0001 г.
     3.1.7. Термостат  типа  "TERMO 24-15" под пробирки типа Эппендорф
вместимостью 0,5 и 1,5 мл,  диапазон температур от 15 до  120  град.С,
количество  гнезд  -  не  менее 20 каждого типа,  точность поддержания
температуры - 0,2 град.С, разность температур между соседними ячейками
- не более 0,5.
     3.1.8.   Камера  морозильная  по  ГОСТ  26678-85,  обеспечивающая
температуру минус 20 град.С.
     3.1.9. Холодильник бытовой по ГОСТ 26678-85.
     3.1.10. Микроцентрифуга  настольная  типа  Эппендорф  с  частотой
                           -1
вращения не менее 13000 мин.
     3.1.11. Аппарат  для  встряхивания   типа   "Вортекс",   скорость
                        -1
вращения 250 - 3000 мин.  .
     3.1.12.  Дистиллятор,  обеспечивающий  качество  дистиллированной
воды по ГОСТ 6709-72.
     3.1.13.  Микродозаторы  с  переменным  объемом дозирования: 0,5 -
10,0  куб.  мм  (шаг  -  0,1  куб.  мм,  точность  +/-  2,5%  - 10,0%,
воспроизводимость  3%  -  7%);  0,5 - 50,0 куб. мм (шаг - 0,5 куб. мм,
точность  +/-  2,0% - 5,0%, воспроизводимость 2,5% - 5%); 20,0 - 200,0
куб.   мм   (шаг   -   1,0   куб.   мм,  точность  +/-  1,5%  -  2,0%,
воспроизводимость  2%  -  3%);  100  -  1000 куб. мм (шаг - 5 куб. мм,
точность  +/-  1,0%  -  1,5%, воспроизводимость 1% - 2%); 2000 - 10000
куб. мм (шаг - 10 куб. мм, воспроизводимость 1% - 2%).
     3.1.14.  Облучатель  бактерицидный настенный ОБН-150 ТУ 16-535-84
или других видов.
     Примечание:   Допускается   использование   другой  аппаратуры  и
инструментов с аналогичными техническими характеристиками, разрешенных
для применения в установленном порядке.

     3.2. Лабораторная посуда и материалы.
     3.2.1. Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76.
     3.2.2.  Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82. Колбы стеклянные мерные
плоскодонные  конические  вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 куб. см,
ГОСТ 12738-77.
     3.2.3. Чашки Петри по ГОСТ 25336-82.
     3.2.4.  Цилиндры  стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25,
100, 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.
     3.2.5.  Пробирки  микроцентрифужные  типа  Эппендорф вместимостью
0,2; 0,5; 1,5 куб. см.
     3.2.6.  Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом
дозирования до 10; 20; 200; 1000; 10000 куб. мм.
     3.3. Реактивы и реагенты.
     3.3.1. Додецилсульфат натрия (SDS).
     3.3.2. Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77.
     3.3.3.   Этилендиаминтетрауксусная   кислота   (ЭДТА),   х.ч.  ТУ
6-09-11-1721-83.
     3.3.4. Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА). Корпорация "Сигма
Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287.
     3.3.5. Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652-00.
     3.3.6. Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72.
     3.3.7. Вода деионизованная ОСТ 11.029.003-80.
     3.3.8. 3%-ный раствор пероксида водорода.
     Примечание:   Допускается   использование   других   реактивов  с
аналогичными   техническими   характеристиками;  препараты  импортного
производства  должны  иметь международный сертификат качества ИСО 9000
или EN 29000.

     3.3.9.   Набор   реагентов  для  выявления  и  идентификации  ГМО
растительного  происхождения  на  биологическом  микрочипе  состоит из
набора для выделения ДНК, набора для проведения амПЦР и набора для ДНК
гибридизации и ферментного анализа. Наборы рассчитаны на сто реакций.
     3.3.10.  Набор  реагентов  для  пробоподготовки  (бисер  -  30 г,
лизирующий  реагент  -  60 куб. см (2 флакона), сорбент - 2 куб. см (2
пробирки),  солевой  буфер  (10-кратный)  - 10 куб. см, экстракционный
раствор - 10 куб. см) ТУ 2643-003-71321417-2004. Порядок приготовления
рабочего  раствора  солевого  буфера  описан в 4.1. Остальные реагенты
готовы к использованию.
     3.3.11.  Набор  реагентов  для  амПЦР  ТУ  2643-003-71321417-2004
(включает в себя: сухие смеси реагентов (100 пробирок, каждая пробирка
содержит  Taq  ДНК  полимеразу,  дезоксинуклеозидтрифосфаты  и  хлорид
магния  с  конечными  концентрациями, соответственно, 1 ед., 200 мкМ и
2,5 мМ, а также оптимизированную буферную систему для проведения одной
стандартной   ПЦР);  растворитель;  минеральное  масло;  "+"  контроль
амплификации  -  1  пробирка,  0,5  куб.  см, праймеры на 35S-промотор
вируса мозаики цветной капусты:
     - 35S_п  5`  CGG  СТА СТС CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT ТТС AGA AGA
(39 н.о.);
     - 35S_o* 5` CCA TTT TCC TTT TTT ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG A
(40 н.о.);
     праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:
     - gus_ 5` АСС GTA ССТ CGC АТТ АСС СТТ ACG CTG AAG AGA (33 н.о.);
     - gus_o* 5` TGC CCG СТТ CGA AAC CAA TGC СТА AAG AGA (30 н.о.);
     праймеры   на   терминатор   nos  из  агробактерии  Agrobacterium
tumefaciens:
     - nos_п 5` GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG АСА GA (32 н.о.);
     - nos_o*  5`  GCC  TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35
н.о.);
     праймеры на маркерный ген nptII из транспазона Тn5 бактериального
происхождения:
     - npt_п 5` GTG АСС CAT GGC GAT GCC TGC TTG С (25 н.о.);
     - npt_o* 5` АСС CAG CCG GCC АСА GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.);
     праймеры   на   промотор   ocs   из   агробактерии  Agrobacterium
tumefaciens:
     - ocs_п 5` AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC СТА ААА GA (32 н.о.);
     - ocs_o* 5` CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA (32 н.о.).
     Праймеры расфасованы в 10 пробирках по 0,5 куб. см.
     Примечание:  35S_п;  gus_п;  nos_п;  nptII_п;  ocs_п - обозначают
прямые  праймеры; 35S_o*; gus_o*; nos_o; nptII_o*; ocs_o* - обозначают
обратные праймеры, меченные биотином; н.о. - нуклеотидные остатки.

     3.3.12.  Набор  реагентов  для  ДНК  гибридизации  и  ферментного
анализа    ТУ   2643-003-71321417-2004:   20xSSC   -   50   куб.   см;
диаминобензидин  (ДАБ)  -  100 таблеток; коньюгат пероксидазы хрена со
стрептавидином - 0,1 куб. см с концентрацией 1 мг/куб. см, 1 пробирка.
     Примечание: Срок годности набора реагентов - 12  месяцев  со  дня
изготовления.   Основную  часть  реагентов,  упакованную  в  картонную
коробку,  хранят в сухом темном месте при температуре от +2 град.С  до
+8 град.С.  В отдельных пластиковых пакетах при температуре -20 град.С
хранят праймеры,  положительный контроль  и  конъюгат  стрептавидин  -
пероксидазы.

           4. Подготовка к анализу. Приготовление растворов

     4.1. Приготовление 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).
     В   мерной   колбе   на   100   куб.   см   растворить   18,62  г
этилендиаминтетрауксусной  кислоты  (молекулярный вес 372,2) в 80 куб.
см  дистиллированной  воды.  Раствором  30%-ной  гидроокиси довести рН
раствора  до  8,0,  дистиллированной  водой - объем раствора до метки,
перемешать.   Хранить  в  колбе  с  притертой  пробкой  при  комнатной
температуре до года.
     4.2. Приготовление 10%-ного раствора SDS.
     Растворить  10  г SDS в 90 куб. см дистиллированной воды. Хранить
при комнатной температуре не более 1 года.
     4.3. Приготовление рабочего раствора солевого буфера.
     Содержимое  флакона с 10-кратным солевым буфером (10 куб. см) (из
набора   реагентов)   перенести   из   флакона   в   цилиндр,  довести
бидистиллированной  водой  до  отметки  100 куб. см и 96%-ным этиловым
спиртом  -  до  отметки  300  куб.  см  и  перемешать. Рабочий раствор
солевого  буфера  следует  хранить  в  герметично  закрытой посуде при
температуре 4 град.С.

       5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа

     Отбор    проб    проводят    по    государственным    стандартам,
устанавливающим  порядок  отбора  проб  для  однородных  групп пищевой
продукции:   ГОСТ  5904-82,  9163-90,  12292-00,  10852-86,  12430-66,
13979-86,  26313-84, 22617.0-77, 27668-88, 26312-84, 9792-73, 7631-85,
12036-85,   51447-99,   135869.3-86,   13440-89,  17109-88,  19341-73,
26809-86,  27668-88, 27853-88, 28741-90, 29142-91, 13634-90, 15877-70,
17110-71,  17109-88,  ГОСТ  Р 50436-92, 50437-92, 51926-02, ГОСТ Р ИСО
2170-97.

                 6. Проведение анализа. Выделение ДНК

     6.1. В одноразовые центрифужные пробирки типа  eppendorf  на  1,5
куб.  см  внести  300 мг бисера и 70 - 80 мг анализируемого материала.
Добавить 0,5 мл 5 мМ Na2-cоль ЭДТА и термостатировать при 65 град.С  в
течение  30  -  60  мин.  Время  инкубации  составляет  30  минут  для
процессированных продуктов (мука,  чипсы,  детское питание и др.) и до
60 мин.  для зерна.  Через каждые 10 - 15 минут гомогенизировать пробу
срезанным наконечником (для каждой пробы  использовать  индивидуальный
наконечник).
     6.2. К содержимому пробирки  добавить  400  куб.  мм  лизирующего
реагента  из  набора реагентов и перемешать на вортексе до максимально
однородного состояния.  Пробу термостатировать при 65 град.С 60 -  120
мин.
     6.3.  После  термостатирования  пробу, при необходимости, еще раз
гомогенизировать,  добавить  500  куб.  мм  бидистиллированной  воды и
перемешать на вортексе.
     6.4.  Центрифугировать  пробу 1 мин. при 5000 g (12000 об./мин.).
Прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку.
     6.5.  Добавить  20  куб.  мм  сорбента из набора реагентов (перед
использованием  сорбент  следует  интенсивно  встряхнуть на вортексе).
Пробирку  поместить на ротатор и перемешивать на вортексе 10 минут (10
- 20 об./мин.).
     6.6. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.
     6.7.  Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант. К осадку
добавить  200  куб.  мм  лизирующего  реагента  из  набора реагентов и
перемешать  на  вортексе  до  однородного  состояния. Центрифугировать
пробу 10 секунд при 5000 g.
     6.8.  Удалить  супернатант.  К осадку добавить 1 куб. см рабочего
раствора  солевого  буфера  из набора реагентов, перемешать содержимое
пробирки переворачиванием 5 - 10 раз. Центрифугировать пробу 10 секунд
при 5000 g.
     6.9. Удалить супернатант не задевая осадка.
     6.10.  К  осадку  добавить  1  куб. см рабочего раствора солевого
буфера,  перемешать  на вортексе, центрифугировать пробу 10 секунд при
5000 g и осторожно удалить супернатант.
     6.11. Повторить предыдущий пункт еще раз.
     6.12. Подсушить осадок при 65 град.С в течение 4 - 5 минут.
     6.13.  К  осадку  добавить 50 куб. мм экстракционного раствора из
набора  реагентов.  Отбор  раствора из исходного флакона проводить при
постоянном   помешивании,   не  допуская  выпадения  в  осадок  гранул
ионообменной смолы.
     6.14.  Суспендировать  содержимое  пробирки  на  вортексе  5 - 10
секунд  до  гомогенного состояния, затем термостатировать 10 минут при
65 град.С.
     6.15.  Еще раз суспендировать пробу на вортексе, центрифугировать
1 мин. при 5000 g.
     6.16. Супернатант,  содержащий очищенную ДНК,  перенести в чистую
пробирку и хранить при -20  град.С  до  проведения  ПЦР  анализа.  При
отборе  раствора  ДНК необходимо избегать захвата осадка,  содержащего
сорбент.
     Примечание:  Кроме  описанного выше сорбционного метода выделения
ДНК,   возможно   использование   метода   выделения  с  помощью  СТАВ
(гексадецилтриметиламмониум   бромид),   описанного   в   методических
указаниях  по  определению  генетически  модифицированных источников в
продуктах  питания  растительного  происхождения  методом полимеразной
цепной    реакции    (МУК    4.2.1902-04    "Определение   генетически
модифицированных  источников (ГМИ) растительного происхождения методом
полимеразной цепной реакции").

                           7. Амплификация

     7.1. Перед проведением реакции вынуть из холодильника необходимое
количество  микропробирок  с  сухими  реагентами  из набора реагентов.
Промаркировать  соответствующим  образом:  "-" контроль", "исследуемые
пробы", "+" контроль".
     7.2. Добавить во все пробирки по 5 куб. мм праймеров.
     7.3. Добавить во все пробирки по 10 куб. мм растворителя.
     7.4. В пробирку, которая служит отрицательным контролем, добавить
5  куб.  мм  бидистиллированной воды. В опытные пробирки добавить по 5
куб. мм исследуемой ДНК. В пробирку с положительным контролем добавить
5 куб. мм раствора контрольной ДНК.
     7.5.  Добавить  во  все пробирки по 20 куб. мм минерального масла
(масло   не   используется   в   случае,   если   амплификатор   имеет
термостатируемую крышку).
     7.6.  Подготовленные  для проведения реакции пробирки перенести в
термоблок    программируемого   термостата   и   запустить   программу
амплификации в соответствии с режимами, приведенными в таблице 1.

                                                             Таблица 1

                      ПРОГРАММА ПРОВЕДЕНИЯ АМПЦР

------------------------------------------------------------------
|  Шаг программы  |Температура    |     Время     |  Количество  |
|                 |град. С        |инкубации, сек.|    циклов    |
|-----------------|---------------|---------------|--------------|
|1.               |94             |180            |1             |
|-----------------|---------------|---------------|--------------|
|2.               |94             |30             |42            |
|-----------------|---------------|---------------|              |
|3.               |62,5           |30             |              |
|-----------------|---------------|---------------|--------------|
|4.               |72             |180            |1             |
------------------------------------------------------------------

     Примечание:    Для    пипетирования    жидкостей   без   примесей
рекомбинантной  ДНК  (праймеры,  растворитель,  вода) необходимо иметь
отдельный комплект микродозаторов, не используемых при пробоподготовке
или  работах  с ДНК-содержащими препаратами. При подготовке смесей для
проведения  амПЦР  каждую  пробирку открывают только перед отбором или
внесением  проб,  а  по  окончании  манипуляции  сразу  же  закрывают.
Запрещается открывать одновременно несколько микропробирок с пробами и
оставлять их открытыми на длительное время.

     7.7. После завершения реакции микропробирки необходимо передать в
помещение,  в  котором будет проводиться гибридизация. Отбор пробы для
гибридизации  проводится  из-под слоя минерального масла, в случае его
использования.
     7.8.  Подготовка  проб  для амПЦР и их гибридизации с применением
ферментного  анализа  на  биологическом микрочипе в одном помещении не
допускается.  Реакционные  смеси после амплификации содержат в высоких
концентрациях   фрагменты   ДНК,   контаминация   которыми  помещений,
оборудования и реактивов может привести к получению ложноположительных
результатов.

                    8. Проведение ДНК гибридизации

     8.1.  Приготовить  рабочие  разведения раствора 20xSSC (3 М NaCl,
0,3  М цитрат натрия, рН 7,4): 2xSSC, 0,l% SDS; 0,lxSSC; 0,lxSSC, 0,1%
SDS;   0,01xSSC.   Для   приготовления  100  куб.  см  раствора  можно
воспользоваться таблицей 2.

                                                             Таблица 2

                 ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ SSC

------------------------------------------------------------------
|      Раствор      |    20хSSC   |  10%-ный SDS   |  Н О дист.  |
|                   |             |                |   2         |
|-------------------|-------------|----------------|-------------|
|2xSSC, 0,1% SDS    |10 куб. см   |1 куб. см       |89 куб. см   |
|-------------------|-------------|----------------|-------------|
|0,1хSSC            |0,5 куб. см  |-               |99,5 куб. см |
|-------------------|-------------|----------------|-------------|
|0,1xSSC, 0,1% SDS  |0,5 куб. см  |1 куб. см       |98,5 куб. см |
|-------------------|-------------|----------------|-------------|
|0,01хSSC           |0,05 куб. см |-               |99,95 куб. см|
------------------------------------------------------------------

     8.2. Микропробирки с продуктами амплификации ДНК центрифугировать
1 - 2 секунды для сбора пробы на дне пробирки и держать далее только в
вертикальном  положении.  Добавить  в  каждую  микропробирку 5 куб. мм
20хSSC  и  0,2  куб.  мм  10% SDS, перемешать и центрифугировать 1 - 2
секунды.  Распределить  полученную  смесь  по  поверхности  микрочипа,
содержащей зоны иммобилизованных олигонуклеотидов.
     8.3.  Поместить  микрочип  во  влажную  камеру (например, в чашку
Петри   со  смоченным  дистиллированной  водой  бумажным  фильтром)  и
поставить на 1 час в воздушный термостат с температурой 42 град.С.
     8.4.  По  окончании реакции капли смыть буфером 2хSSC, 0,1% SDS и
затем тщательно промыть чип следующими растворами:
     - 2xSSC, 0,l% SDS - 1 раз 5 минут;
     - 0,1хSSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 минут;
     - 0,1хSSC - 5 раз по 1 минуте;
     - 0,01хSSC в течение 10 секунд.

                  9. Проведение ферментного анализа

     9.1. Исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200
раз буфером 1хSSC, содержащим 1% BSA (бычий сывороточный альбумин), из
расчета  25 куб. мм на микрочип. Например, необходимо проанализировать
5  микрочипов.  Для  этого  потребуется  25 х 5 = 125 куб. мм раствора
конъюгата.  Готовят  с  небольшим  избытком, 150 куб. мм раствора. Для
этого  1,5  мг  BSA  растворяют в 150 куб. мм 1хSSC, а затем добавляют
0,75 куб. мм исходного конъюгата.
     9.2.  Нанести  25  - 30 куб. мм разведенного конъюгата на рабочую
зону  микрочипа  и  поместить  его  на  30 минут во влажную камеру при
комнатной температуре.
     9.3. Смыть конъюгат раствором 1хSSC.
     9.4. Залить микрочип раствором 2xSSC и промыть 5 минут.
     9.5. Промыть микрочип раствором 1хSSC.
     9.6.   Непосредственно   перед  применением  приготовить  раствор
субстрата  - диаминобензидина (ДАБ). Для этого растворить таблетку ДАБ
в  1  куб.  см  буфера  0,1хSSC,  добавить 30 куб. мм 3%-ного раствора
пероксида водорода и перемешать. Раствор использовать немедленно.
     9.7.   Залить   рабочую  зону  микрочипа  раствором  субстрата  и
выдержать  от  2  до  10  минут  при  комнатной  температуре. В случае
положительной   реакции   появляются   коричневые   пятна  окисленного
субстрата.
     9.8. Промыть  микрочип  дистиллированной водой,  встряхнуть капли
воды и поместить в термостат 42 град.С на 5 - 10  минут.  После  сушки
микрочип с окрашенными зонами необходимо хранить в темном месте.

              10. Сканирование биологических микрочипов

     10.1. В соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым
в   комплекте   с   аппаратно-программным  комплексом  "ДЕГМИГЕН-001",
подготовить сканер микрочипов к работе.
     10.2.  Поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать
его и закрыть рамку.
     10.3.   Запустить   программу   сканирования,  функционирующую  в
диалоговом  режиме,  дождаться  появления  на  мониторе  приглашения к
сканированию  и  только  после  этого  вставить  рамку  с микрочипом в
приемное окно детектора.
     10.4.   После   завершения   сканирования   микрочипа  необходимо
сохранить изображение (Приложение 1 Б), присвоив файлу соответствующее
имя.
     10.5.  Для  завершения  работы  с программой сканирования следует
нажать в диалоговом окне клавишу "ВЫХОД".

                   11. Анализ изображений биочипов

     11.1. Запустить программу обработки изображения микрочипа "Аrrа".
     11.2.  Ввести  оцифрованное  изображение  в  программу, для этого
нужно  выбрать  опцию  меню  "Файл",  и  затем  открыть изображение. В
появившемся  диалоговом  окне  выбрать  формат, в котором представлены
изображения,  и  выбрать  в списке нужный файл, после чего изображение
появится в основном окне программы.
     11.3. Провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры
измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого
выбрать  опцию  меню  "Анализ"  и затем - "Разметка матрицы". Разметка
начинается   с  рисования  прямоугольника,  боковые  стороны  которого
проходят через центры узлов крайних столбцов. Для этого нужно щелкнуть
левой кнопкой мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки. Затем, держа
кнопку   нажатой,   переместить  правую  нижнюю  вершину  появившегося
прямоугольника в центр нижнего правого узла.
     11.4.  В  результате  предварительной разметки на экране появится
четырехугольник  с  внутренними  линиями, расположенными равномерно, в
соответствии с заданным числом столбцов матрицы.
     11.5.  Чтобы  завершить разметку и закрыть диалоговое окно, нужно
нажать клавишу "Принять".
     11.6.  После  завершения базовой разметки проводят автоматическую
коррекцию   положения  зондов.  Для  этого  в  меню  выбирается  опция
"Настройки/Автоматическая подстройка".
     11.7. Для анализа результатов нужно выбрать опцию меню "Анализ" -
"Показать результаты".
     11.8.  По окончании измерений программа предоставляет возможность
подготовки  и распечатки протокола испытаний (Приложение 2). Для этого
нужно  выбрать опцию меню "Файл" и затем - "Заполнить протокол". После
этого  появится окно с формой для заполнения. После того как она будет
заполнена, нажать кнопку "Выход".

                    12. Интерпретация результатов

     12.1.  Появление  регистрируемого  компьютерной  программой  Аrrа
оптического  сигнала  в  одной,  нескольких  или  во  всех  пяти зонах
гибридизации,  содержащих  иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает
на  присутствие  рекомбинантной  ДНК,  свидетельствующей о наличии ГМО
растительного происхождения в анализируемом образце (пробе).
     12.2. Отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех пяти
гибридизационных  зонах,  содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды,
указывает  на  не содержание рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о
том,  что  анализируемый  образец  (проба)  не имеет ГМО растительного
происхождения.
     12.3.  Появление  оптического  сигнала  в  зоне  гибридизации при
использовании  отрицательного контроля амплификации, свидетельствует о
получении   ложноположительного   результата.   Причиной   может  быть
загрязнение  реактивов  и/или  оборудования.  В этом случае необходимо
обработать  поверхности лабораторных столов и оборудования раствором 1
H   соляной   кислоты,  заменить  реактивы  на  свежеприготовленные  и
повторить анализ.
     12.4.    Отсутствие   оптического   сигнала   при   использовании
положительного   контроля  амплификации  свидетельствует  о  получении
ложноотрицательного  результата. Причиной могут быть потеря активности
одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с
применением  ферментного  анализа  на  биологическом микрочипе. В этом
случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить
анализ.

                     13. Организация рабочих мест

     Организация рабочих мест для проведения исследований, описанных в
настоящих  методических  указаниях,  проводится  в  соответствии с МУК
4.2.1902-04 "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ)
растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции".


                                                          Приложение 1

           ПРИМЕР ГИБРИДИЗАЦИОННОЙ КАРТИНЫ ПРОДУКТОВ АМПЦР
                      НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ

А

----------------------------------------------------------------------
|     35S      gus      nos     nрtII     ocs     |     М.П.         |
|                                                 |                  |
|    ------   ------   ------   ------   ------   |                  |
|    |    |   |    |   |    |   |    |   |    |   |                  |
|    ------   ------   ------   ------   ------   |                  |
|    ------   ------                              |                  |
|    |K(-)|   |K(-)|                              |                  |
|    ------   ------                              |                  |
|    ------   ------   ------   ------   ------   |                  |
|    |K(+)|   |K(+)|   |K(+)|   |K(+)|   |K(+)|   |                  |
|    ------   ------   ------   ------   ------   |                  |
|                                                 |                  |
----------------------------------------------------------------------

Б

----------------------------------------------------------------------
|     35S      gus      nos     nрtII     ocs     |     М.П.         |
|                                                 |                  |
|    ------            ------                     |                  |
| ОП |    |            |    |                     |                  |
|    ------            ------                     |                  |
|                                                 |                  |
| К-                                              |                  |
|                                                 |                  |
|    ------   ------   ------   ------   ------   |                  |
| К+ |    |   |    |   |    |   |    |   |    |   |                  |
|    ------   ------   ------   ------   ------   |                  |
|                                                 |                  |
----------------------------------------------------------------------

     А  -  схема негелевого биологического микрочипа для идентификации
ГМИ растительного происхождения;
     Б  -  гибридизационная картина на экране компьютера, полученная в
результате   анализа   генетически  модифицированной  сои,  содержащей
промотор 35S и терминатор nos.


                                                          Приложение 2

              ФОРМА ПРОТОКОЛА ИСПЫТАНИЙ ПО ИДЕНТИФИКАЦИИ
          ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ (ГМО)
        РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЕРМЕНТНОГО
                  АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ

                          ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ
                          Серия АБ N 0000000
                N --------- от "--" ---------- 200- г.

     Продукция -------------------------------------------------------
     Производитель сырья или продукции -------------------------------
     Предъявитель сырья или продукции --------------------------------
     Отбор проб  произведен в соответствии с нормативным документом на
соответствующую группу сырья или продукции ---------------------------
     Акт отбора проб и техническое задание на испытания N -- от ------
     Испытания проведены на основании требований
     Номер образца ---------------------------------------------------
     Характеристика испытуемого образца (маркировка,  вид и  состояние
упаковки, этикетки, штрих-кода)
     в образцах N ---- отсутствует, а в образце N ---- присутствует
     Маркировка: -----------------------------------------------------
     Годен до ---------------- Штриховой код -------------------------

                         Результаты испытаний

------------------------------------------------------------------
|  Номер  |           Трансгенные последовательности             |
| образца |------------------------------------------------------|
|         |     35S    |    gus    |    nos     | nptII  |  ocs  |
|---------|------------|-----------|------------|--------|-------|
|         |            |           |            |        |       |
------------------------------------------------------------------

     Результаты анализа ----------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------
Исполнители:
    ---------------------                  ---------------------
          (подпись)                              (подпись)
     ---------------------                  ---------------------
           (подпись)                              (подпись)

     Руководитель испытательной лаборатории -----------------------
                                                  (подпись)

            М.П.                           -----------------------
                                             (Фамилия, инициалы)

     Заключение   распространяется   на   образец,  представленный  на
испытания.

                          НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

     1.  Федеральный  закон  от  30.03.1999  N  52-ФЗ  (в  редакции от
09.05.2005   N  45-ФЗ)  "О  санитарно-эпидемиологическом  благополучии
населения".
     2.  Закон Российской Федерации от 07.02.1992 N 2300-1 (в редакции
от 21.12.2004 N 171) "О защите прав потребителей".
     3. Постановление Правительства Российской Федерации от 24.07.2000
N  554  (в  редакции  от 15.09.2005 N 569) "Об утверждении Положения о
государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании".
     4. Постановление Правительства Российской Федерации от 15.09.2005
N    569    "О    Положении    об    осуществлении    государственного
санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации".
     5. Постановление Правительства Российской Федерации от 30.06.2004
N  322  "Об  утверждении  Положения  о Федеральной службе по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека".
     6.  Постановление  Главного  государственного  санитарного  врача
Российской   Федерации  от  08.11.2000  N  14  "О  порядке  проведения
санитарно-эпидемиологической  экспертизы пищевой продукции, полученной
из генетически модифицированных источников".
     7.  Постановление  Главного  государственного  санитарного  врача
Российской  Федерации  от  31.12.2004  N  13  "Об  усилении надзора за
пищевыми продуктами, полученными из ГМИ".
     8.   СанПиН  2.3.2.1078-01  "Продовольственное  сырье  и  пищевые
продукты.  Гигиенические  требования  безопасности  и пищевой ценности
пищевых продуктов".
     9.  ГОСТ  5904-82с "Изделия кондитерские. Правила приемки, методы
отбора и подготовки проб".
     10.  ГОСТ  9163-90 "Консервы мясные и мясорастительные "Сосиски".
Технические условия".
     11.  ГОСТ  12292-2000 "Консервы рыбные с растительными гарнирами.
Технические условия".
     12.  ГОСТ  10852-86  "Семена  масличные. Правила приемки и методы
отбора проб".
     13.  ГОСТ 12430-66 "Продукция сельскохозяйственная. Методы отбора
проб при карантинном досмотре и экспертизе".
     14.  ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила
приемки, методы отбора проб".
     15.  ГОСТ  22617.0-77  "Семена сахарной свеклы. Правила приемки и
методы отбора проб".
     16. ГОСТ 27668-88 "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб".
     17.  ГОСТ  26312.1-84  "Крупа.  Правила  приемки  и методы отбора
проб".
     18.  ГОСТ  9792-73  "Колбасные  изделия  и  продукты  из свинины,
баранины,  говядины  и  мяса  других  видов  убойных  животных и птиц.
Правила приемки и методы отбора проб".
     19.   ГОСТ   7631-85   "Рыба,   морские   млекопитающие,  морские
беспозвоночные   и   продукты   их   переработки.   Правила   приемки,
органолептические  методы  оценки  качества,  методы  отбора  проб для
лабораторных испытаний".
     20.  ГОСТ  12036-85 "Семена сельскохозяйственных культур. Правила
приемки и методы отбора проб".
     21. ГОСТ Р 51447-99 "Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб".
     22. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".
     23.  ГОСТ  19341-73  "Консервы рыбные. Печень рыб с растительными
добавками. Технические условия".
     24.  ГОСТ  26809-86 "Молоко и молочные продукты. Правила приемки,
методы отбора и подготовка проб к анализу".
     25. ГОСТ 27668-88 "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб".
     26.  ГОСТ  27853-88  "Овощи  соленые  и  квашеные,  плоды и ягоды
моченые. Приемка, отбор проб".
     27.  ГОСТ  28741-90  "Продукты  питания  из  картофеля.  Приемка,
подготовка проб и методы испытаний".
     28. ГОСТ 29142-91 "Семена масличных культур. Отбор проб".
     29.   ГОСТ   13634-90  "Кукуруза.  Требования  при  заготовках  и
поставках".
     30.    ГОСТ   15877-70   "Кукуруза   сахарная   консервированная.
Технические условия".
     31.  ГОСТ  17110-71  "Соя  (промышленное  сырье).  Требования при
поставках. Технические условия".
     32. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".
     33. ГОСТ Р 50436-92 "Зерновые. Отбор проб зерна".
     34. ГОСТ Р 50437-92 "Бобовые культуры в мешках. Отбор проб".
     35.  ГОСТ  Р  51926-2002  "Консервы.  Икра  овощная.  Технические
условия".
     36.  ГОСТ  ИСО  2170-97  "Зерновые  и бобовые. Отбор проб молотых
продуктов".
    
Оглавление


Печать
2003 - 2019 © НДП "Альянс Медиа"
Рейтинг@Mail.ru