Страницы: 1 2
входных ворот инфекции. Для туляремийной инфекции нехарактерно наличие
продромального периода. Независимо от клинической формы для туляремии
типично острое (редко постепенное) начало с познабливанием или
потрясающим ознобом и резким повышением температуры тела до 38-40
град.С и выше. Вначале лихорадка носит постоянный характер, а затем
могут быть различные варианты. Для начального периода характерны
слабость, головная боль, головокружение, снижение аппетита, язык
обложен серовато-белым налетом, имеют место разной локализации
мышечные боли, особенно в поясничной области и икроножных мышцах,
нарушение сна, повышенная потливость, особенно в ночные часы,
отставание пульса от температуры (относительная брадикардия),
тенденция к снижению кровяного давления.
Продолжительность начального периода общих клинических проявлений
2-3 дня, затем обнаруживаются признаки той или иной клинической формы.
Длительность лихорадочного периода при туляремии 2-3 неделя и более в
зависимости от клинической формы, тяжести заболевания и начала
специфического лечения. В тяжелых случаях - сильная головная боль,
бессонница, эйфория; характерен своеобразный внешний вид больного -
синюшно-багровый цвет лица, наиболее выраженный на веках, вокруг глаз,
на губах, на мочках ушей. Нередко вокруг подбородка - бледный
треугольник - facies tularaemica, отмечаются явления конъюктивита,
сосуды склер инъицированы, точечные кровоизлияния на слизистой
оболочке полости рта, возможны носовые кровотечения. Печень
увеличивается и пальпируется со 2-3 дня болезни, селезенка обычно
увеличивается позже - с 6-9 дня болезни.
При осмотре кожных покровов можно выявить элементы сыпи
эритематозного, папулезного, розеолезного и петехиального характера.
Сыпь чаще обнаруживается при затяжном течении болезни, возникая с 3
дня и держится до 8-12 дня болезни. После угасания сыпи появляется
пластинчатое или пластинчато-отрубевидное шелушение; пигментация после
сыпи сохраняется до недели.
Температура быстро нарастает ко 2-3 дню болезни; типы
температурных кривых самые разнообразные: ремиттирующая, неправильно
интермиттирующая, постоянная и ундулирующая. Волнообразная лихорадка
связана с поражением лимфатической системы, ее подъемы совпадают с
периодом нагноения лимфоузлов. Продолжительность лихорадки колеблется
от 5-7 дней до 30 дней, чаще 2-3 недели. Фаза выздоровления
сопровождается непостоянным субфебрилитетом. В случае присоединения
осложнений (пневмония, плеврит) изменяется и характер лихорадочной
ремиссии (ремиттирующая и интермиттирующая).
Продолжительность болезни составляет в среднем от 16 до 30 суток,
при преобладании поражения лимфатической системы (по старой
классификации - развитии бубонов) болезнь затягивается до 2-3 месяцев.
Для туляремии характерна умеренная лейкопения или нормоцитоз в
первые дни болезни, в разгаре болезни наблюдается палочкоядерный
сдвиг, токсическая зернистость в нейтрофилах, лимфоцитоз, моноцитоз (в
3-4 раза), эозинопения, при тяжелом течении - анзозинофилия,
лейкоцитоз, ускоренная СОЭ.
В месте заноса возбудителя лимфогенно и/или гематогенно могут
образовываться характерные для туляремии очаговые некрозы, со
своеобразной клинической симптоматикой.
Лимфадениты занимают центральное место в клинике туляремии.
Поскольку начальный период заболевания не имеет патогномоничных
симптомов для диагностики туляремии исключительно важное значение
имеет тщательный эпидемиологический анамнез. Характерным для туляремии
в эпидемиологическом отношении является отсутствие контагиозности,
т.е. опасности заражения здоровых людей от больного человека. Учитывая
это обстоятельство, при необходимости больной может быть
госпитализирован в терапевтическое или другое отделение.
1. Ульцерогландулярная форма туляремии (по старой классификации
язвенно-бубонная). Для этого клинического варианта характерно наличие
кожного дефекта (язвочки), или как принято называть первичного
аффекта, в месте внедрения возбудителя. Язвочка, а она может быть не
одна, чаще образуется в результате трансмиссивного заражения - укуса
слепня, комара и редко при непосредственном присасывании клеща.
Язвочка, как правило локализуется на открытых частях тела (шея,
предплечья, голени), проходит динамику развития: пятно, папула,
везикула, пустула, язва.
Трансмиссивный путь заражения типичен для летнего (теплого)
времени года.
Данная форма туляремии может быть также результатом контактного
заражения при снятии шкурок, разделке тушек инфицированных животных,
таких как зайцы, ондатры, водяные полевки. Размер язвочек, как
правило, не превышает 5-7 мм в поперечнике. Края ее несколько
приподняты за счет инфильтрации ткани: отделяемое язвочки
серозно-гнойное, скудное, болезненность незначительная. Образование
первичного аффекта в виде изъязвления кожи всегда сопровождается
лимфаденитом - увеличением и умеренной болезненностью лимфатических
узлов, их локализация связанна с местом внедрения возбудителя. Наличие
лимфангоита для ульцерогландулярной формы туляремии нетипично. Язвочка
заживает под коркой довольно медленно, в течение 2-3 недель, а иногда
и больше и оставляет после отпадения корочки депигментированное пятно
или уплощенный рубец.
Эта форма туляремии протекает обычно легко и значительно реже -
средней тяжести. Длительность заболевания обычно не превышает 2-3
недель, особенно при своевременно предпринятом специфическом лечении.
Язвочка в силу небольших размеров и потому, что не причиняет особых
болезненных ощущений, иногда остается незамеченной больными (примерно
в 15% случаев). Иногда дефект кожи на месте заражения может вообще
отсутствовать и тогда ведущим в клиническом симптомокомплексе
заболевания является увеличенный лимфоузел, т.е. воспаление
регионарного лимфатического узла. Локализация лимфаденита в этих
случаях является четким указанием на место входных ворот инфекции.
2. Гландулярная форма туляремии (по старой классификации
бубонная). Как правило, лимфаденит при туляремии наблюдается в
результате контактного заражения, т.е. при обработке и разделке тушек
инфицированных животных. Возможно заражение также и трансмиссивным
путем и через инфицированную воду при переходе вброд. Чаще заражение
происходит через кожу рук с последующим вовлечением в воспалительный
процесс группы локтевых и подмышечных лимфатических узлов. Лимфаденит
развивается через 2-3 дня от начала болезни, постепенно увеличиваются
лимфоузлы и достигают максимума размеров к 5-8 дню болезни. Различают
первичный и вторичный лимфаденит. Первичный аффект возникает
вследствие лимфогенного распространения возбудителя, вторичный
лимфаденит развивается при гематогенном распространении возбудителя,
как результат септического туляремийного процесса. Лимфаденит бывает
одиночным и множественным - вовлекается группа регионарных лимфоузлов,
возникают конгломераты лимфоузлов и отчасти в процессе участвуют и
прилегающие ткани (периаденит). Отдельные лимфоузлы в составе
конгломерата претерпевают различные изменения. В то время как в одних
наблюдается острое воспаление, другие нагнаиваются и самопроизвольно
вскрываются.
Выделяют несколько периодов развития лимфаденита: начальный,
период полного формирования, период угасания или обратного развития.
Размеры лимфаденита могут варьировать от лесного ореха до
размеров куриного яйца, а иногда и больше. Подвижность лимфоузла
ограничена, болезненность не резко выражена, явления периаденита
умеренно выражены или отсутствуют. Исход лимфаденита, как и при других
клинических формах, может быть различным: полное рассасывание,
нагноение с последующим самопроизвольным или хирургическим вскрытием,
заканчивающимся рубцеванием.
При изъязвлении лимфоузла выделяется густой сливкообразный гной с
формированием свища и дальнейшим рубцеванием и склеротизацией -
стойким уплотнением лимфоузла в результате замещения ткани узла
соединительной тканью.
При нагноении и четкой флюктуации следует произвести
хирургическое вскрытие. В этом случае происходит более быстрое
заживление. Один из исходов туляремийного лимфаденита - уменьшение его
в размерах, уплотнение за счет замены дифференцированной ткани
соединительной тканью. В таком состоянии лимфатический узел может
оставаться длительное время (месяцами). Обычно размеры таких
склеротизированных лимфатических узлов невелики (не превышают размеров
боба или лесного ореха), они безболезненны и практически больных не
беспокоят. Лимфоузлы рассасываются медленно и волнообразно ее сменой
периодов обострения и ремиссии. Исход лимфаденита, длительность
заболевания находятся в прямой зависимости от своевременного
специфического лечения.
Что касается дифференциального диагноза ульцерогландулярной и
гландулярной формы туляремии, то следует иметь в виду лимфадениты при
чуме, кожную форму сибирской язвы, туберкулез лимфатических узлов,
инфекционный мононуклеоз и другие заболевания, характеризующиеся
воспалением и увеличением периферических лимфатических узлов.
Указанные клинические варианты туляремии могут быть результатом
заражения не только в теплое время года, но и в другие сезоны, что
определяется особенностями хозяйственной деятельности людей и их
контактами с природой. Трансмиссивные вспышки или групповые
заболевания обычно охватывают и детей.
3. Окулогландулярная форма туляремии (офтальмическая, по старой
классификации - глазо-бубонная). Как следует из названия эта форма
развивается в результате заражения через слизистую оболочку глаза. Для
этого клинического варианта характерным является острый специфический
конъюнктивит с сильным слезотечением, выраженной отечностью век до
резкого сужения глазной щели, резко выраженное набухание переходной
складки, слизисто-гнойное отделяемое. На слизистой оболочке, особенно
нижнего века, отмечаются воспалительные образования в виде
желтовато-белых узелков, размером с просяное зерно. Иногда из-за
отечности век больной не в состоянии открыть глаз. Специфические
поражения глаз при туляремии, как правило, односторонние,
сопровождающиеся воспалительной реакцией со стороны предушных и
подчелюстных лимфатических узлов, т.е. формирование лимфаденита.
Заражение происходит при умывании водой из инфицированных
водоисточников или при купании, а также при случайном внесении в глаз
инфекции руками. В связи с этим окулогландулярная (офтальмическая)
форма может проявляться в сочетании с ульцерогландулярной или
гландулярной формами туляремии.
Офтальмическая форма туляремии протекает довольно тяжело, однако,
встречается сравнительно редко - 1-2% случаев. Объяснением этому
служит бактерицидное действие лизоцима слезы, поэтому специфический
туляремийный конъюнктивит может развиваться в результате попадания на
слизистую оболочку глаза большой дозы возбудителя.
Случаи офтальмической формы туляремии регистрируются среди
различных контингентов людей - охотников, промысловиков, жителей того
или иного населенного пункта, пользующихся водой из инфицированного
колодца, ручья или другого водоисточника.
Длительность заболевания, возможные осложнения в виде
дакриоцистита - воспаления слезного мешка до флегмоны включительно и
исход конъюнктивита зависят от своевременного специфического лечения.
В дифференциальной диагностике туляремийный конъюнктивит следует
отличать от конъюнктивита, вызываемого стрептококком, стафилококком и
др. патогенными агентами.
4. Легочная форма туляремии (торакальная). Для этой формы
туляремии характерно развитие первичного воспалительного процесса в
легких, частота пневмоний колеблется от 11 до 30%. Заражение
происходит аспирационным путем при обмолотах, других
сельскохозяйственных работах (перекладка ометов, скирд, стогов,
подвозка кормов, обслуживание животноводческих ферм), когда возможно
вдыхание инфицированной пыли. Такой путь заражения может иметь место
на предприятиях по переработке сельскохозяйственных продуктов в случае
использования сырья, инфицированного выделениями больных грызунов или
попаданием их трупов (мельницы, элеваторы, крахмально-паточные заводы
и т.п.). В редких случаях аспирационное заражение туляремией может
произойти в условиях специализированных лабораторий.
В результате аспирационного заражения патологический процесс
развивается непосредственно в легких и клиническая картина выражается
в пневмонии (очаговой, сегментарной, лобарной, диссеминированной),
бронхопневмонии, бронхите. В отдельных случаях процесс может
ограничиться трахеитом. Наиболее тяжело протекает пневмонический
вариант, который характеризуется резким повышением температуры тела до
39-40 град.С. Лихорадочная реакция может быть в виде двух волн;
характерно наличие одышки, вначале сухой кашель, а затем - с небольшим
количеством слизистой или слизисто-гнойной вязкой мокроты, а в
последующем возможна и примесь крови. Выражена общая интоксикация,
состояние адинамии, профузные поты, особенно в ночные часы. Нередко
больных беспокоят загрудинные боли, связанные с вовлечением в
воспалительный процесс трахеобронхеальных лимфатических узлов.
Физикальные явления скудные и появляются поздно. Перкуторно
определяется притупление звука, аускультативно - наличие разного
калибра сухих и влажных хрипов; вовлекается в процесс плевра. Нередко
наблюдается увеличение печени, селезенки, ослабление сердечной
деятельности. В периферической крови отмечается лейкоцитоз, а в
тяжелых случаях лейкопения, ускорение оседания эритроцитов. Для
легочной и других клинических форм туляремии не характерны такие
катаральные явления, как насморк, герпес.
Туляремийная пневмония не отличается какими-либо патогномоничными
симптомами, на основании которых на ранних этапах можно заподозрить
туляремийную пневмонию, поэтому клинический диагноз нередко связан с
затруднениями в начальный период болезни. Рентгенологически
определяется усиление легочного рисунка за счет периваскулярных и
перибронхиальных инфильтратов. При туляремийной пневмонии кроме того
отмечается усиление теней в области бифуркации бронхов в результате
вовлечения в патологический процесс трахеобронхиальных лимфатических
узлов. Обнаруживается увеличение прикорневых паратрахиальных и
медиастинальных лимфатических узлов в первом и втором косых
положениях, но не ранее 7 дня болезни. Заболевание продолжается 4-6
недель и более в зависимости от тяжести и сроков начала специфического
лечения. Болезнь протекает тяжело и длительно (до 2-х месяцев и
более), с наклонностью к рецидивам и развитию специфических осложнений
(абсцессы, бронхоэктазы, плевриты и др.). Некротизация в пораженных
участках легкого может привести к образованию полостей различной
величины (туляремийные каверны). Период реконвалесценции обычно
продолжительный с медленным восстановлением сил больного и
трудоспособности, особенно у людей пожилого возраста. Туляремийные
бронхиты или трахеиты, без развития пневмонии, протекают со средней
степенью тяжести или легко.
От первичной легочной формы туляремии следует отличать вторичную,
которая может присоединиться как осложнение к любой другой клинической
форме. Вторичная пневмония развивается в более поздние сроки болезни,
сопровождается ухудшением состояния больного.
Клинические проявления, длительность болезни, развитие осложнений
при туляремии зависят от клинической формы, сроков начала лечения,
возраста больного, наличия других сопутствующих заболеваний, в том
числе хронических. Как правило, туляремия заканчивается
выздоровлением, летальность не превышает десятых долей процента (в
прошлом до 5%).
5. Желудочно-кишечная форма туляремии (абдоминальная). Так же как
при ангинозно-гландулярной, абдоминальная форма является результатом
алиментарного (орального) заражения, т.е. при употреблении продуктов,
инфицированных выделениями больных грызунов, недостаточно термически
обработанного мяса, чаще инфицированного зайца, реже - при
употреблении воды из инфицированных источников. В сравнении с другими
клиническими вариантами абдоминальная форма туляремии встречается
сравнительно редко и недостаточно изучена. Возможно поэтому она не
всегда правильно диагностируется. Развитие абдоминальной туляремии
происходит лишь при массивной дозе заражения, так как желудочный сок с
нормальным или повышенным содержанием соляной кислоты, является мощным
фактором неспецифической защиты на пути продвижения возбудителя по
желудочно-кишечному тракту. В отдельных случаях нельзя исключить
возможность заражения людей с низким содержанием соляной кислоты в
желудочном соке. В числе симптомов для этой клинической формы
характерны высокая температура тела, боли в животе разной
интенсивности и продолжительности - ноющие, схваткообразные, боли
разлитые по всему животу или сосредоточенные в определенной области,
имитирующие картину острого живота. Язык обложен суховатым серо-белым
налетом: характерны тошнота, рвота, метеоризм, проявление общей
интоксикации, вовлечение в процессе мезентериальных (регионарных)
лимфатических узлов и лимфатических образований в стенке тонкого
кишечника. Может иметь место увеличение печени и селезенки. Со стороны
желудочно-кишечного тракта чаще наблюдается задержка стула, но
возможен и жидкий стул, причем с самого начала заболевания. Описаны
случаи обнаружения язв в слизистой подвздошной и толстой кишки, а
также пилорической части желудка и 12-перстной кишки.
В сравнении с другими клиническими вариантами абдоминальная форма
туляремии протекает более тяжело и весьма сходна клинической
симптоматикой брюшного тифа, что в свое время послужило основанием
называть ее тифоидной. В отдельных случаях у больных с тонкой брюшной
стенкой и слабо выраженных жировым слоем удается прощупать увеличенные
и плотные мезентериальные лимфатические узлы или их конгломераты.
Лимфадениты указанной локализация могут вызывать раздражение брюшины и
быть причиной болей в животе. Наиболее тяжелым осложнением является
нагноение и самопроизвольное вскрытие мезентериальных лимфатических
узлов (с развитием перитонита).
С учетом клинических проявлений и их динамики, для
дифференциальной диагностики решающее значение должны иметь данные
эпидемиологического анализа и лабораторные исследования. Следует иметь
в виду, что в тяжелых случаях появление специфических антител может
быть отмечено только через 3-4 недели от начала заболевания.
6. Генерализованная форма туляремии (тифоидная, септическая)
характеризуется тяжелым течением, развитием общих симптомов болезни,
без предшествующих локальных изменений. Выражен токсикоз, иногда
отмечается потеря сознания, бред, адинамия. Наблюдаются сильные
головные и мышечные боли, анорексия.
Лихорадка волнообразная, продолжительностью до 3-х недель и
более. На коже отмечаются высыпания, поражаются сосуды. Сыпь
появляется обычно во второй половине заболевания. Нередко возникают
симметричные высыпания на нижних и верхних конечностях, у некоторых
больных на лице, шее, груди. Сыпь розово-красного цвета, постепенно
становится багрово-медной и в последующем приобретает лиловые оттенки.
Описаны "перчатки", "гетры", "носки", "воротник", "маска" - места
сгущения сыпи. Держится сыпь 8-12 дней, сыпь разрешается шелушением,
напоминающим скарлатину или псевдотуберкулез.
Высыпание нередко сопровождается припухлостью суставов (кисти,
стопы), болезненностью, отечностью пальцев, что затрудняет движения.
Печень и селезенка увеличены. Выздоровление наступает медленно,
возможны рецидивы болезни, в том числе и через несколько лет. Эту
форму наблюдали в случае внутрилабораторного заражения.
7. Ангинозно-гландулярная форма туляремии (ангинозно-бубонная) в
этом случае заражение происходит через рот при употреблении продуктов,
инфицированных больными грызунами, их выделениями на складах, в
амбарах, кладовых, других хранилищах, при употреблении воды из
инфицированных водоисточников при попадании в них больных грызунов или
их трупов. Ангинозно-гландулярная форма развивается также при
употреблении недостаточно термически обработанного мяса, чаще зайца.
Последнее наблюдается, как правило, в семьях охотников. Случаи
ангинозно-гландулярной формы наблюдаются при пищевых или водных
вспышках. Входными воротами инфекции служит слизистая оболочка
миндалин, хотя при заражении через рот практически внедрение микроба
может произойти на любом участке слизистой желудочно-кишечного тракта.
Для этого клинического варианта характерно наличие специфической
ангины, а именно: гиперемия и отечность миндалин с синюшным оттенком,
серовато-белые налеты, сливающиеся или в виде островков, возможны
изъязвления. Туляремийные ангины чаще могут быть односторонними.
Нередко отмечается отечность и гиперемия дужек и мягкого неба, язык
обложен серовато-белым налетом. При глотании ощущается болезненность,
но не столь выраженная в сравнении с изменениями миндалин
язвенно-деструктивного характера. В ряде случаев патологический
процесс на слизистой глотки может ограничиться явлениями катаральной
ангины. Одновременно с развитием ангины наблюдается увеличение,
нередко до размеров куриного яйца и больше, подчелюстных,
переднешейных, а иногда и надключичных лимфатических узлов. В области
лимфаденита кожа обычно мало изменена или не изменена, при пальпации
ощущается болезненность, уплотнение, ограничение подвижности
лимфатических узлов. Иногда такого совпадения во времени - образования
лимфаденита с развитием процесса на миндалинах не наблюдается, и
формирование лимфаденита происходит значительно позже. В случае
заражения массивной дозой возбудителя не исключено сочетание
ангинозно-гландулярной и абдоминальной форм туляремии, особенно у
людей с пониженным содержанием кислотности желудочного сока.
Продолжительность туляремийной ангины колеблется от 8 до 24 дней.
При диагностике ангинозно-гландулярной формы туляремии, при
которой процесс, как правило, односторонний, наиболее важно
дифференцировать с дифтерией. Однако необходимо иметь в виду и
определенное сходство между туляремийной ангиной и дифтерией. Здесь,
как и в других случаях, необходимо ориентироваться на
эпидемиологические и лабораторные данные.
Диагноз туляремии основывается на данных клинического,
эпидемиологического и лабораторного анализов. Весьма важное значение
принадлежит эпидемиологическому анамнезу, который должен быть
детальным и исчерпывающим. Особое внимание должно быть уделено
выяснению наличия вакцинации против туляремии в прошлом и ее сроков,
данным о переболевании этой инфекцией ранее, выяснение
профессиональной занятости и ряду других факторов, которые необходимы
для того, чтобы в каждом отдельном случае подтвердить или исключить
диагноз туляремии. Последнее необходимо для определений тактики
лечения, а также проведения профилактических мероприятий. В случаях
туляремии с наружно выраженными клиническими проявлениями:
ульцерогландулярная, гландулярная, офтальмическая,
тонзиллогландулярная формы и учетом эпидемиологических данных, диагноз
туляремии не должен вызывать затруднений. Что касается легочной
иабдоминальной форм туляремии, то здесь существенная роль принадлежит
анамнестическим данным и результатам лабораторного анализа.
В ряде случаев при позднем начале лечения заболевание принимает
затяжной характер, а в последующем возможны рецидивы. Рецидив может
наступить через короткие сроки после перенесенного заболевания (4-6
месяцев), а также через 2-6 лет спустя и более. Чаще всего рецидив
проявляется в виде воспаления лимфатических узлов на месте
первоначального регионарного лимфаденита. Воспаление лимфатических
узлов при рецидивах развивается постепенно без повышения температуры
тела и особого расстройства в общем состояния больного. Несколько
позже присоединяется субфебрилитет, слабость, возможны потливость,
нарушение сна. Лимфоузлы обычно не достигают таких размеров, как при
первичномзаболевании, болезненность их не выражена. Исход лимфаденита
при рецидивах может быть таким же, как и при первичном заболевании,
однако, нагноение происходит значительно реже.
Патогенез туляремийных рецидивов мало изучен, но можно
предполагать, что развитие их обусловлено длительной персистенцией
возбудителя в организме. В каждом конкретном случае диагноза "рецидив
туляремии" необходимо установить связь с ранее перенесенным
заболеванием и исключить возможность повторного заражения, проследить
за наличием антител в крови и нарастанием их титра. Имеются также
немногочисленные данные, указывающие на возможность хронического
течения туляремии, но этот вопрос нуждается в уточнении.
Дифференциальная диагностика туляремии.
Спорадическая заболеваемость туляремией, полиморфизм клиники
вызывают определенные трудности постановки диагноза. Особенно это
затруднительно в начальном периоде болезни. Именно в этот период
туляремию часто смешивают с гриппом, брюшным или сыпным тифом,
пневмонией и др. В последующем следует дифференцировать ее от
сибирской язвы, язвенно-некротической ангины, листериоза, гнойных
лимфаденитов и лимфангоитов, паротита, бубонной формы чумы,
бруцеллеза, доброкачественного лимфоретикулеза и содоку.
Гландулярную форму туляремии следует отличать от таковой при
чуме. При чуме более выражен токсикоз, состояние больного значительно
тяжелее. Туляремийный лимфаденит отличается выраженными контурами,
меньшей болезненностью по сравнению с чумными бубонами, относительно
умеренным периаденитом, отсутствием грозных осложнений и благоприятным
исходом. Язвы при туляремии также менее болезненны, чем при чуме.
Туляремийная пневмония отличается отсутствием кровавой мокроты (за
редким исключением). Больные при туляремии не контагиозны.
Гнойные банальные лимфадениты (стафилококковые и стрептококковые)
характеризуются резкой болезненностью, ранним нагноением по сравнению
с туляремией, развитием периаденита и лимфангоита. При туберкулезных
лимфаденитах начало болезни постепенное с субфебрильной температурой,
лимфоузлы плотные, болезненность их отсутствует и как правило не
достигают размеров как при туляремии. Туляремийные лимфадениты в
отличие от лимфаденопатии, наблюдаемой при бруцеллезе, отличаются
строгой привязанностью к входным воротам инфекции. Помогают
диагностике лабораторные исследования.
В отличие от дифтерии ангина при туляремии характеризуется более
острым началом, чаще односторонней локализацией и редкостью
распространения налетов за пределами миндалин. Однако может быть много
сходных черт, поэтому решающее слово остается за результатами
лабораторных исследований и аллергической пробой. Туляремийные
высыпания чаще симметричны и более полиморфны в отличие от брюшного
или сыпного тифа.
При паротите шейные лимфатические узлы увеличены незначительно.
Отмечается резкая болезненность при надавливании на козелок уха,
имеется выраженная отечность той или другой половины лица.
Поскольку туляремия является острым лихорадочным заболеванием может
возникнуть необходимость проведения дифференциального диагноза с
такими болезнями, как малярия, лихорадка Ку, сепсис, сифилис,
туберкулез, паротит и др. Всегда необходимо помнить, что трудность
распознавания туляремии по клиническим признакам обусловливает
необходимость комплексной диагностики с учетом данных
эпидемиологического анализа, клинических наблюдений и лабораторного
исследования.
Лечение.
Больные туляремией, как правило, подлежат госпитализации. Лечение
туляремии включает как неспецифическую, так и специфическую терапию.
Успех лечения в значительной мере зависит от специфической терапии и
сроков ее начала. Лечение должно быть сугубо индивидуальным,
патогенетически обоснованным, этиотропным и комплексным, включая и
симптоматическую терапию. В каждом отдельном случае необходимо
учитывать особенности той или иной клинической формы, фазы, тяжести
заболевания, возраста больного, наличие сопутсвующих заболеваний и др.
В настоящее время имеется ряд антибиотиков, весьма эффективных для
лечения туляремии, в частности, препаратов группы аминогликозидов.
Так, в тяжелых и средней тяжести случаях применяют гентамицин или
амикацин (полусинтетическое производное канамицина) при парентеральном
введении. Тот и другой препарат имеют широкий спектр действия,
обладают выраженными бактерицидными свойствами. Оба препарата быстро
проникают в ткани и жидкости организма. При внутримышечном введении
как гентамицин, так и амикацин сульфат, применяют в виде готового
раствора в ампулах: гентамицин 1 мл - 20 или 40 мг препарата, а
амикацин в 1 мл - 40 или 50 мг. Указанные дозы могут быть увеличены в
зависимости от тяжести заболевания и локализации процесса. Последние
определяют и длительность курса лечения (7-10 дней). Оба препарата
обладают ото- и нефротоксичностью, частота которой зависит от
применения и длительности курса лечения и выделительной функции почек.
При нарушении функции почек следует применять антибиотики в меньших
дозах и с большим интервалом между повторными введениями.
Одновременное применение гентамицина (или амикацина) с другими
препаратами, обладающими ото- и нефротоксическим действием не
допускается. Противопоказанием к применению гентамицина и амикацина
является аллергия к препаратам, заболевания слухового и вестибулярного
аппарата, не следует назначать эти препараты беременным, если это не
обусловлено жизненными показаниями. Из возможных побочных явлений,
связанных с приемом гентамицина или амикацина, отмечается тошнота,
альбинурия, повышение печеночной трансаминазы.
При ульцерогландулярной, гландулярной или ангинозно-гландулярной
формах туляремии, протекающих легко или средней тяжести, показано
пероральное применение антибиотиков группы тетрациклинов. Наиболее
эффективным из них является доксициклин, обладающий пролонгированным
действием. Доксициклин назначают по 200 мг в сутки для взрослых (по
100 мг каждые 12 часов) в первый день и в последующие дни по 100 мг в
сутки. В терапевтических дозах препарат действует бактериостатически.
Доксициклин при приеме внутрь всасывается более полно и быстро в
сравнении с другими препаратами труппы тетрациклинов. Доксициклин
выводится из организма медленно, терапевтическая концентрация
поддерживается в крови и тканях 24 часа после однократного приема.
Применение доксициклина не допускается одновременно с другими
препаратами тетрациклиновой группы, а также при беременности, детям
моложе 8 лет, при нарушении функции почек, печени, выраженной
лейкопении.
Для лечения туляремии при приеме внутрь также эффективен
полусинтетический препарат широкого спектра действия - рифампицин -
один из представителей антибиотиков группы рифамицинов. Разовая доза
этого препарата составляет 0,3 г, средняя суточная доза - 0,9 г,
применяемая в три приема. Препарат выпускают в капсулах, содержащих
150-300 мг. Детям старше 8 лет рифампицин назначают из расчета 8-10
мг/кг массы тела в сутки. Препарат хорошо переносится больными,
побочные явления наблюдаются редко. Последние выражаются в снижении
аппетита, тошноте, дисфункции кишечника, возможны кожные высыпания.
Рифампицин хорошо всасывается и при приеме внутрь длительно
поддерживается его концентрация в крови. Применение рифампицина
противопоказано при повышенной чувствительности к препарату, при
беременности, при заболевании почек, сопровождающемся снижением их
выделительной функции. Следует иметь ввиду, что применение рифампицина
довольно быстро приводит к развитию устойчивости возбудителя к
препарату. Для профилактики возможных осложнений, связанных с приемом
антибиотиков, одновременно назначается нистатин обладающий
противогрибковым действием.
Если специфическое лечение начато в ранней стадии заболевания (в
первые три дня), может иметь место задержка образования специфических
антител. В тяжело протекающих случаях (легочная, абдоминальная формы
туляремии, возможно более позднее обнаружение специфических антител
(третья неделя).
Наряду со специфическим лечением при необходимости следует
применять симптоматическую терапию, в частности, сердечные средства и
др. Может быть назначено применение аскорбиновой кислоты в дозе 0,5 г
2-3 раза в день, питье в виде соков, чая с молоком, чая с лимоном.
На область лимфаденита рекомендуется применить УВЧ, умеренное
сухое тепло, а при нагноении лимфоузла с отчетливой флюктуацией должно
быть произведено хирургическое вскрытие, после которого заживление
наступает значительно быстрее в сравнении с самопроизвольным вскрытием
лимфоузла.
Улучшение состояния больного, снижение температуры тела,
уменьшение размеров лимфоузлов наступает, как правило, в первые дни
специфического лечения, особенно, если оно начато в ранние сроки от
начала заболевания.
В период реконвалесценции при вполне удовлетворительном состоянии
больного при клинических формах с наружно выраженными проявлениями,
если размеры регионарных лимфатических узлов не превышают размеров
боба или косточки сливы, подвижных и безболезненных, больной может
быть выписан из стационара. Для решения вопроса о выписке больного,
перенесшего окулогландулярную форму туляремии, рекомендуется
консультация окулиста. При выписке больного, перенесшего легочную
форму туляремии, рекомендуется контрольная рентгеноскопия или
рентгенография грудной клетки.
Значение лабораторных исследований при диагностике туляремии
Диагноз туляремии устанавливается на основании сопоставления
результатов аллергического и серологического исследований. Для
серологической диагностики применяют обычно реакцию агглютинации (РА)
или реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА). Другие серологические
методы, например ИФА, применяют в сомнительных случаях и для
подтверждения достоверности результатов, достигнутых другими методами
(РА и РПГА). Выделение возбудителя от больного, как было указано выше,
не всегда эффективно и доступно только специально оснащенным
лабораториям, имеющим разрешение на работу с возбудителем туляремии (П
группа патогенности микроорганизмов). Кожная туляриновая проба может
служить методом ранней диагностики туляремии, так становится
положительной уже с 3-5 суток болезни. Однако в случаях, когда имеются
противопоказания к применению накожного тулярина (повышенная
сенсибилизация) прибегают к методу аллергодиагностики ин витро -
реакции лейкоцитолиза. Вместе с тем, следует иметь ввиду, что методы
аллергодиагностики не позволяют дифференцировать свежие случаи
заболевания от анамнестических реакций, так как специфическая
клеточная реактивность у переболевших и привитых сохраняется многие
годы.
В этой связи нецелесообразно основывать диагностику туляремии
только на результатах аллергических методов, а использовать и
различные серологические методы диагностики. Выявление антител к
туляремийному микробу при первом обследовании больного в титрах
1:50-1:100 при отсутствии нарастания титра сыворотки при последующем
исследовании также не дает основания для диагноза свежего случая
туляремии. Поэтому кровь больного исследуют по крайней мере дважды:
первый раз немедленно после обращения больного за медицинской помощью
и второй раз - спустя неделю после первого исследования. Если при
повторном обследовании антитела не обнаружены или титр сыворотки
остался без изменений, то кровь больного нужно исследовать третий раз,
спустя неделю после второго обследования. Нарастание титра антител в
РА и РПГА подтверждает диагноз туляремии, а его отсутствие указывает
на анамнестический характер реакции.
Следует также учитывать, что раннее начало лечения больного
антибиотиками (на 1-ой неделе болезни) приводит к снижению титра
антител. У лиц, вакцинированных против туляремии, или ранее перенесших
это заболевание, основанием для диагностики свежего случая туляремии
может служить лишь выраженное (в 2-4 и более раза) нарастание титров
антител в сыворотке, а также наличие характерных клинических
проявлений заболевания.
Окончательный диагноз туляремии обеспечивается сопоставлением
результатов серо-аллергического обследования больного с
клинико-эпидемиологическими данными.
Руководитель Департамента организации
медицинской помощи населению
А.А. Карпеев
Начальник Управления охраны
здоровья матери и ребенка
Д.И. Зелинская
Приложение 4
к приказу Минздрава РФ
от 14 апреля 1999 года
N 125
Лабораторная диагностика туляремии
(Методические указания)
1. Аллергические методы
2. Серологические методы
3. Бактериологические методы
Лабораторная диагностика туляремии у людей основывается, главным
образом, на иммунологических методах (серо-аллергическая диагностика)
и в меньшей степени на бактериологических методах. В методические
указания включены методы лабораторной диагностики, позволяющие быстро
и надежно выявлять это заболевание у человека и обеспеченные
диагностическими препаратами, а также некоторые перспективные методы и
приемы, находящиеся на стадии внедрения в практику.
1. Аллергические методы
В патогенезе туляремийной инфекции значительную роль играет
развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), выявление
которой может служить методом аллергической диагностики туляремии.
Метод основан на особенностях организма человека, заболевшего или
переболевшего туляремией, отвечать местной аллергической реакцией, в
виде гиперемии и инфильтрата, на введение туляремийного антигена
(тулярина). У больных туляремией людей кожная аллергическая реакция
становится положительной обычно с 3-5-х суток болезни, реже - в более
поздние сроки, и сохраняется многие годы, благодаря чему аллергический
метод служит для ранней или ретроспективной диагностики, являясь при
этом строго специфичным. У привитых живой вакциной также возникает
аллергическая реактивность, но она развивается медленнее (через 10-15
дней после вакцинации). Аллергический ответ у вакцинированных
сохраняется 5-6 лет, иногда дольше, и может служить методом
определения сохранности поствакцинального иммунитета. Кожную
аллергическую реакцию выполняют как накожно так и внутрикожно с
соответствующим тулярином. Следует помнить, что аллергическая реакция
на введение антигена - это общая реакция организма, которая при
развившемся инфекционном процессе может вызвать ухудшение состояния
больного, а местная реакция иногда сопровождается некрозом. Поэтому в
качестве диагностического приема у больных людей проба с тулярином
должна применяться с осторожностью.
1.1. Внутрикожная проба с тулярином. Для внутрикожной пробы
применяют внутрикожный тулярин - взвесь туляремийных бактерий
вакцинного штамма убитых нагреванием при 70 град.С в течение 1 часа.
Взвесь готовят на физиологическом растворе, содержащем 3% глицерина. В
1 мл препарата содержится 500 млн. убитых бактерий. Выпускают препарат
в запаянных ампулах, содержащих 1 мл препарата (или 10 человеко-доз).
Препарат предназначен в первую очередь для диагностики туляремии.
Техника постановки реакции. Тулярин в количестве 0,1 мл вводят
стерильным шприцем строго внутрь кожи левого предплечья (на границе
верхней и средней трети). Кожу предварительно обрабатывают спиртом и
эфиром. На месте введения препарата образуется беловатый пузырек
диаметром 3-4 мм, который примерно через 30 минут рассасывается.
Учет и оценка реакции. Учет реакции производят через 24-48 часов
путем осмотра и ощупывания участка кожи, куда был введен тулярин. При
положительной реакции на месте введения тулярина уже через 6-10 час
обнаруживаются покраснение (гиперемия) и отек (инфильтрат). Через 24
часа реакция кожи выражена вполне отчетливо и имеет вид
гиперемированного, нередко болезненного инфильтрата. Реакцию считают
положительной при наличии инфильтрата и гиперемии диаметром не менее
0,5 см. Интенсивность реакции определяют по величине реагирующего
участка (отека и гиперемии) кожи, который измеряют в сантиметрах в
двух взаимно перпендикулярных направлениях. Изменения кожи в виде
гиперемин без инфильтрата, исчезающие через 48 часов, расценивают как
отрицательный результат. В сомнительных и подозрительных случаях
возможна повторная постановка реакции, так как отрицательный результат
мог быть обусловлен ранмм сроком от начала заболевания. Так,
аллергическая реакция может запаздывать при тяжелых формах инфекции.
Запаздывание реакции может также иметь место при раннем применении
антибиотиков для лечения больного. В ряде случаев аллергическая
реакция сопровождается образованием пустулы или кратковременным
лимфангоитом с незначительным увеличением регионарных лимфатических
узлов и повышением температуры тела на 1-1,5 град.С в течение 1-2
дней. Известны редкие случаи образования некроза на месте инъекции
тулярина. В этой связи для диагностики туляремии предпочтительнее
использовать аллергические методы in vitro или серологические методы.
1.2. Накожная проба с тулярином. Для накожной пробы применяют
накожный тулярин - взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма,
убитых нагреванием при 70 град.С в течение 1 часа. Взвесь готовят в
физиологическом растворе, содержащем 3% глицерина. В 1 мл препарата
содержится 10 млрд. убитых бактерий. Выпускают препарат в запаянных
ампулах, содержащих 1 мл, что составляет 20 человеко-доз. Препарат
предназначен в первую очередь для определения иммунитета у привитых
против туляремии или для анамнестического обследования.
Техника постановки реакции. Перед употреблением ампулу с накожным
тулярином встряхивают до образования равномерной взвеси. Одну каплю
тулярина глазной пипеткой наносят на обработанную спиртом и эфиром
кожу наружной поверхности левого плеча в его средней трети. Через
каплю стерильным скарификатором делают две параллельные насечки длиной
8-10 мм, соблюдая расстояние между насечками 5 мм, до появления
росинок крови. Затем тулярин тщательно втирают в насечки плоской
стороной скарификатора в течение 1 мин. Тулярин применяют немедленно
после вскрытия ампулы.
Учет и оценка реакции. Учет реакции производят через 48-72 часа.
Положительная реакция выражается отечностью кожи вокруг насечек и
краснотой, которые иногда появляются уже через 24 часа после введения
тулярина, через 48-72 часа реакция ярко выражена и далее постепенно
угасает, полностью исчезая к 7-10 дню. Диаметр реагирующего участка
достигает 1-2 см. В редких случаях по ходу насечек появляются
везикулы, исчезающие через 2-3 дня. Реакцию считают положительной при
величине реагирующего участка кожи не менее 0,5 см и наличии вдоль
насечек ясного покраснения и небольшой отечности (валик). При
правильной технике постановки накожная туляриновая проба по
чувствительности не уступает внутрикожной, но в отличие от последней
не сопровождается повышенными местными или общими реакциями.
Категорически запрещается накожный тулярин вводить внутрикожно или
подкожно, так как он может вызвать бурную местную и общую реакции.
1.3. Реакция лейкоцитолиза (РЛ). Аллергические методы диагностики
in vivo (накожная и внутрикожная туляриновые пробы) просты в
исполнении и до настоящего времени используются на практике. Вместе с
тем, введение даже убитого антигенного препарата небезразлично для
организма обследуемого. В этой связи заслуживает внимания эффективный
метод выявления и оценки гиперчувствительности методом in vitro с
помощью альтерации лейкоцитов - реакции лейкоцитолиза (Суханов с
соавторами). РЛ основана на учете разрушения лейкоцитов
сенсибилизированного организма под влиянием специфического аллергена
(антигена), регистрируемого методом in vitro. Реакция лизиса
лейкоцитов становится положительной уже в первые дни после вакцинации
или заболевания (3-4 день), удерживается в течение многих лет (у
переболевших - до 40 лет). На 7-15 день после вакцинации показатели
лизиса лейкоцитов составляют в среднем 49-50%, затем постепенно
снижаются, но даже через 1-5 лет после вакцинации оставались на
достаточно высоком уровне (30-31%). РЛ обладает строгой
специфичностью, дает возможность количественного учета степени
сенсибилизации организма, позволяет получить ответ через несколько
часов после взятия крови осуществляется in vitro, т.е. без введения в
организм специфического аллергена.
Техника постановки РЛ. В 2 лунки полистироловой пластины вносят
по 50 мкл 10% раствора цитрата натрия, затем в первую (опытную) лунку
добавляют 50 мкл антигена (накожного тулярина, содержащего 1х10(10)
бактерий в 1 мл), а во вторую (контрольную) - 50 мкл физиологического
раствора. Таким образом, в обеих лунках конечная концентрация цитрата
натрия составляет 5%. Кровь для исследования берут из пальца руки и в
количестве 100 мкл вносят в каждую из двух лунок. Пластинку закрывают
и помещают на 2 часа в термостат при температуре 37 град.С. Кровь в
лунках тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Затем по 20 мкл
крови из обеих лунок поочередно забирают с помощью микропипеточного
дозатора и переносят в соответствующие лунки планшета для
макроагглютинации содержащие 0,4 мл 3%-ной уксусной кислоты,
подкрашенной до светло-голубого цвета с помощью метиленовой синьки.
Учет и оценка РЛ. Количество лейкоцитов подсчитывают в крови из
обеих лунок в камере Горяева. Разрушенные клетки, а также клетки,
собирающиеся в кучки, не учитывают. Коэффициент лейкоцитолиза
вычисляют по формуле:
Мк-Мо
К% = ---------- х 100
Мк
где Мо - количество лейкоцитов в опыте (первая лунка);
Мк - количество лейкоцитов в контроле (вторая лунка).
Для оценки результатов используют следующую шкалу показателей
К=15% - отрицательный или сомнительный результат;
К=16-20% - слабо положительный результат;
К=21-30% - положительный результат;
К=31% и выше - резко положительный результат.
2. Серологические методы
2.1. Реакция агглютинации. Наиболее распространенным и вместе с
тем вполне точным методом серологической диагностики туляремии
является реакция агглютинации (РА). Реакция служит для установления
диагноза у больного или переболевшего (ретроспективный диагноз) и
может быть использована при изучении иммунологического состояния
привитых против туляремии. Обнаружение агглютининов у больного
туляремией обычно отмечается через 10-15 дней, при этом
агглютинационный титр сыворотки в этот период составляет 1:50-1:100,
не далее быстро нарастает и на 4-6 неделе болезни достигает
1:400-1:800, реже 1:1600 и выше. По достижении максимальных
показателей агглютинационный титр сыворотки затем медленно снижается и
через 6-12 месяцев составляет 1:100-1:400, позднее падает до 1:10-1:50
и на этом уровне может удерживаться в течение многих лет. Длительность
сохранения агглютининов делает возможным использование РА для
ретроспективного диагноза. У привитых против туляремии агглютинины
обнаруживаются через 2-3 недели, достигают через 4-6 недель
максимальных титров 1:160-1:320, реже выше, затем снижаются до
1.10-1:40 и обычно выявляются в течение 5-7 лет после вакцинации
(иногда дольше).
Кровь для исследования у больного (или вакцинированного) берут из
локтевой вены в количестве 3-5 мл (для макроагглютинации) или из
пальца руки (для микроагглютинации). Реакцию ставят с сывороткой,
которая должна быть прозрачной.
2.1.1. Реакция макроагглютинации (РА). Антигеном для постановки
РА служит туляремийный диагностикум, представляющий собой убитую
формалином взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма. В 1 мл
препарата содержится 25 млрд. туляремийных бактерий. Для постановки РА
туляремийный диагностикум предварительно разводят физиологическим
раствором (рН=7,0-7,2) в 5 раз до концентрации 5 млрд. туляремийных
бактерий в 1 мл.
Техника постановки РА. В каждую пробирку разливают по 0,5 мл
сыворотки, разведенной физиологическим раствором рН 7,0-7,2, до
1:12,5; 1:25; 1:50; 1:100; 1:200; 1:400. Во все пробирки доливают по
0,5 мл взвеси диагностикума в концентрации 5 млрд. туляремийных
бактерий в 1 мл. Таким образом, получают соответствующий ряд
фактических разведений сыворотки 1:25; 1:50: 1:100, 1:200, 1:400;
1:800; с содержанием в каждой пробирке в 2,5 млрд. туляремийных
бактерий. В контрольной пробирке содержится 0,5 мл антигена и 0,5 мл
физиологического раствора (контроль антигена). Для контроля сыворотки
используют исходное разведение в объеме 1 мл без добавления антигена.
После добавления антигена в опытные пробирки штатив встряхивают и
помещают в термостат (37 град.С) на 2 часа. Реакцию оставляют затем
при комнатной температуре до следующего дня.
Учет и оценка РА. Учет результатов РА производят через 18-24 часа
невооруженным глазом. Оценку реакции осуществляют на основании степени
прозрачности надосадочной жидкости в пробирках, количества и характера
осадке микробной массы (агглютината):
1) Резко положительная реакция - полное просветление жидкость с
осадком микробов в виде "зонтика"; при встряхивании пробирки осадок
разбивается на крупные хлопья; обозначается 4-мя плюсами (++++);
2) положительная реакция - значительное просветление жидкости с
осадком, который при легком встряхивании поднимается со дна хлопьями,
обозначается 3-мя плюсами (+++);
3) слабоположительная реакция - видимая невооруженным глазом
агглютинация с незначительным осадком; обозначается 2-мя плюсами (++);
4) сомнительная реакция - видимая невооруженным глазом
агглютинация без образования осадка; обозначается одним плюсом (+);
5) отрицательная реакция - отсутствие агглютинации и просветления
жидкости; обозначается минусом (-).
Агглютинационный титр сыворотки учитывают по последнему
разведению которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов).
При учете результатов реакции следует иметь в виду возможность
задержки агглютинации (проагглютинационная зона) в небольших
разведениях сыворотки.
При серологической диагностике туляремии у человека
диагностическим считается титр 1:100 и выше, однако, обязательно
должно быть прослежено его нарастание. При отрицательной или
сомнительной реакции, а также при положительной реакции в низких
разведениях сыворотки у подозрительных на туляремию больных
рекомендуют повторить исследование сыворотки через 7-10 дней.
Нарастание титра сыворотки в 2-4 и выше раза свидетельствует о свежем
случае туляремии и подтверждении диагноза.
2.1.2. Реакция микроагглютинации (РМА). Реакцию агглютинации
можно ставить в микрообъемах, используя для этого сыворотку или плазму
крови, взятую из пальца руки. Диагностикум для реакции
микроагглютинации готовят из убитой культуры вакцинного штамма
туляремийного микроба, которую окрашивают гематоксилином (модификация
Брикмана и Мериновой). Для этого взвесь культуры в концентрации 1 х
10(11) м.кл./мл смешивают в равных объемах с 1%-ным раствором
формалина. После 2-х часовой экспозиции клетки дважды отмывают от
формалина физиологическим раствором. Осадок разводят до концентрации
5.10(9) м.кл./мл и смешивают с равным объемом гематоксилина,
приготовленного по методу Караччи: 0,1 г гематоксилина растворяют в
100 мл дистиллированной воды, добавляют 25 мл глицерина, 5,0 г
калийных квасцов и 2-3 кристалла иодноватистого калия; раствор имеет
вишневую окраску. Окрашивание производят в водяной бане в течение
20-24 часов при 56 град.С и периодическом встряхивании культуры. Затем
бактерии 3-4 раза отмывают физиологическим раствором, центрифугируют
при 6000 об./мин в течение 30 мин. до получения бесцветной и
прозрачной надосадочной жидкости. Осадок окрашенных бактерий разводят
физиологическим раствором до оптимальной концентрации (обычно 2-5.
10(9) м.кл./мл). Для определения оптимальной концентрации
диагностикума несколько его разведений испытывают в реакции
микроагглютинации с диагностической туляремийной сывороткой.
Диагностикум сохраняют при температуре 4 град.С, предварительно
добавив в него формалин до конечной концентрации 0,1%. Срок сохранения
активности диагностикума не менее 2-х лет.
Техника постановки и учет РМА. Реакцию микроагглютинации ставят в
полистироловых пластинах микротитратора Такачи. Для этого в ряд лунок
полистироловой пластины микротитратора Такачи вносят 50 мкл
физиологического раствора (рН=7,0-7,2). Затем с помощью титратора с
головкой объемом 50 мкл раститровывают исследуемую сыворотку,
предварительно разведенную 1:5 (или неразведенную плазму крови) и
добавляют в каждую лунку равный объем (50 мкл) цветного, окрашенного
гематоксилином диагностикума. При этом происходит разведение сыворотки
в 4 раза (с 1:5 до 1:20) и получают следующий ряд разведений сыворотки
1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и т.д. Пластины тщательно встряхивают и
помещают на 2 часа в термостат при температуре 37 град.С, затем
выдерживают 12-18 часов при комнатной температуре. В лунках с
положительным результатом антиген выпадает на дно в виде зонтика"
(агглютинат), а в случае отрицательного результата в виде "пуговки".
Титры реакции микроагглютинации, как правило, совпадают или на одно
разведение ниже титров РА, выполненной макрометодом.
2.2. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Реакция пассивной
гемагглютинации является чувствительным методом серологической
диагностики и используется как для ранней, так и ретроспективной
диагностики, а также для определения иммунопогического состояния
привитых. У больных туляремией aнтитела обычно обнаруживаются в конце
1-ой или на 2-ой неделе заболевания, через 1-1,5 месяца титры РПГА
достигают максимальных показателей (1:100000- 1:20000, реже выше),
после чего снижаются и на уровне 1:100-1:200 сохраняются длительное
время.
У привитых антитела также обнаруживаются постоянно, однако, в
более низких титрах, не превышающих 1:2000-1:5000 через 1-1,5 месяца
после вакцинации, сохраняются в течение нескольких лет на низком
уровне 1:20-1:80.
Антигеном для постановки РПГА служит туляремийный эритроцитарный
диагностикум (антигенный). Препарат представляет собой
формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные
туляремийным антигеном, выпускается в жидком и сухом виде. Жидкий
препарат - 10%-ная взвесь эритроцитов в растворе формалина 10%-ной
концентрации. Сухой лиофилизированный препарат - высушенная в вакууме
10%-ная взвесь эритроцитов без консерванта. Перед употреблением его
разводят в соответствии с указаниями на этикетке. Для постановки
реакции в полистироловых пластинах оба препарата применяют в 2,5%-ной
концентрации, а при постановке реакции в микрообъемах - в 0,5%-ной
концентрации.
Техника постановки РПГА. Испытуемые сыворотки разводят
физиологическим раствором 1:5 (1:10) и прогревают при 56 град.С в
течение 30 минут. После этого в целях удаления гетерогенных антител к
бараньим эритроцитам, сыворотки обрабатывают 50%-ной взвесью
формалинизированных бараньих эритроцитов. Для этого эритроциты
добавляют из расчета 2 капли (по 0,05 мл) на 1 мл сыворотки и
тщательно перемешивают встряхиванием. Сыворотку оставляют до полного
оседания эритроцитов, либо центрифугируют после одночасовой выдержки
при комнатной температуре, после чего она готова к исследованию.
Разводящую жидкость разливают в объеме 0,5 мл в ряд лунок
полистироловой пластины. При предварительном исследовании сывороток их
целесообразно испытывать путем постановки реакции в коротком ряду
пластины (6-лунок). В случае выявления антител в коротком ряду
сыворотки повторно исследуют в длинном ряду разведений (12 лунок).
После разлива разводящей жидкости, в первую лунку каждого ряда
(короткого или длинного) добавляют по 0,5 мл испытуемых сывороток в
разведении 1:5. Затем в тех же объемах сыворотки титруют двукратными
разведениями. Таким образом, получают разведения сыворотки в коротком
ряду с 1:10 до 1:320, а в длинном - с 1:10 до 1:20480. После
титрования сывороток в каждую лунку добавляют по одной капле (0,05 мл)
рабочей 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Содержимое
пластин тщательно встряхивают до получения гомогенной суспензии.
Пластины оставляют при комнатной температуре на неподвижной
поверхности стола. Предварительный учет реакции производят через 2-3
часа, окончательное определение титра производят после полного
оседания эритроцитов в лунках. К реакции предусматривают следующие
контроли: 1) испытуемая сыворотка в разведении 1:10 в объеме 0,5 мл +
1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 2)
разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси
несенсибилизированных эритроцитов; 3) разводящая жидкость в объеме 0,5
мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Все
контроли должны дать четко отрицательную реакцию.
Учет и оценка РПГА. Оценку реакции производят по следующей схеме:
1) резко положительная реакция (++++) - эритроциты выпадают на дно
лунки равномерным слоем в виде "зонтика", у которого нередко
наблюдается фестончатое оплывание краев; 2) положительная реакция
(+++) - эритроциты устилают не менее 2/3 дна лунки; 3)
слабоположительная реакция (++) - агглютинат небольшой и расположен в
самом центре лунки; 4) сомнительная реакция (+) - вокруг осадка
эритроцитов в самом центре лунки имеются отдельные зерна агглютината;
5) отрицательная (-) - на дне лунки эритроциты оседают в виде
"пуговки" или маленького колечка с ровными, резко очерченными краями.
Титр сыворотки учитывают по последнему разведению сыворотки,
которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов).
Диагностическим титром считается разведение 1:100 и выше, однако, так
же как и в случае РА необходимо проследить за его нарастанием.
РПГА при туляремии является достаточно специфичной и обнаруживает
некоторые перекрестные реакции только с бруцеллезными сыворотками.
Дифференциальная диагностика возможна по высоте титров в РПГА, которые
значительно выше с гомологичным антигеном.
Техника постановки РПГА в микрообъемах. РПГА может быть выполнена
в микрообъемах с помощью микротитратора типа Такачи (или круглодонных
микропланшетах с микропипетками), который позволяет осуществлять
титрование материала в объемах 25 мкл и 50 мкл. Техника постановки
реакций, последовательность всех операций такая же, как и при
исследовании в полистироловых пластинах. Следует, однако, иметь в
виду, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение (т.е.
в 2 раза) ниже, чем макрометода.
Для постановки реакции в микротитраторе с помощью пипетки -
капельницы в каждую лунку вносят разводящую жидкость в объеме 50 мкл.
Затем с помощью титраторов с головкой объемом 50 мкл забирают
исследуемую сыворотку, погружая в нее головку. Следует убедиться, что
жидкость заполнила головку титратора. Титратор с сывороткой переносят
в первую лунку и, держа его в вертикальном положении, делают несколько
вращательных движений в обе стороны. Затем титратор переносят в
следующую лунку и повторяют манипуляцию. Титрование можно проводить
одновременно в нескольких рядах. После титрования всего ряда титратор
промывают дистиллированной водой (со сменой 2-х порций) путем
вращательных движений, удаляют воду из головки с помощью тампона и
обжигают ее на пламени горелки.
В лунки после титрования добавляют 25 мкл эритроцитарного
диагностикума. Концентрация диагностикума для РПГА в микрообъемах
должна составлять 0,5% (т.е. 2,5%-ную взвесь эритроцитов дополнительно
разводят в 5 раз). После добавления эритроцитов пластины следует
слегка потрясти до получения гомогенной взвеси. Учет результатов может
быть произведен уже через 1-1,5 часа, в чем существенное преимущество
РПГА в микротитраторе. Кроме того, этот прием требует малого
количества всех ингредиентов реакции и испытуемых сывороток.
Учет реакции производят по следующей схеме: 1) "+" - полноценная
гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно лунки
равномерным слоем в виде "зонтика", занимающего не менее 2/3 дна; 2)
"+-" - частичная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на
дно в виде рыхлого кольца небольшого размера; 3) "-" - отсутствие
гемагглютинации, когда эритроциты выпадают на дно в виде маленькой
пуговки или колечка с ровным краем.
Специфичность положительного результата, полученного в РПГА,
может быть проверена с помощью трехкомпонентной реакции - реакции
торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).
Техника постановки РТПГА. Эту реакцию ставят для подтверждения
специфичности положительного результата РПГА, когда он вызывает
сомнение или представляет особый эпидемиологический интерес. Механизм
реакции заключается в специфическом торможении гемагглютинации при
добавлении к испытуемой сыворотке взвеси убитых туляремийных бактерий.
В реакции взаимодействуют три компонента: испытуемая сыворотка,
специфический туляремийный антиген и антигенный эритроцитарный
диагностикум РТПГА обычно ставят в ряду из 7-8 лунок. Целесообразно
параллельно с РТПГА ставить повторную РПГА. В два ряда лунок разливают
по 0,25 мл разводящей жидкости, затем в первые лунки обоих рядов
вносят испытуемую сыворотку в объеме 0,25 мл и производят титровании
Получают два одинаковых ряда разведений сыворотки. Во все лунки
второго ряда добавляют по 0,25 мл разводящей жидкости, а в лунки
первого ряда - по 0,25 мл взвеси туляремийных бактерий. Используют
туляремийный диагностикум (содержащий 25 млрд. туляремийных бактерий в
1 мл), предварительно разведенный в 50 раз. Такая взвесь содержит 500
млн. бактерий в 1 мл или 125 млн. в объеме 0,25 мл. После добавления
антигена пластину оставляют на 1 час при комнатной температуре, после
чего во все лунки обоих рядов добавляют по одной капле (0,05 мл)
эритроцитарного диагностикума, пластину встряхивают и оставляют на
ровной поверхности стола. Учет производят через 2-3 часа.
Учет и оценка РТПГА. Если в испытуемой сыворотке содержатся
специфические туляремийные антитела, они нейтрализуются добавленным
антигеном и в первом ряду лунок гемагглютинации не произойдет, или,
при высоком титре сыворотки, гемагглютинация будет отмечаться в
меньшем (на 2-4) количестве лунок, чем в ряду с РПГА. В этом случае
специфичность результатов подтверждена. Если же гемагглютинация будет
отмечена в обоих рядах, т.е. результаты РТПГА и РПГА совпадут, то это
свидетельствует об отсутствии в испытуемой сыворотке туляремийных
антител. В таком случае первичный результат РПГА признается
неспецифическим.
Техника постановки РТПГА в микрообъемах. РТПГА, также как и РПГА,
может быть выполнена в микрообъемах с использованием микротитратора
типа Такачи. Для этого в лунки микропластинок вносят по 0,25 мкл
разводящей жидкости в два ряда по 7-8 лунок в каждом. Затем с помощью
титратора забивают по 0,25 мкл исследуемой сыворотки и титруют ее в
обоих рядах. После этого в первый ряд вносят по 25 мкл туляремиймого
антигена (концентрация которого 500 млн. туляремийных бактерий в 1 мл)
в каждую лунку, а во второй - 25 мкл разводящей жидкости. Пластины
оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки
обоих рядов добавляют 25 мкл антигенного зритроцитарного диагностикума
(0,5%-ной концентрации). Учет и оценку результатов производят
аналогично реакции в макрообъемах.
2.3. Иммуноферментный анализ на твердом носителе (ИФА). Метод
используют для диагностики туляремии у больных и переболевших людей,
определения иммунитета у вакцинированных против туляремии. У больных
туляремией специфические антитела обнаруживаются в ИФА между 6-10
днями, достигают максимальных показателей к 4-7 неделям, затем уровень
их снижается, но они продолжают длительно (более 10 лет) выявляться
после переболевания. ИФА обеспечивает более раннюю (в сравнении с РА и
РПГА) и эффективную иммунологическую диагностику. Титры антител у
больных и вакцинированных колеблются в значительных пределах от 1:400
до 1:40000 и выше и, как правило, в 10-20 раз превышают таковые в РА и
РПГА.
Для постановки ИФА используют диагностическую тест-систему
иммуноферментную для определения туляремийных антител. Выявление
туляремийных антител в сыворотках людей происходит за счет
специфического взаимодействия антигена туляремийного микроба,
адсорбированного на планшете, с туляремийными антителами в исследуемой
сыворотке. Образовавшийся комплекс "антигенантитело" определяют с
помощью антител против иммуноглобулинов человека, меченных
пероксидазой.
В соответствии с назначением тест-система представляет собой
набор ингредиентов для проведения иммуноферментного анализа на
твердофазном носителе и включает в себя: туляремийный липополисахарид;
антитела против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой,
контрольную положительную сыворотку; контрольную отрицательную
сыворотку; набор солей, необходимых для приготовления буферных
растворов; субстрат - 0-фенилендиамин (ОФД); твин-20; бычий
сывороточный альбумин (БСА); планшеты для ИФА однократного применения.
Техника постановки ИФА.
1. Сенсибилизация твердой фазы. В лунки планшета вносят с помощью
дозатора по 200 мкл раствора туляремийного антигена в концентрации 10
мкг/мл в 0.02М растворе фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,2.
Адсорбцию туляремийного антигена на планшетах проводят в течение 120
мин при температуре 37 град.С или 18 часов при температуре 20 град.С.
Затем антиген удаляют встряхиванием планшет с последующей трехкратной
отмывкой (по 5 мин) раствором ФСБ (рН 7,2), содержащим 0,05%
детергента - твин-20.
2. Внесение исследуемого материала. Исследуемые сыворотки,
разведенные 1:200 и далее последовательно путем двукратных разведений
на ФСБ-твин, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА),
вносят по 100 мкл в каждую лунку. Параллельно с исследуемыми
сыворотками (на каждом планшете) вносят аналогичным образом
разведенные заведомо отрицательную и положительную туляремийную
сыворотку человека. Планшеты выдерживают в термостате при температуре
37 град.С в течение 1 часа. После чего жидкость удаляют встряхиванием
и отмывают планшеты, как указано в п.1.
3. Внесение конъюгата. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл
раствора конъюгата в рабочем разведении (указанном на этикетке):
конъюгат разводят на ФСБ-твин, содержащем 1% БСА. Планшеты выдерживают
в термостате при температуре 37 град.С в течение 1 часа. Жидкость из
лунок удаляют встряхиванием и отмывают планшеты, как указано в п.1.
4. Проявление. В каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного
раствора, содержащего 0,04% О-фенилендиамина и 0,04% Н2О2 в 0,1 М
цитратно-фосфатном буфере рН 5,5. Инкубацию проводят в темноте при
комнатной температуре 15-30 мин и останавливают внесением в лунки по
100 мкл серной кислоты в концентрации 0,5 мол/л.
5. Учет и оценка результатов ИФА. Результаты реакции можно
учитывать визуально, сравнивая окраску в опытных лунках с
контрольными, или определять интенсивность окрашивания субстратной
смеси инструментально, используя микроэлектрофотометр типа Multiskan,
при длине волны 492 нм. Появление желто-оранжевого окрашивания в
опытных лунках при его отсутствии в лунках с отрицательными контролями
свидетельствует о положительной реакции. При фотометрическом учете
результатов проба считается положительной, если ее оптическая
плотность (ОП) в 2 и более раза превосходит наивысшее значение ОП
отрицательных контролей.
Пробы рекомендуется первоначально исследовать параллельно в 2
лунках в разведении 1:200 с последующей раститровкой положительных
сывороток для определения титра антител, используя 2-кратные
разведения сывороток.
При постановке ИФА предусматриваются следующие контроли (на
каждом планшете): 1) отрицательная сыворотка в разведении 1:200 и выше
- отсутствие окрашивания раствора; 2) положительная сыворотка в
разведении 1:200 и выше - выраженное окрашивание раствора (при
инструментальной оценке ОП не менее, чем в 2 раза выше ОП
отрицательной сыворотки); 3) контроль конъюгата (вместо сыворотки
вносят раствор ФБС-твин) - отсутствие окрашивания раствора; 4)
контроль субстратной смеси (вместо конъюгата вносят раствор ФСБ-твин)
- отсутствие окрашивания раствора. В сомнительных случаях для
подтверждения специфичности результатов рекомендуется постановка
реакции торможения специфическим антигеном. Диагностическим титром в
ИФА считают разведение сыворотки 1:400 и выше. Более подробно методика
ИФА отражена в Инструкции по применению тест-системы иммуноферментной
для определения туляремийных антител (1986 год).
В последние годы для диагностики туляремии разработаны и
некоторые другие методы, в частности, основанные на использовании
синтетических носителей для сенсибилизации антигена, с успехом
используемые в отдельных регионах и учреждениях.
2.4. Применение непрямого иммунофлуоресцентного метода для
обнаружения туляремийных антител. При применении непрямого ИФМ для
обнаружения антител к туляремийному микробу заранее готовят мазки из
1-2 суточной агаровой культуры возбудителя (1 млрд взвесь). При этом
на одном предметном стекле делают 8 мазков, фиксируют их в этиловом
спирте в течение 30 мин, не обжигая, высушивают на воздухе и помещают
во влажную камеру. Исследуемую сыворотку разводят 2-кратно с
разведения 1:10 до 1:640 - 1:1280 и наносят пастеровской пипеткой на
мазки, начиная с большего разведения. Влажную камеру с препаратом
помещают в термостат (37 град.С на 30 мин). Мазок отмывают от
несвязавшихся антител и после подсыхания его вновь помещают во влажную
камеру, докрашивая антивидовой люминесцирующей сывороткой в рабочем
разведении. Дальнейшая обработка препарата ведется, как при прямом
иммунолюминесцентном методе. После просмотра препарата под
люминесцентным микроскопом устанавливают титр антител в исследуемой
сыворотке.
В качестве контролей служат препараты, в которых туляремийные
бактерии обработаны туляремийной сывороткой (положительный контроль) и
сывороткой, не содержащей антитела к возбудителю туляремии
(отрицательный контроль). При исследовании сыворотки больного с
подозрением на туляремию диагностическим считается титр не менее 1:40.
3. Бактериологические методы
Бактериологические методы диагностики туляремии имеют
дополнительное значение и не всегда эффективны, что определяется
особенностями течения инфекции у человека с малой обсемененностью
органов и тканей возбудителем Следует учитывать, что не в любом
материале, взятом от больного, содержатся живые туляремийные бактерии.
Кроме того, выделение возбудителя наиболее вероятно в течение первых
2-3-х недель от начала заболевания и реже в более поздние сроки.
Выделение и идентификация возбудителя туляремии могут быть
произведены только в специально оборудованных режимных лабораториях.
Забор и доставку патологического материала в лабораторию производят с
соблюдением предосторожностей и правил работы с особо опасными
инфекциями П группы патогенности.
3.1. Посев на питательные среды. Использование
бактериологического метода при диагностике туляремии возможно, но, по
сравнению с биологическим методом малоэффективно, так как в организме
больного туляремийные бактерии содержатся в малом количестве. Лишь в
редких случаях удавалось высевать возбудитель туляремии из
патологического материала от больных людей (содержимое язвы на коже,
содержимое бубона и т.д.). Патологический материал от больных может
быть исследован методом посева лишь в первые 2-3 недели от начала
заболевания. Для этого используют специальные среды, применяемые для
культивирования туляремийного микроба. Наиболее чувствительными и
доступными являются свернутая желточная среда, желточно-агаровая
среда, различные варианты агаровых сред, содержащих цистин, глюкозу,
кровь, другие факторы роста, а также специальные среды для
культивирования туляремийного микроба (подробно см. приложение 2).
Скорость появления роста культуры зависит от количества микробов в
исследуемом материале: при посеве слабо инфицированного материала рост
отдельных колоний возможен в отдаленные сроки, поэтому посевы следует
выдерживать в термостате при 37 град.С в течение не менее 10 суток.
3.2. Биологическая проба. Биологическая проба является самым
чувствительным способом обнаружения туляремийных бактерий в любом
исследуемом материале, в том числе и при исследовании материала от
больных людей, т.к. биопробные животные (белые мыши, морские свинки)
заболевают туляремией со смертельным исходом при подкожном введении
единичных бактерий. Однако при обследовании больных людей даже
биологический метод не всегда надежен, так как не в любом образце
материала, взятом от больного, имеются жизнеспособные туляремийные
бактерии. В отделяемом кожной язвы и в пунктате из пораженного
лимфатического узла возбудитель туляремии может быть обнаружен в
течение 3 недель от начала заболевания, редко позднее. Известны случаи
выделения возбудителя из мокроты, материала, взятого из зева (с
миндалин) или конъюнктивы глаза. В редких случаях удается выделить
возбудитель из крови, но обычно не позднее первой декады болезни.
Патологический материал (отделяемое кожной язвы, конъюнктивы
глаза, миндалин или мокроту, пунктат из бубона) смешивают с небольшим
количеством физиологического раствора (0,3-0,5 мл) и вводят подкожно
белой мыши или внутрибрюшинно морской свинке. Кровь для исследования
(3-5 мл) берут из локтевой вены, разводят пополам физиологическим
раствором и вводят подкожно белым мышам (по 0,5-1,0 мл) или
внутрибрюшинно морским свинкам (5-7 мл). Сроки гибели биопробных
животных зависят от степени инфицированности патологического материала
и составляют 4-9 и более суток (до 15) для белых мышей и 6-15 (до 20)
для морских свинок. Культуру туляремийных бактерий от биопробных
животных выделяют посевом на специальные питательные среды (см. выше).
Идентификацию свежевыделенной туляремийной культуры осуществляют на
основании совокупности следующих признаков: 1) морфологии клеток и
грамотрицательной их окраски в мазках; 2) характера роста на желточной
среде или специальных средах; 3) отсутствие роста на простых
мясо-пептонных средах; 4) агглютинация туляремийной сывороткой; 5)
специфическим свечением в реакции иммунофлуоресценции; 6) способностью
вызывать гибель белых мышей и морских свинок при их заражении
испытуемой культурой с характерными для туляремии
патологоанатомическими изменениями в органах и выделением чистой
культуры возбудителя.
3.3. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ), прямой метод. При
исследовании патологического материала от больных может быть
эффективен прямой иммунофлуоресцентный метод, позволяющий выявлять как
живые, так и нежизнеспособные бактерии по свечению в них
специфического антигена. Имеются данные, когда методом РИФ у больного
туляремией через 2 месяца от начала заболевания в мазках-отпечатках из
бубона были обнаружены туляремийные бактерии, тогда как выделение
возбудителя бактериологическими (биологическими) методами оказалось
безуспешным. В качестве объектов, подвергающихся исследованию в РИФ,
могут быть мазки, приготовленные из патологического материала
больного: содержимого кожного аффекта, пунктата бубона, отделяемого
слизистой глаза, смывы с зева, миндалин и др.
Техника приготовления препарата. Каплю исследуемого материала
наносят на тщательно обезжиренное стекло и делают тонкий мазок.
Препараты подсушивают на воздухе при комнатной температуре и фиксируют
в 96 этиловом спирте в течение 15-20 мин. Фиксированные препараты
подсушивают на воздухе. До обработки препаратов люминесцирующей
сывороткой их хранят при 4 град.С.
Техника постановки реакции. Для постановки РИФ (прямой метод)
используют сухую люминесцирующую туляремийную сыворотку, которая
представляет собой высушенную лиофильно иммуноглобулиновую фракцию
сыворотки с присоединенным к ней химическим путем флуоресцирующим
красителем - изотиоционатом флуоресцеина.
При исследовании в РИФ тканевого материала в целях повышения
специфичности результатов анализа и для контрастирования
неспецифического свечения туляремийную люминесцирующую сыворотку
используют вместе с бычьим альбумином, меченным родамином, который
сообщает клеткам и тканям, а также прочим органическим включениям,
содержащимся в исследуемых препаратах, оранжево-красное
неспецифическое свечение различных оттенков.
Сухую люминесцирующую туляремийную сыворотку и сухой бычий
альбумин растворяют в указанных на этикетках ампул объемах
дистиллированной воды. Затем, непосредственно перед нанесением на
препарат люминесцирующую туляремийную сыворотку и меченый бычий
альбумин разводят физиологическим раствором рН 7,0-7,2, доводя до их
рабочего разведения, указанного на ампуле. Далее каплю смеси
туляремийной люминесцирующей сыворотки и меченного родамином бычьего
сывороточного альбумина наносят на фиксированный и подсушенный
препарат, равномерно распределяя смесь по всему препарату, и помещают
его во влажную камеру. "Окраску" препарата производят в течение 20 мин
при комнатной температуре (18-20 град.С). По окончании "окраски"
препарата каплю смеси люминесцирующей сыворотки и меченого бычьего
альбумина стряхивают и препарат промывают в течение 5-10 мин проточной
водопроводной водой или в нескольких сменяемых порциях
физиологического раствора (рН 7,2-7,4). Затем препарат подсушивают на
воздухе, наносят на него каплю разведенного глицерина (9 частей
глицерина + 1 часть физиологического раствора рН 7,2-7,4) и покрывают
покровным стеклом. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой.
Такой препарат готов для просмотра в люминесцентном микроскопе.
Учет и оценка РИФ. Мазки просматривают в падающем свете
люминесцентного микроскопа с лампой ДРШ-250 и системой светофильтров.
Используют иммерсионный объектив 90х(1,26) и окуляры 5х или 7х. При
микроскопировании используют нефлуоресцирующее иммерсионное масло.
В положительных случаях, т.е., когда исследуемый материал
содержит туляремийные бактерии, в люминесцентном микроскопе
обнаруживается специфическое изумрудно-зеленое свечение туляремийных
бактерий. Удается обнаружить более яркое свечение периферии
бактериальной клетки и более слабое - в ее центральной части.
Посторонние микроорганизмы, клетки ткани и прочие органические частицы
приобретают оранжево-красную (различных оттенков) флуоресценцию. Для
оценки интенсивности специфического свечения используют
четырехкрестовую систему регистрации результатов. Положительным
результатом считается флуоресценция, оцениваемая на ++++ или +++ при
достаточном количестве (2-5 клеток в нескольких полях зрения
микроскопа) специфически флуоресцирующих бактерий. При оценке
исследуемого препарата необходимо учитывать не только интенсивность
специфического свечения, но и обращать особое внимание на характерную
морфологию бактерий и учитывать расположение клеток относительно друг
друга.
При исследовании различных препаратов необходимо иметь
контрольный мазок, приготовленный из взвеси туляремийных бактерий и
обработанный подобно опытным образцам.
3.4. В качестве дополнительного метода диагностики туляремии у
человека может быть рекомендовано обнаружение специфической ДНК в
патологическом материале современным методом молекулярной биологии с
использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Заместитель руководителя
Департамента госсанэпиднадзора
С.И. Иванов
Приложение 5
к приказу Минздрава РФ
от 14 апреля 1999 года
N 125
Профилактика туляремии
(Методические указания)
Специфическая профилактика
Неспецифическая профилактика
Основу профилактики туляремии составляют вакцинация угрожаемых
контингентов населения высокоэффективной живой противотуляремийной
вакциной, а также профилактические мероприятия, квалифицируемые как
средства и методы неспецифической профилактики.
Специфическая профилактика.
Необходимость проведения профилактической вакцинации и ее объемы
определяется центрами госсанэпиднадзора в субъектах Российской
Федерации на основании многолетнего анализа эпизоотической и
эпидемической обстановки на подведомственной территории, энзоотичной
по туляремии.
Энзоотичной по туляремии считается территория (административный
район), где были зарегистрированы местные случаи заболевания людей,
изолированы культуры возбудителя или регулярно выявлялся антиген в
объектах внешней среды (погадки птиц, помет хищных млекопитающих,
подснежные гнезда грызунов, вода, фураж и т.п.).
Такие территории должны находиться под постоянным наблюдением
центров госсанэпиднадзора и подвергаться дифференцированному
эпизоотологическому мониторингу в зависимости от степени их
эпизоотической активности и эпидемической опасности.
Активными природными очагами считают такие, в которых
регистрируют случаи заболевания людей (даже единичные), выделяют
культуры возбудителя туляремии (от грызунов, членистоногих, объектов
внешней среды) или регулярно выявляют туляремийный антиген в погадках
птиц и помете хищных млекопитающих (при наличии антигена не менее чем
в 10% образцов в годы высокой численности грызунов при статистически
достоверной выборке => 100 погадок, собранных на территории
конкретного природного очага). Активные природные очаги следует
обследовать ежегодно при минимально необходимых объемах
зоолого-паразитологических и лабораторных исследований, позволяющих
оценить степень эпизоотической активности и эпидемической опасности,
но не реже, чем весной и осенью.
Малоактивными природными очагами считают такие, в которых
заболевания людей и выделение культур возбудителя не регистрируют, но
имеют место нерегулярные находки туляремийного антигена в объектах
внешней среды. Эти очаги следует обследовать один раз в 2-3 года.
Необходимо также осуществлять разведку новых потенциально опасных
территорий (1 раз в 3-5 лет) на возможное обнаружение природных очагов
туляремии.
Данные эпизоотологического и эпидемиологического обследования, а
также составленные по их результатам научно-обоснованные прогнозы,
являются основой профилактических мероприятий против туляремии, в
первую очередь, вакцинации населения.
1. Планирование и организация прививок против туляремии
Вакцинацию против туляремии проводят населению, проживающему на
энзоотичных по туляремии территориях, а также контингентам,
подвергающимся риску заражения этой инфекцией. Планирование и подбор
контингентов, подлежащих вакцинации против туляремии, осуществляют
центры госсанэпиднадзора с учетом степени эпизоотической активности
природных очагов, а также экономических и хозяйственных связей с
сопредельными территориями.
Вакцинацию (и ревакцинацию) против туляремии проводят с
применением живой туляремийной вакцины в строгом соответствии с
действующей инструкцией по ее применению в любое время года, учитывая
календарь других прививок. Допускается одновременная накожная
вакцинация взрослых против туляремии и бруцеллеза, туляремии и чумы на
разных участках наружной поверхности трети плеча. Интервал между
вакцинацией против туляремии и другими прививками должен быть не менее
одного месяца, а в отношении детских контингентов - не менее двух
месяцев. Вакцинацию осуществляют медицинские работники
лечебно-профилактических учреждений.
Различают плановую и внеплановую (по эпидпоказаниям) вакцинацию
против туляремии.
1.1. Плановая вакцинация
Плановыми прививками охватывают население, проживающее (или
работающее) на территории с наличием активных природных очагов
луго-полевого, степного, пойменно-болотного (и его вариантов),
предгорно-ручьевого типов при 100%-ном охвате прививками лиц, за
исключением детей до 7 лет и лиц, имеющих противопоказания к
прививкам.
1.1.1. В очагах луго-полевого типа не прививают детей в возрасте
до 14 лет, а также лиц, не занимающихся сельскохозяйственными работами
и не имеющих скота в личном пользовании.
1.1.2. В природных очагах тундрового, лесного типов, а также в
пойменно-болотных очагах при отсутствии водяной полевки (где основным
источником инфекции является ондатра) вакцинацию проводят только лицам
с профессиональным риском инфицирования: охотники, рыболовы (и члены
их семей), пастухи, полеводы, мелиораторы, оленеводы, а также лицам,
направляемым на временную работу: геологи, строители и т.п.
1.1.3. На территориях с малоактивными природными очагами
туляремии, а также в городах, прилегающих к природным очагам,
вакцинируют только группы риска, а именно:
- работников зерно- и овощехранилищ, сахарных заводов,
элеваторов, мельниц, мясокомбинатов, комбикормовых заводов,
спиртозаводов, предприятий по переработке сельскохозяйственных
продуктов и сырья животноводческих и птицеводческих ферм, работающих с
зерном, фуражом, сахарной свеклой и др., а также скотом, поступающим
на переработку из энзоотичных по туляремии степных и луго-полевых
очагов;
- лиц, принимающих и обрабатывающих шкурки промысловых зверьков,
поступающих из энзоотичных по туляремии территорий.
1.1.4. Вакцинации подлежит персонал отделов особо опасных
инфекций центров госсанэпиднадзора, противочумных и
научно-исследовательских учреждений, лабораторий и эпидотрядов,
работающих с возбудителем туляремии или осуществляющих сбор и
исследование мелких млекопитающих, членистоногих, объектов внешней
среды из энзоотичных по туляремии территорий, а также подразделений
различных служб, проводящих дератизационные и дезинсекционные
мероприятия.
Ревакцинацию проводят через 5 лет контингентам, подлежащим
плановой вакцинации.
Принимая во внимание стойкость природных очагов туляремии и их
длительное существование, отмена плановых прививок допускается только
на основании представленных центрами госсанэпиднадзора материалов,
свидетельствующих об отсутствии циркуляции возбудителя в биоценозе, в
том числе в связи с влиянием хозяйственной деятельности человека
(полная осушка болот и водоемов на больших площадях, сплошная распашка
и последующее освоение крупных земельных массивов при отсутствии
лесополос, оврагов и т.п). Эти материалы должны быть подтверждены
отрицательными результатами ежегодных эпизоотологических и
эпидемиологических исследований с применением бактериологического и
серологических методов в пределах границ конкретных очаговых
территорий и охватывающих не менее трех очередных периодов массового
размножения грызунов (не менее 10-12 лет).
1.2. Вакцинация по зпидпоказаниям.
Внеплановую вакцинацию против туляремии проводят:
1.2.1. В населенных пунктах, расположенных на территориях, ранее
считавшихся благополучными по туляремии, при заболевании людей (даже
единичные случаи) или выделении туляремийных культур из каких-либо
объектов;
1.2.2. В населенных пунктах, расположенных на территориях
активных природных очагов туляремии, при выявлении низкой иммунной
прослойки (менее 70% в луго-полевых очагах и менее 90%
пойменно-болотных очагах);
1.2.3. В городах, непосредственно прилегающих к активным
природным очагам туляремии, контингентам, подвергающимся риску
заражения - членам садоводческих кооперативов, владельцам (и членам их
семей) личного автои водного транспорта, работникам водного транспорта
и т.п.;
1.2.4. Лицам, выезжающим для постоянных или временных работ на
территории активных природных очагов туляремии: охотники, лесники,
мелиораторы геодезисты, заготовщики шкурок промысловых зверьков
(водяные полевки, зайцы, ондатры), геологи, члены научных экспедиций,
лица, направляемые на сельскохозяйственные, строительные,
изыскательские или иные работы, туристы и др.
Вакцинацию вышеуказанных лиц и групп организуют и проводят
учреждения здравоохранения в местах их формирования.
Контроль за состоянием противотуляремийного иммунитета.
Контроль за своевременностью и качеством вакцинации против
туляремии, а также за состоянием иммунитета осуществляют центры
госсанэпиднадзора.
Состояние иммунитета у вакцинированных проверяют через 5 лет
после вакцинации и в последующем - 1 раз в 2 года. Ревакцинацию
проводят в случае отрицательных результатов иммунологических
показателей (аллергические или серологические реакции).
Иммунную структуру населения определяют путем выборочной проверки
взрослого работоспособного населения также с помощью аллергического
(туляриновая проба) или одного из серологических методов исследования
(реакция агглютинации, реакция пассивной гемагглютинации,
иммуноферментный анализ). При этом предпочтительнее использовать
серологические методы исследования. Общее число проверяемых людей в
конкретном административном районе должно составлять не менее 1% к
общему числу проживающих (или не менее 10% в отдельном населенном
пункте). Ревакцинацию проводят при выявлении уровня иммунной прослойки
ниже 70% в луго-полевых очагах и ниже 90% - в пойменно-болотных очагах
(см. Раздел 1.2.2.). Отбор контингентов для проверки иммунной
структуры населения, оценки результатов иммунологических реакций
осуществляют при обязательном участии работников центров
госсанэпиднадзора (отделов особо опасных инфекций, врачей
эпидемиологов и др.).
У персонала отделов особо опасных инфекций центров
госсанэпиднадзора, противочумных, научно-исследовательских учреждений,
эпидотрядов, проводящих работу с возбудителем туляремии и привитых с
положительным результатом, состояние иммунитета проверяют 1 раз в 2
года. К работе допускают лиц с наличием противотуляремийного
иммунитета, определяемого с помощью аллергических (туляриновая проба
или реакция лейкоцитолиза) или одного из серологических методов
(реакция агглютинации, реакция пассивной гемагглютинации,
иммуноферментный анализ). Ревакцинацию проводят только в случае
получения отрицательных иммунологических показателей при очередной
проверке иммунитета.
Неспецифическая профилактика
Неспецифической профилактике туляремии предшествует организация
поиска эпизоотии в природных очагах этой инфекции. Исходя из
результатов эпизоотологического обследования планируют и реализуют
соответствующий комплекс профилактических мероприятий.
Неспецифическая профилактика туляремии проводится по двум
основным направлениям:
- устранение условий заражения людей (общесанитарные и
гигиенические мероприятия, включая информационно-разъяснительную
работу);
- снижение лоймопотенциала природных очагов (мероприятия по
дератизации и дезинсекции).
Неспецифические мероприятия имеют свои особенности при различных
типах заболеваемости.
При трансмиссивных заражениях через кровососущих двукрылых
рекомендуется применение реппелентов, защитной одежды, ограничение
доступа непривитого населения на неблагополучные территории, а в
редких случаях - дезинсекция водоемов.
При промысловых заражениях проводят комплекс регулирующих
численность носителей и (или) ограничительных
санитарно-противоэпидемических мероприятий в местах промысла зверьков,
а также мероприятия по дезинсекции и дезинфекции на складах хранения
шкурок. На охоте рекомендуется дезинфицировать руки после снятия
шкурок и потрошения зайцев, ондатр, кротов и водяных полевок.
Необходима тщательная термическая обработка заячьего мяса перед
употреблением его в пищу. Употребление в пищу малосольной зайчатины
может вызвать заболевание туляремией.
При вспышках, связанных с контактом населения с зараженным
водоемом, необходимо прекратить купание и водопользование,
использовать для питья только кипяченую воду, а при заражении
колодезной воды - принять меры по очистке колодца от трупов грызунов и
дезинфицировать воду.
При заражении во время зимних сельскохозяйственных работ в
природных очагах туляремии недопустимо привлечение к ним непривитого
населения. Подвергающиеся риску заражения лица должны быть обеспечены
защитной одеждой, респираторами, перчатками. Инфицированное зерно,
корм и другие субстраты либо уничтожаются, либо обеззараживаются.
При бытовых заражениях обеспечивают, по возможности,
грызунонепроницаемость жилых и подсобных помещений, дератизацию и
влажную уборку с применением дезинфицирующих средств.
При производственных и продуктовых заражениях осуществляют
санитарно-противоэпидемические мероприятия на предприятиях или на
складах, включающие обеззараживание инфицированного сырья и продуктов.
На мясокомбинатах производят дезинсекцию скота, поступившего для
переработки.
При посещении леса, сборе ягод и т.п. следует проводить само- и
взаимоосмотры, удаляя и уничтожая (но не раздавливанием) всех
наползших или прикрепившихся иксодовых клещей. Место их прикрепления
обрабатывают настойкой йода или бриллиантовой зелени. Это же делают
при обнаружении ссадин на коже и других повреждениях. При подозрении
попадания инфекции в глаз следует промыть его кипяченой водой, а затем
закапать в глаз раствор протаргола.
Лоймопотенциал природных очагов туляремии может быть снижен за
счет проведения комплексных мероприятий, направленных на сокращение
численности основных носителей и переносчиков инфекции, а также в
результате антропогенной трансформации ландшафта.
Снижение численности клещей достигается: изменением сроков
(позднее начало) весеннего выпаса скота, когда заканчивается период
активации клещей, сокращением площади естественных лугов, выпасом
скота на искусственных и культурных пастбищах, плановой или экстренной
обработкой заклещевленного скота. В случае массового заклещевления
обработка скота должна проводиться регулярно с интервалами 7-10 дней
для наиболее полного уничтожения взрослых клещей и через 12-15 дней
против личинок и нимф. Уничтожение клещей на скоте проводят
химическими веществами (акарицидами) или механическим путем.
Дератизационные мероприятия включают как собственно уничтожение
грызунов разными методами, так и агротехнические приемы,
препятствующие повышению численности мелких млекопитающих. Хорошие
результаты, в частности, дает прессование сена в тюки, качественная
обработка стогов сена и ометов соломы аммиачной водой, складирование
кормов после уборки урожая в хорошо оборудованные,
грызунонепроницаемые хранилища. Не рекомендуется устанавливать стога
сена и ометы соломы по краям оврагов или опушкам леса. Из этих станций
зверьки активно заселяют стога и ометы. В некоторых хозяйствах
практикуется зимняя буксировка сена волоком при помощи тракторов
непосредственно к фермам. При этом доставляются и все обитающие в
стогах и ометах грызуны и повышается риск заражения работников фермы.
Полевую дератизацию следует проводить в зимний и ранне-весенний (сразу
после схода снежного покрова) периоды.
Переселение мышевидных грызунов из естественных мест обитания в
населенные пункты начинается с уборкой урожая и вывозом
сельскохозяйственных продуктов с полей, а с наступлением осенних
холодов этот процесс становится массовым, особенно в годы высокой
численности грызунов. Таким образом, к грызунам, обитающим в
населенных пунктах, присоединяются грызуны из естественных мест
обитания. Во время осенних миграций в населенный пункт дикими
грызунами может быть занесен возбудитель туляремии и вследствие этого
развиться эпизоотия этой инфекции среди синантропных грызунов. Поэтому
планомерное уничтожение грызунов позволяет предупредить развитие
эпизоотии.
Борьба с грызунами в населенных пунктах включает в себя
обеспечение грызунонепроницаемости зерно- и овощехранилищ фуражных
складов, других хозяйственных и жилых построек, водоисточников.
Истребление грызунов осуществляют при помощи разнообразных орудий
лова, отравленных приманок в том числе с созданием точек
долговременного отравления грызунов химических средств, бактериальных
препаратов. Важным условием качественного проведения дератизации
является координация усилий всех заинтересованных организаций и
учреждений.
Дезинфекция, дезинсекция и дератизация должны планироваться и
проводиться на основании результатов эпизоотического обследования и
обязательно сопровождаться оценкой эффективности проводимых
мероприятий.
Заместитель руководителя
Департамента госсанэпиднадзора
С.И. ИвановСтраницы: 1 2 |