Страницы: 1 2
энтеровирусов (не менее 20) еще не классифицировано.
Таблица 5
ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ВИДЫ НЕПОЛИОМИЕЛИТНЫХ ЭНТЕРОВИРУСОВ
ЧЕЛОВЕКА И ВХОДЯЩИЕ В ВИДЫ СЕРОТИПЫ
----------------------------------------------------------------------
| Вид | Число | Относятся серотипы |
| | серотипов| |
|--------------|----------|------------------------------------------|
| Энтеровирус | 16 | Коксаки A 2 - 8, 10, 12, 14, 16 |
| человека A | | Энтеровирус 71, 76, 89 - 91 |
|--------------|----------|------------------------------------------|
| Энтеровирус | 41 | Коксаки A9, Коксаки B1 - 6 |
| человека B | | ЕСНО 1 - 7, 9, 11 - 21, 24 - 27, 29 - 33 |
| | | Энтеровирусы 69, 73 - 75, 77, 78 |
|--------------|----------|------------------------------------------|
| Энтеровирус | 11 | Коксаки A1, 11, 13, 15, 17 - 22, 24 |
| человека C | | |
|--------------|----------|------------------------------------------|
| Энтеровирус | 2 | Энтеровирусы 68 и 70 |
| человека D | | |
----------------------------------------------------------------------
В настоящее время определена полностью или частично нуклеотидная
последовательность геномов многих энтеровирусов. Все энтеровирусы
оказались сходными по общей схеме организации геномов, хотя и имеют
различия по видам и серотипам.
3.1.2. Влияние химических и физических агентов
Энтеровирусы вне организма нечувствительны к воздействию всех
известных антибиотиков и химиотерапевтических препаратов. Эфир,
дезоксихолат и различные детергенты, разрушающие арбовирусы,
миксовирусы и ряд других вирусов, не оказывают влияния на
энтеровирусы. Энтеровирусы устойчивы в кислой среде (pH 3 - 5).
Обработка 0,3%-м формальдегидом, 0,1 N HCl или свободным остаточным
хлором в концентрации 0,3 - 0,5 мг/л ведет к быстрой инактивации
энтеровирусов, однако присутствие органических веществ может оказывать
защитное действие.
При 50 град.C энтеровирусы быстро разрушаются. Добавление к
вирусной взвеси хлористого магния в одномолярной концентрации
сохраняет титр вируса при 50 град.C практически неизменным в течение
часа.
В замороженном состоянии активность энтеровирусов сохраняется в
течение многих лет, при хранении в обычном холодильнике (4 - 6 град.C)
- в течение нескольких недель, а при комнатной температуре - на
протяжении нескольких дней.
Энтеровирусы быстро разрушаются под воздействием
ультрафиолетового облучения или при высушивании. Они выдерживают
многократное замораживание и оттаивание без потери активности.
3.2. Роль лабораторных вирусологических исследований
в постановке диагноза энтеровирусной инфекции
Для бесспорного признания вируса этиологическим агентом в
обследуемом случае заболевания не всегда достаточно выделить вирус и
продемонстрировать появление специфических антител. Особенно это
касается этиологии спорадических случаев или первых случаев во время
вспышек заболеваний, этиология которых на первых порах была неясной.
Интерпретация лабораторных данных в указанных случаях требует
особенной осторожности.
Для признания определенного вируса этиологическим фактором
заболевания сбор и анализ доказательств должны быть многосторонними.
Клиническая картина изучаемого заболевания с неясной этиологией
должна быть очерчена по физическим, лабораторным,
патологоанатомическим данным.
Должны быть изучены эпидемиологические характеристики заболевания
(источник инфекции, пути передачи, возраст заболевших, социальные,
географические условия, сезонность и т.п.) в пользу его своеобразия.
Должны быть представлены данные в пользу вирусной этиологии
болезни (т.е. данные, исключающие роль других микроорганизмов и
неинфекционных причин).
От больного должен быть выделен предполагаемый вирусный агент или
выявлены его нуклеотидные последовательности, а также установлена его
таксономическая принадлежность.
Следует показать, что вирус не случайно присутствовал в организме
пациента и не является контаминантом, полученным от использованных для
выделения вируса животных или культур клеток.
Должны быть показаны сероконверсия или другие признаки иммунитета
после перенесенного заболевания.
Заболевание должно быть воспроизведено при введении выделенного
агента животным и изучены характеристики вызванного заболевания.
Вакцина или иммунная сыворотка должны предохранять от
заболевания. Следует учитывать влияние на болезнь и других воздействий
(например, интерференции с вакцинным вирусом полиомиелита у детей с
энтеровирусной инфекцией).
Желательно, чтобы результаты этиологического изучения болезни
были подтверждены другими исследователями.
Энтеровирусы очень часто вызывают бессимптомную инфекцию;
доказаны случаи одновременной инфекции двумя, тремя и даже четырьмя
энтеровирусами. Некоторые энтеровирусы (полиомиелита, Коксаки A7, A9,
A16, A21 и другие, вирусы ЕСНО типов 4, 6, 9, 11, 16, 19, 30 и другие,
энтеровирус типа 71) обнаруживаются периодически в качестве
этиологических агентов эпидемических вспышек, и их патогенность для
человека хорошо доказана. Однако эти же энтеровирусы часто выделяют от
здоровых людей или на фоне очень легкого недомогания. Поэтому простое
выделение вируса еще не является безоговорочным доказательством
этиологической роли этого агента при заболевании и может быть
случайным совпадением. Выделение энтеровируса из пищеварительного
тракта даже при 4-кратном нарастании титра антител к этому вирусу
может не иметь отношения к этиологии обследуемого случая заболевания.
Вместе с тем, регулярное выделение энтеровируса одного типа от сходных
случаев заболеваний и от клинически здоровых лиц из окружения больных
в совокупности с гомотипичной иммунологической реакцией является
веским доказательством этиологической роли соответствующего агента.
Выделение предполагаемого энтеровируса из стерильных жидкостей
организма (СМЖ, крови и др.) или из тканей (центральной нервной
системы, сердечной мышцы и др.), обнаружение характерных
патологоанатомических признаков, обнаружение вирусного антигена (или
геномных последовательностей вируса) в пораженных клетках
рассматривают как убедительные доказательства этиологической связи
выявленного агента с обследуемым заболеванием. Выделение одного и того
же типа вируса от больных со сходными клиническими симптомами во время
вспышки, особенно если оно подкрепляется результатами серологических
исследований, указывает на этиологическую роль вируса этого типа. Для
признания этиологической роли энтеровируса при изучении вновь
возникающих заболеваний (например, вируса Коксаки A7 и энтеровируса
типа 71 при вспышках полиомиелитоподобного заболевания, вирусов ЕСНО
19 и ЕСНО 11 при вспышках острого энтеровирусного увеита), помимо
комплекса данных, полученных в одной лаборатории, чрезвычайно ценным
является получение сходных эпидемиологических и лабораторных данных в
других лабораториях, других районах и в другие годы.
3.3. Методы лабораторной вирусологической диагностики
энтеровирусных инфекций
3.3.1. Безопасность работы в лаборатории, выполняющей
диагностические исследования энтеровирусных инфекций
Согласно российским официальным нормативным документам,
неполиомиелитные энтеровирусы отнесены к IV группе патогенности
("Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования
микроорганизмов I - IV групп патогенности". СП 1.2.036-95). Правила
устройства микробиологических лабораторий, получения разрешений на
работу с микроорганизмами и безопасности работы регламентируются СП
1.2.006-93 и СП 1.2.731-99.
Выполнение диагностических исследований энтеровирусных инфекций
допускается в лабораториях, организациях, структурных подразделениях,
имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение и лицензию на
выполнение работ с микроорганизмами III - IV групп патогенности.
Организация работы в лаборатории выполняется в соответствии с СП
1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп
патогенности и гельминтами".
Клинические материалы, которые используются для диагностических
исследований энтеровирусных инфекций, могут быть инфицированы диким
полиовирусом, поэтому при работе с ними необходимо соблюдать правила,
изложенные в следующих нормативных документах:
- СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и
транспортирования материалов, инфицированных или потенциально
инфицированных диким полиовирусом";
- СП 1.3.1325-03 "Безопасность работы с материалами,
инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом".
Основные рекомендации по работе лабораторий, выполняющих
диагностические исследования энтеровирусных инфекций, содержатся в
"Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита" (4-е издание.
ВОЗ, Женева, 2005) и в "Рекомендациях по эпидемиологическому надзору
за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита"
(ВОЗ, Женева, 2005).
Среди лиц, работающих с энтеровирусами, точно документированные
случаи лабораторных заражений являются редкими. Это - или следствие
несчастного случая, или несоблюдение соответствующих
предосторожностей. Известен случай заноса дикого вируса полиомиелита в
семью работником производства полиовирусной вакцины. Хорошее владение
техникой работы и употребление различных защитных приспособлений
значительно снижают этот риск. Наиболее частой причиной лабораторных
заражений является вдыхание аэрозолей вируссодержащих материалов,
образующихся при работе с пипетками, шприцами, при центрифугировании,
а также контакт с зараженными животными.
Работников, осуществляющих работу с инфекционными материалами,
нужно инструктировать о необходимости обращения к врачу в случае
заболевания лихорадочного типа. Следует периодически брать пробы крови
у персонала и хранить сыворотки в замороженном виде для серологических
исследований в случае заболевания. Для каждой лаборатории в
соответствии с конкретными условиями работы следует разработать
руководство по технике безопасности. Основное внимание следует уделять
необходимости сознательного и ответственного отношения к работе со
стороны персонала, а также тщательному обучению правилам безопасности
новых сотрудников, поскольку само по себе существование правил
безопасности и защитных приспособлений еще не обеспечивает
предупреждения лабораторных заражений.
Санитарными правилами СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с
микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами"
определяются требования к организации работы, включая требования к
помещениям и оборудованию лабораторий, проведению работ в лаборатории,
средствам индивидуальной защиты, содержанию животных, обеззараживанию
материала и уборке помещений, мероприятиям по ликвидации аварий и
организации контроля за выполнением требований биологической
безопасности. В этих санитарных правилах предписаны режимы
обеззараживания различных зараженных материалов (поверхностей рабочих
столов, стен и полов помещений, защитной одежды, лабораторной посуды и
вируссодержащих материалов, инструментов). В этих правилах
предписываются также режимы дезинфекции предметов, которые могут быть
контаминированы выделениями больных людей (одежда, обувь, белье,
посуда, жидкие отходы, посуда из-под выделений, санитарно-техническое
оборудование, уборочный материал, мусор, транспорт). Рекомендуются
также средства и методы дезинфекции, используемые при работе с
микроорганизмами III и IV групп патогенности и бактериологический
метод контроля эффективности работы парового стерилизатора.
3.3.2. Правила забора и транспортирования материалов от больных
для проведения вирусологических исследований
Для подтверждения вирусной этиологии заболевания необходимо
проведение лабораторного исследования, эффективность которого зависит
от правильного сбора соответствующих материалов (тканей, фекалий,
носоглоточных смывов, крови, везикулярной жидкости, спинно-мозговой
жидкости) и транспортирования их в лабораторию. Все пробы для
выделения вируса необходимо брать с соблюдением соответствующих
предосторожностей для исключения контаминации одной пробы материалом
другой пробы этого же больного или материалом пробы другого
обследуемого. Для успешного лабораторного исследования необходимо
производить как можно более ранний отбор проб.
Забор материалов осуществляется медицинскими работниками
лечебно-профилактического учреждения, куда госпитализирован больной.
Для отбора проб используют стерильную стеклянную или пластиковую
посуду.
Две пробы фекалий для выделения вируса отбирают в течение 7 дней
после начала болезни, но не позднее 14 дней, с интервалом 24 - 48 ч.
Носоглоточные/глоточные смывы отбирают в первые 3 - 4 дня от
начала заболевания. Для получения носоглоточного/глоточного смыва
можно использовать стерильную дистиллированную воду, бульон или
солевой раствор. Отбор материала с помощью глоточного тампона
производят в те же сроки. Тампоном протирают заднюю стенку глотки,
миндалин и небных дужек. Тампоны помещают в пробирку с 1 - 2 мл
раствора Хэнкса; пробу исследуют сразу или хранят в замороженном виде.
Спинно-мозговую жидкость берут в первые дни болезни в
асептических условиях стерильным шприцем только по клиническим
показаниям.
Пробы крови для серологической диагностики следует брать утром
натощак. На всех этапах взятия и обработки крови принимают меры для
предотвращения гемолиза. Первую пробу крови (5 мл) берут как можно
раньше после начала болезни, вторую - на 3 - 4-й неделе, в стадии
реконвалесценции. Параллельно кровь исследуют на выделение вируса -
возбудителя болезни.
В случае летального исхода для исследования проводят забор
секционного материала (ткани головного, спинного и продолговатого
мозга и варолиева моста, содержимое кишечника и ткань кишечной
стенки). При необходимости исследованию подвергают и другие материалы
- ткань сердечной мышцы, печени, легких, селезенки, почек,
лимфатических узлов, глаза и т.д. Пробу нужно брать как можно раньше
после смерти. Ткани берут в заранее намеченном порядке, чтобы избежать
их контаминации содержимым желудка и кишечника. Для иссечения тканей
пользуются стерильными инструментами (отдельный набор для каждой
пробы). Объем каждой пробы (кусочка) из тканей центральной нервной
системы должен составлять примерно 1 куб, см; из толстой кишки
иссекается сегмент длиной 3 - 5 см, содержащий фекальные массы.
Собранные пробы немедленно отправляют в лабораторию. Все пробы,
кроме фекалий, спинно-мозговой жидкости и крови, сразу же после взятия
помещают в транспортировочную среду. Если отправка проб задерживается,
их помещают в холодильник при температуре 4 - 8 град.C. Если время до
отправки превышает 24 ч, пробы замораживают при температуре -20 град.
или ниже. Следует сохранять их замороженными до получения
лабораторией. Сыворотки без добавления консервантов хранят в
замороженном виде. Повторное замораживание и оттаивание сывороток
(больше 4 раз) может оказывать неблагоприятное влияние на титр
антител.
Пробы помещают в пластиковые мешки так, чтобы избежать протечек и
повреждений. Все материалы должны сопровождаться соответствующими
документами - направлением на исследование с указанием наименования
учреждения, адреса, телефона, адреса электронной почты, факса и
сопроводительными документами, содержащими основные сведения о
больном.
Транспортирование проб осуществляют с соблюдением условий
"холодовой цепи" в термоконтейнерах или термосах, обеспечивающих эти
условия. При транспортировании проб руководствуются санитарными
правилами "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования
микроорганизмов I - IV групп патогенности. СП 1.2.036-95".
При отборе, хранении и транспортировании проб руководствуются
основными методическими документами:
- "Рекомендации по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами
для поддержки программы ликвидации полиомиелита" (ВОЗ, Женева, 2005);
- "Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита" (4-е
издание. ВОЗ, Женева, 2005).
3.3.3. Выделение энтеровирусов
Основными методами лабораторного подтверждения энтеровирусной
инфекции являются выделение вируса (в культуре клеток или на животных)
и обнаружение РНК энтеровирусов с помощью ПЦР. Выделение вируса хотя и
требует большего времени, дает наиболее однозначный ответ на вопрос об
этиологии заболевания и позволяет использовать выделенный вирус для
последующих эпидемиологических исследований. ПЦР обладает большей
чувствительностью, большей быстротой и позволяет выявлять вирусы, не
размножающиеся в культуре клеток. ПЦР используют при исследовании
спинно-мозговой жидкости и материалов из верхних дыхательных путей.
3.3.3.1. Культуры клеток
Универсальной культуры клеток (или культуральной системы),
пригодной для выделения всех энтеровирусов, не существует. Некоторые
штаммы энтеровирусов не обладают цитопатогенностью ни для одной из
известных культур клеток и могут быть выделены только с использованием
чувствительных лабораторных животных, что достаточно сложно в условиях
практической лаборатории. Обобщенные сведения о чувствительности
наиболее распространенных в лабораториях перевиваемых культур клеток к
различным энтеровирусам представлены в табл. 6.
Таблица 6
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК
К РАЗЛИЧНЫМ ЭНТЕРОВИРУСАМ
------------------------------------------------------------------
| Вирусы | Проявление цитопатического эффекта |
| | на культуре клеток |
| |-------------------------------------------|
| | RD | HEp-2 | L20B | BGM |
|--------------------|----------------|-------|------------|-----|
|Полиомиелита 1 - 3 |+ | + |+ | + |
|--------------------|----------------|-------|------------|-----|
|ЕСНО |+ | - |- | +/- |
|--------------------|----------------|-------|------------|-----|
|Коксаки A |+/- | - |(Коксаки A | - |
| |за исключением | |2 - 6, 8, | |
| |неразмножающихся| |10, 14) | |
| |A1, A19, A22 | | | |
|--------------------|----------------|-------|------------|-----|
|Коксаки B |- | + |- | + |
|--------------------|----------------|-------|------------|-----|
|Энтеровирусы 68 - 71|+/- | - |- | - |
------------------------------------------------------------------
Для увеличения вероятности выделения энтеровируса из исследуемого
материала целесообразно использовать не менее двух видов культур
клеток, одной из которых должна быть культура клеток RD.
Эффективность исследования материала зависит от состояния
клеточных культур: клетки должны сохранять высокую чувствительность к
энтеровирусам, аутентичность, стабильность и быть свободными от
загрязнения микроорганизмами (простейшими, бактериями, грибами,
дрожжами, микоплазмами, вирусами).
Культуры клеток должны быть получены из аттестованного
официального источника. Подробные рекомендации по работе с культурами
клеток изложены в "Руководстве по лабораторным исследованиям
полиомиелита" (4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005).
3.3.3.2. Подготовка проб для исследования в культуре клеток
Пробы фекалий. Готовят 10 - 20%-ю суспензию фекалий в
сбалансированном солевом растворе (ФСБ) с антибиотиками. Пробы
обрабатывают хлороформом, к действию которого устойчивы энтеровирусы.
Такая обработка позволяет избавиться от бактериального и грибкового
загрязнения пробы, удаляет потенциально токсичные липиды, способствует
диссоциации вирусных агрегатов.
В маркированную центрифужную пробирку последовательно добавляют
10 мл ФСБ с антибиотиками, 1 г стеклянных бус и 1 мл хлороформа.
Вносят примерно 2 г фекальной пробы, плотно закрывают пробирку и
интенсивно встряхивают в течение 20 мин. Центрифугируют с охлаждением
в течение 20 мин. при 1500 g. Надосадочную жидкость отбирают для
исследования. (Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита.
4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005.)
Тампоны. Тампоны встряхивают в транспортировочной среде для
высвобождения клеточного материала, избегая образования аэрозолей.
Полученную суспензию обрабатывают хлороформом, как описано выше.
Спинно-мозговая жидкость. Пробы спинно-мозговой жидкости
используют для исследования без дополнительной обработки. Если проба
мутная, ее осветляют центрифугированием при 1600 - 2000 g в течение 10
мин.
Тканевые пробы. Готовят 10 - 20%-ю тканевую суспензию. Для этого
ткани растирают в стерильной ступке, добавляя при необходимости
стерильный песок и небольшое количество транспортировочной среды.
Суспензию осветляют центрифугированием при 1600 - 2000 g в течение 10
мин.
3.3.3.3. Выделение и идентификация вирусов на культуре клеток
При выделении энтеровирусов с помощью чувствительных культур
клеток следует руководствоваться принципами, изложенными в
"Рекомендациях по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для
поддержки программы ликвидации полиомиелита" (ВОЗ, Женева, 2005),
"Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита" (4-е издание.
ВОЗ, Женева, 2005), МУ 4.2.2029-05 "Санитарно-вирусологический
контроль водных объектов" (Москва, 2006).
Энтеровирусы обычно идентифицируют в реакциях нейтрализации
инфекционности, связывания комплемента, преципитации,
иммунофлюоресценции или подавления гемагглютинации. Проведение всех
этих реакций возможно лишь при наличии диагностических
типоспецифических иммунных сывороток высокого титра. Наиболее
чувствительным, специфичным и распространенным способом идентификации
является реакция нейтрализации инфекционности.
В основе реакции нейтрализации инфекционности лежит
взаимодействие исследуемого вируса с гомологичной сывороткой (или
смесью антисывороток), которая нейтрализует вирус, что проявляется в
виде отсутствия ЦПЭ на культуре клеток. В опыте по нейтрализации
вирусную суспензию, содержащую 100 ТЦД , смешивают в равном объеме с
50
диагностическими сыворотками. После инкубации в течение 1 - 2 ч при 37
град.C смесь вводят в культуры клеток. Иммунная сыворотка, которая
предотвращает развитие ЦПЭ, указывает на тип вируса.
При постановке реакции нейтрализации для идентификации
выделенного агента руководствуются вышеуказанными методическими
документами.
3.3.4. Серологические методы диагностики энтеровирусных инфекций
В сыворотке пациента можно обнаружить специфические антитела
(нейтрализующие, комплементсвязывающие, преципитирующие, подавляющие
гемагглютинацию). Диагностика отдельных случаев заболевания только
серологическими методами требует большого количества исследований со
всеми известными серотипами энтеровирусов, поэтому ее предпринимают
только при наличии данных, позволяющих предполагать тип
этиологического агента (характерной клинической картины болезни,
выделения и идентификации энтеровируса от больного, наличия вспышки
заболеваний, вызванных установленным типом вируса).
Определение антител проводят с диагностической целью или при
изучении эпидемиологических аспектов инфекции.
Для диагностических целей необходимы, по крайней мере, две пробы
сыворотки, первую из которых берут как можно раньше после начала
болезни, а вторую - через 2 - 3 недели после первой. Диагноз инфекции
подтверждается значительным подъемом титра специфических антител во
второй пробе. Диагностически значимым считают 4-кратный и больший
подъем титра антител.
Для эпидемиологических исследований достаточно одной пробы
сыворотки от каждого обследуемого; внимание следует обращать на
правильный отбор обследуемых лиц и компоновку групп, чтобы получить
наиболее представительные результаты.
В настоящее время для серологической диагностики используют
преимущественно реакцию нейтрализации инфекционности. Другие методы
выявления антител (реакцию связывания комплемента, преципитацию в
агаре, подавление гемагглютинации) используют редко. В основе
определения титров антител с помощью реакции нейтрализации лежит
принцип взаимодействия известного вируса с гомологичными антителами,
присутствующими в сыворотке, что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на
культуре клеток.
Разведения сыворотки (двукратные или пятикратные до,
приблизительно, 1:2500) смешивают с равными объемами разведения
вируса, содержащего 100 ТЦД , в том объеме смеси, который будет введен
50
в культуру при заражении. Смесь выдерживают 2 ч при 37 град.C и вносят
в 2 - 3 пробирки или лунки с культурой клеток. Контроль должны
включать: а) наименьшее (1:4) разведение сыворотки для проверки
токсичности; б) контроль качества клеток со средой; в) титрование
рабочей дозы вируса. Титром сыворотки считают наибольшее разведение,
защищающее 50% зараженных культур от действия 100 ТЦД вируса.
50
3.3.5. Молекулярно-биологические методы диагностики
энтеровирусных инфекций
Основные сведения об использовании молекулярно-биологических
методов для индикации и идентификации энтеровирусов изложены в
Методических указаниях 4.2.2029-05 "Санитарно-вирусологический
контроль водных объектов".
Разработанные в последние годы молекулярно-биологические методы
индикации и типирования энтеровирусов позволяют выявить наличие
энтеровирусных геномных последовательностей в исследуемом материале
уже через несколько часов после начала работы и установить их типовую
принадлежность в большинстве случаев уже через 2 - 3 дня.
Обязательным условием для получения достоверных результатов при
проведении молекулярно-биологической диагностики является наличие
квалифицированного персонала.
Набор помещений и оборудования (ОТ-ПЦР, электрофорез),
организация работы должны исключать возможность случайной контаминации
исследуемых проб.
Главное преимущество молекулярно-биологических методов - быстрота
и достоверность выявления и типирования возбудителей. Это создает
возможность раннего этиологического диагноза и экономию на средствах
лечения и длительности пребывания в стационаре (например, при снятии
диагноза бактериального менингита или сепсиса). При быстрой постановке
этиологического диагноза возможно проведение быстрой специфической
профилактики (например, введение гамма-глобулина при вспышках
энтеровирусного менингита или увеита).
Главным недостатком традиционных методов выделения и типирования
энтеровирусов является их длительность.
Быстрота и специфичность определения принадлежности возбудителя
могут иметь исключительно важное значение при изучении вспышек
заболеваний ("молекулярная эпидемиология"). Создается надежная основа
для быстрого и точного установления источников инфекции, времени и
путей распространения возбудителя, влияния бытовых условий, соблюдения
режимов санитарии в больницах, эффективности проведения
профилактических мероприятий.
Наиболее часто ОТ-ПЦР используют для диагноза энтеровирусной
инфекции путем прямого выявления последовательностей геномной РНК
вируса в клинических пробах. Имеется множество модификаций методики,
но все методы, способные установить родовые последовательности
энтеровирусов, имеют несколько общих узловых характеристик. Наиболее
важной из них является использование праймеров для 5` нетранслируемой
области вирусного генома. Опубликованы последовательности многих
праймеров, специфичных для различных последовательностей этого региона
у разных групп энтеровирусов. Однако значительная часть праймеров не
проверена на достаточно большом числе штаммов, выделенных из
клинических материалов, чтобы проконтролировать их реактивность со
всеми серотипами и штаммами и поэтому не оценена достаточно хорошо для
использования в диагностике. Главным преимуществом панэнтеровирусной
ОТ-ПЦР является быстрое выявление энтеровируса даже с малым
количеством исследуемого материала (как, например, СМЖ) и вирусов,
которые не размножаются в культурах клеток. Главным недостатком
ОТ-ПЦР-диагностики является вариабельность результатов, зависящая
главным образом от природы исследуемой пробы. Хотя в некоторых случаях
ОТ-ПЦР способна уловить единичные копии вирусной РНК, иногда ее
чувствительность оказывается намного ниже, например, при исследовании
проб кала (но все же не ниже чувствительности культур клеток).
Молекулярное типирование энтеровирусов основано на ОТ-ПЦР и
определении нуклеотидной последовательности в области генома,
кодирующей белок капсида VP1. Серотип исследуемого изолята определяют
сравнением полученных последовательностей с имеющимися в генном банке
последовательностями прототипных энтеровирусов человека. Этот метод
несоизмеримо ускоряет типирование и может быть использован для
идентификации изолятов, которые трудно или невозможно типировать,
используя обычные иммунологические и вирусологические методы. Метод
особенно полезен для оценки родства штаммов во время вспышек.
4. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ НЕПОЛИОМИЕЛИТНЫХ ЭНТЕРОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Энтеровирусы обнаруживают у людей во всех районах земного шара. В
тропических и субтропических странах они циркулируют постоянно. В
странах с умеренным климатом энтеровирусы наиболее часто встречаются в
конце лета и начале осени и могут быстро распространяться среди
населения в виде скрытых или явных эпидемий. Из-за отсутствия
иммунитета дети наиболее восприимчивы к инфекции энтеровирусами и
служат основными их распространителями. Зараженность детей при низком
санитарно-гигиеническом уровне жизни может доходить до 50%. Уровень
естественного иммунитета с возрастом увеличивается. Чем хуже
санитарные условия, тем в более раннем возрасте происходит
инфицирование, и вырабатывается невосприимчивость. В некоторых районах
свыше 90% детей оказываются иммунными к распространенным типам
энтеровирусов уже в возрасте 5 лет. С возрастанием уровня личной и
коммунальной гигиены циркуляция энтеровирусов сокращается, и
увеличивается число лиц, доживающих до взрослого возраста без
инфицирования и без иммунитета.
4.1. Пути передачи
Источником инфекции является больной человек или инфицированный
бессимптомный носитель вируса. Вирус выделяется из носоглотки и
кишечного тракта. Механизм передачи - фекально-оральный, аспирационный
(аэрозольный). Пути передачи - водный, контактно-бытовой, пищевой,
воздушно-капельный. Относительная роль каждого из путей передачи
остается неясной и может варьироваться в зависимости от сроков после
начала болезни (или инфицирования), характеристик вируса и условий
окружения. Факторы передачи инфекции - контаминированная
энторовирусами вода, овощи, руки, игрушки и другие объекты внешней
среды.
Энтеровирусы регулярно выделяют из сточных вод, и по видовому
составу и количественному содержанию можно судить об их циркуляции на
соответствующих территориях. Поверхностные воды часто контаминированы
энтеровирусами (озера, бассейны), их изредка обнаруживали даже в
хлорированной водопроводной воде. Доказано, что некоторые вспышки
серозного менингита в сибирских городах были связаны с потреблением
контаминированной воды. Использование сточных вод для полива
сельскохозяйственных угодий, приводящее к сохранению вируса на овощах,
не является важным путем передачи вируса.
4.2. Инкубационный период и период заразительности
Инкубационный период широко варьируется, составляя от 2 до 35
дней, в среднем - до 1 недели. Высокая заразительность энтеровирусов
убедительно доказана. Заболеваемость детей составляет обычно 10 - 20%,
достигая среди детей самых младших возрастов 50%. Часто наблюдается
внутрисемейное распространение инфекции. Эпидемиологические данные
указывают, что заразительность инфицированных лиц выше в ранние
периоды инфекции, когда возбудитель присутствует в экскретах организма
в наибольших концентрациях. Вирус обнаруживают в крови, моче,
носоглотке и фекалиях за несколько дней до появления клинических
симптомов. Через 2 недели большинство энтеровирусов еще выделяется с
фекалиями, но уже не обнаруживается в крови или носоглоточном
отделяемом.
4.3. Некоторые характеристики эпидемиологии
энтеровирусных инфекций
Такие факторы, как возраст, пол и социально-экономический статус
играют существенную роль в эпидемиологии энтеровирусных инфекций.
Большое число неполиомиелитных энтеровирусов, легкость и широта
их распространения, зависящие от предыдущих инфекций и связанного с
ними иммунитета, объясняют тот факт, что первичные инфекции имеют
место преимущественно в детском возрасте. При первичных инфекциях
количество выделяемого вируса и длительность его выделения являются
наибольшими, поэтому дети представляют собой наиболее важный источник
инфекции, особенно в семьях. Вероятность вторичного инфицирования и
тяжесть клинических проявлений существенно варьируются для различных
энтеровирусов. До 90% и более членов семьи были заражены вирусами
острого геморрагического конъюнктивита (энтеровирус типа 70 и Коксаки
A24), в то время как другие вирусы - Коксаки и ЕСНО - инфицировали
только около 50 - 75% восприимчивых членов семьи, преимущественно
детей в возрасте 5 - 9 лет.
Большинство энтеровирусных инфекций протекает более тяжело у
взрослых лиц, в то же время некоторые энтеровирусы (например, ЕСНО 11)
вызывают в редких случаях у новорожденных исключительно тяжелое
заболевание и быстро приводят к летальному исходу ("вирусный сепсис").
Особую важность имеет распространение энтеровирусных инфекций в
организованных детских коллективах (детских садах, школах), когда в
группах детей до 50% детей могут оказаться зараженными. Хорошо
документированные многочисленные случаи внутрибольничных
энтеровирусных инфекций объясняются как недостаточно продуманным
устройством больниц (их планировкой, системами сантехники), так и в
еще большей мере недостаточной обученностью и дисциплиной персонала по
соблюдению мер профилактики внутрибольничных инфекций. Примерами
являются вспышки острого энтеровирусного увеита в больницах
Красноярска, Омска и Иркутска в 1980 - 1989 гг. с десятками и сотнями
заболевших детей, потерявших зрение.
Почти все энтеровирусы могут вызывать как спорадические случаи
заболевания, так и быть причиной крупных вспышек или даже пандемий.
Энтеровирус 70-го типа вызвал пандемию геморрагического конъюнктивита,
которая охватила десятки миллионов человек с большим количеством
неврологических осложнений.
Принципиально важной для понимания эпидемиологии энтеровирусных
инфекций является их высокая изменчивость: быстро сменяются серотипы
энтеровирусов, изменяется географическая локализация вспышек,
клиническая картина заболевания. Важно то, что один и тот же серотип
вируса может вызывать совершенно различные по клинике заболевания
(даже в одной семье в одно время), и что различные серотипы
энтеровирусов могут давать заболевания со сходной клинической картиной
(например, полиомиелит может быть вызван вирусами полиомиелита,
Коксаки A7 или энтеровирусом типа 71).
Характерно, что в одном месте одновременно циркулируют только
несколько серотипов энтеровирусов.
Серологическое обследование населения показало, что значительная
его часть имеет нейтрализующие антитела к определенным типам
энтеровирусов, что говорит о контакте с инфекцией в прошлом. Наличие
IgM антител к энтеровирусам у 4 - 6% населения указывает на то, что
эта часть популяции перенесла свежую (в течение 1 - 2 месяцев)
энтеровирусную инфекцию. Было установлено также, что инфекция одним
типом энтеровируса бустирует титры IgM и нейтрализующих антител к
другим серотипам энтеровирусов. Наличие и уровень антител к
определенному серотипу варьируется в зависимости от времени, места,
возраста. Поэтому интерпретация результатов серологических
обследований должна быть весьма осторожной.
4.4. Молекулярная эпидемиология
Нуклеотидная последовательность генома является непревзойденным
"маркером" любого вируса и дает возможность проследить его "судьбу"
(пути передачи на уровне конкретных пациентов, передачу между
географическими областями и т.д.). При высокой степени сходства
нуклеотидных последовательностей генома нескольких изолятов из одной
эпидемии можно с уверенностью утверждать, что эпидемия была вызвана
одним генотипом вируса и, скорее всего, имела общий источник. При
изучении молекулярной эпидемиологии энтеровирусов наиболее часто
определяют полную или частичную последовательность нуклеотидов в
области генома VP1, поскольку результаты изучения последовательностей
в этой относительно стабильной области генома совпадают с результатами
серотипирования и дают ценную информацию о характеристиках штамма.
4.5. Основные направления эпидемиологического надзора
за энтеровирусными инфекциями
Эпидемиологический надзор осуществляется органами и учреждениями,
осуществляющими государственный санитарно-эпидемиологический надзор.
Целью эпидемиологического надзора является оценка
эпидемиологической ситуации и разработка эпидемиологически
обоснованных мероприятий, направленных на предупреждение возникновения
случаев заболеваний, вызываемых энтеровирусами. Эпидемиологический
надзор за энтеровирусными инфекциями представляет собой постоянное
наблюдение за эпидемическим процессом и включает:
- слежение за заболеваемостью энтеровирусными инфекциями;
- слежение за циркуляцией энтеровирусов среди населения и в
объектах окружающей среды (вода, продукты питания);
- изучение клинических проявлений инфекций (учет различных форм и
тяжести течения заболеваний, частоты возникновения и характера
осложнений, лабораторное подтверждение диагноза);
- оценка эффективности проводимых мероприятий и принятие
административных решений;
- прогнозирование развития эпидемиологической ситуации.
Эпидемиологический анализ заболеваемости энтеровирусными
инфекциями является составной частью проведения общего
эпидемиологического надзора за заболеваемостью. Особое внимание
уделяется анализу причин летальных исходов. Значение имеет анализ
данных догоспитального периода, сроки обращения от начала заболевания,
сроки госпитализации от момента обращения, первоначальный диагноз, а
также анализ лабораторного вирусологического обследования, сроки
забора и доставки материала в лабораторию. Эпидемиологический анализ
проводится в целом по территории и по отдельным районам, а также по
городам и сельской местности.
4.5.1. Учет, регистрация и отчетность о заболеваемости
энтеровирусными инфекциями
Диагноз энтеровирусной инфекции устанавливается только на
основании лабораторного подтверждения (выделение энтеровируса из
биологических материалов, нарастание титра антител).
Врачи всех специальностей, средние медицинские работники
лечебно-профилактических, образовательных, оздоровительных, а также
учреждений социального обеспечения, независимо от форм собственности и
ведомственной принадлежности, при оказании всех видов медицинской
помощи обязаны выявлять больных энтеровирусной инфекцией, а также лиц,
подозрительных на эту инфекцию.
Выявление больных осуществляется при медицинском осмотре лиц,
обращении за медицинской помощью, оказании медицинской помощи на дому,
в детских дошкольных, образовательных, оздоровительных, социального
обеспечения и других учреждениях.
На каждый случай энтеровирусной инфекции или подозрения на это
заболевание лечебно-профилактическое учреждение немедленно
представляет в филиал "Центра гигиены и эпидемиологии" в субъекте
Российской Федерации экстренное извещение по форме N 058/у (по
телефону, электронной почте). Ответственность за полноту и
своевременность представления экстренного извещения в филиал "Центра
гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации несет
руководитель лечебно-профилактического учреждения.
Каждый случай энтеровирусного заболевания (или подозрения на это
заболевание) подлежит регистрации и учету по месту его выявления в
лечебно-профилактических, детских, подростковых, оздоровительных и
других учреждениях, независимо от ведомственной принадлежности и форм
собственности, а также в медицинских учреждениях, занимающихся частной
практикой, в журнале учета инфекционных заболеваний (форма N 060/у).
Лечебно-профилактическое учреждение, уточнившее, изменившее или
отменившее диагноз, обязано отослать новое извещение.
Для персонального учета больных и лиц с подозрением на это
заболевание, а также для контроля полноты и сроков представления
информации в учреждения, осуществляющие государственный
санитарно-эпидемиологический надзор, сведения из экстренных извещений
вносятся в журнал учета инфекционных заболеваний как в учреждениях
здравоохранения, так и в учреждениях, осуществляющих государственный
санитарно-эпидемиологический надзор. На каждого больного с подозрением
на это заболевание оформляется карта эпидемиологического расследования
случая инфекционного заболевания в установленной форме.
При возникновении групповых заболеваний (10 и более случаев) в
детских дошкольных, подростковых и лечебно-профилактических
учреждениях направляется внеочередное донесение в "Центр гигиены и
эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации и управление
Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации.
При подозрении на серозный менингит или другую форму поражения
нервной системы инфекционной этиологии больные должны быть
госпитализированы для уточнения диагноза и лечения. В большинстве
спорадических случаев заболевания диагноз энтеровирусной инфекции
устанавливается поздно, после получения результатов вирусологического
исследования, в конце пребывания больного в стационаре или после его
выписки.
4.5.2. Организация и проведение профилактических и
противоэпидемических мероприятий
4.5.2.1. Организация профилактических мероприятий
Методы специфической профилактики неполномиелитных энтеровирусных
инфекций не разработаны как из-за особенностей их эпидемиологии, так и
из-за большого числа серотипов. В 70-е годы в нашей стране была
разработана инактивированная вакцина против инфекции энтеровирусом
типа 71. Она была успешно применена для массовой вакцинации детей в
Болгарии после случившейся в этой стране в 1975 году большой эпидемии
полиомиелитоподобного заболевания, вызванной энтеровирусом типа 71. Не
разработаны также методы неспецифической профилактики неполиомиелитных
энтеровирусных инфекций. Массовая вакцинация всего детского населения
живой вакциной против полиомиелита купировала вспышки серозного
менингита и энтеровирусного увеита в нескольких сибирских городах в
разные годы, по-видимому, в результате интерференционного прессинга
аттенуированных вирусов полиомиелита.
Профилактические мероприятия, направленные на предупреждение
распространения возбудителя, проводятся органами и учреждениями
госсанэпидслужбы, здравоохранения, а также гражданами, индивидуальными
предпринимателями и юридическими лицами в соответствии с действующим
законодательством Российской Федерации.
Комплексные планы противоэпидемических мероприятий
разрабатываются управлениями Роспотребнадзора по субъектам Российской
Федерации, органами управления здравоохранением субъектов Российской
Федерации и заинтересованными организациями.
Профилактические мероприятия направлены на предотвращение
загрязнения возбудителем объектов окружающей среды, санитарное
благоустройство источников водоснабжения, соблюдение правил удаления и
обезвреживания нечистот, обеспечения населения безопасными продуктами
питания и доброкачественной питьевой водой.
4.5.2.2. Организация и проведение противоэпидемических
мероприятий
Противоэпидемические мероприятия в очаге энтеровирусной инфекции
направлены на его локализацию с целью максимального недопущения
возможного распространения инфекции, выявление источника возбудителя
инфекции, в частности пищевых продуктов или питьевой воды, которые
могли бы являться факторами передачи энтеровирусов, а также на
определение круга лиц, подвергшихся риску заражения.
При возникновении заболеваний, имеющих клиническую картину,
характерную для энтеровирусной инфекции, необходимо провести следующие
мероприятия:
1. Обязательная и как можно более ранняя изоляция заболевших.
Особое внимание должно быть обращено на изоляцию больных с легкими
формами болезни, являющихся основным источником распространения
инфекции по причине ошибочной трактовки заболевания, проходящего часто
под диагнозами "грипп", "острый гастрит" и другие. Ранняя изоляция
особенно важна в детских организованных коллективах. С целью ранней
диагностики и своевременной изоляции заболевших необходимо проводить
медицинское наблюдение за контактировавшими детьми с ежедневным
осмотром кожи, слизистой зева, с измерением температуры тела.
2. Изоляция больных с легкими формами болезни без ясных признаков
поражения нервной системы (энтеровирусная лихорадка, эпидемическая
миалгия, герпетическая ангина) проводится сроком на 10 дней, после
чего переболевший может быть возвращен в коллектив без дополнительных
сроков карантинизации.
3. При подозрении на серозный менингит или другую форму поражения
нервной системы энтеровирусной этиологии больные должны быть
госпитализированы в стационар с целью уточнения диагноза, проведения
рационального лечения и режима, предупреждающего дальнейшие нарушения
функций центральной нервной системы. Выписку из стационара больных
после перенесенного серозного менингита или других форм поражения
нервной системы целесообразно проводить не ранее истечения двух недель
от начала болезни (учитывая сроки нормализации клинических проявлений
заболевания, нормализации спинно-мозговой жидкости) с последующим
щадящим режимом на такой же срок.
4. При появлении первых случаев заболевания карантин в детских
коллективах накладывается сроком на 10 дней. При массовом
распространении заболеваний среди населения города, района и так далее
рекомендуется перевод детских дошкольных учреждений на круглосуточную
работу. Обнаружение энтеровирусов у контактировавших здоровых лиц не
требует специальных мер лечения и профилактики этой инфекции.
5. В случаях массового распространения заболевания следует
запретить проведение массовых мероприятий.
6. Организовать подворные обходы с целью выявления лиц больных,
подозрительных на заболевание и изоляцию их.
7. Проводить вирусологическое и серологическое (парные сыворотки)
обследования больных.
8. Проводить вирусологическое и серологическое (по показаниям)
обследования контактных лиц в очагах.
9. Дезинфекционные мероприятия в очагах проводить так же, как при
инфекционных заболеваниях с фекально-оральным механизмом передачи
вирусной этиологии.
10. Несмотря на определенные успехи, достигнутые в изучении
клиники, этиологии и эпидемиологии заболеваний, вызванных вирусами
Коксаки и ЕСНО, до настоящего времени не разработаны методы
специфической и неспецифической профилактики этих инфекций.
Одним из перспективных методов борьбы с энтеровирусными
инфекциями является антагонистическое действие на болезнетворный
энтеровирус аттенуированных штаммов Сэбина (живой полиомиелитной
вакциной). Этот способ был успешно использован для купирования вспышек
серозного менингита в Республике Калмыкия, Свердловской и Иркутской
областях, вспышек полиоподобного заболевания, вызванного EV71, в
Болгарии и вспышек острого энтеровирусного увеита в ряде городов
Сибирского федерального округа.
Принцип действия ОПВ при купировании эпидемии серозного менингита
основан на быстром (2 - 3 дня) заселении кишечника в 80 - 90% детей от
1 года до 14 лет вакцинным полиовирусом и, как следствие, вытеснение
из циркуляции энтеровирусов - возбудителей серозного менингита.
Вакцинацию (1-кратно) надо проводить на подъеме заболеваемости, не
дожидаясь, когда число заболевших достигнет нескольких сот человек.
4.6. Гигиеническое воспитание и обучение граждан по вопросам
профилактики энтеровирусных инфекций
4.6.1. Гигиеническое воспитание и обучение населения осуществляют
в процессе воспитания и обучения в дошкольных и других образовательных
учреждениях, при профессиональной и гигиенической подготовке и
аттестации должностных лиц и работников организаций, деятельность
которых связана с производством, хранением, транспортированием и
реализацией пищевых продуктов и питьевой воды, воспитанием и обучением
детей, коммунально-бытовым обслуживанием населения, а также при
проведении профилактических медицинских осмотров.
4.6.2. Координацию и руководство гигиеническим воспитанием и
обучением населения мерам личной и общественной профилактики
энтеровирусных заболеваний осуществляют органы и учреждения,
осуществляющие государственный санитарно-эпидемиологический надзор.
Эта работа должна проводиться в тесном контакте с заинтересованными
учреждениями и организациями.
4.6.3. В целях гигиенического воспитания и обучения населения
используют каналы массовой информации (местная печать, радио,
телевидение и т.д.), а также сотрудничают с общественными и
культурно-просветительными организациями.Страницы: 1 2 |