культуру из коллекции микроорганизмов.
10.2.4. Подготовка культуры для целевого
использования в анализе
Накануне использования культуру с полужидкого агара высевают на 2
+
пробирки со скошенным питательным агаром. E.coli К12 F Str-r
пересевают на скошенный питательный агар, содержащий стрептомицин.
Посевы инкубируют 18 - 24 часа при 37 ЬC.
Культуру из одной пробирки используют по назначению с
предварительной подготовкой согласно методическим документам. Вторая
пробирка используется для получения культуры для работы на следующий
(второй) день. При необходимости получения культуры тест-штамма на
третий день высев снова производят с полужидкого агара.
10.3. Оптимальный вариант ведения
эталонных культур
Процесс ведения штаммов в данном варианте состоит из следующих
блоков:
- восстановление и контроль лиофилизированной культуры;
- создание запаса эталонной культуры, хранение в условиях
криоконсервации;
- создание запаса рабочей культуры;
- подготовка культуры для целевого использования;
- контроль видовых и паспортных свойств.
Данный вариант ведения эталонных культур обеспечивает оптимальные
условия для накопления и длительного (3 - 5 лет) хранения эталонной
культуры, предназначенной для создания и регулярного восполнения
запаса рабочей культуры.
В отличие от широко распространенной методики ведения культур
микроорганизмов, основанной на неограниченных последовательных
(линейных) пересевах, данная схема ведения сводит до минимума
количество пассажей эталонной культуры, проводимых от момента
восстановления после лиофилизации до целевого использования. Такой
подход позволяет сократить вероятность нежелательных мутаций, ведущих
к потере эталонных свойств, или случайного загрязнения. Забракованная
линия эталонной культуры может быть в любой момент заменена новой.
Графически оптимальный вариант культивирования и хранения
эталонных бактериальных культур аэробов и факультативных анаэробов
отражен на схеме и примерном календарном плане манипуляций в Прилож.
7.2, 7.3 <*>.
--------------------------------
<*> Приложение 7.3 не приводится.
10.3.1. Восстановление и контроль
лиофилизированной культуры
Восстановление и контроль лиофилизированной культуры проводят,
как описано в п. 10.2.1.
10.3.2. Создание запасов эталонной культуры
Параллельно с постановкой контрольных тестов из пробирки со
скошенным питательным агаром культуру засевают в 2 пробирки с
питательным бульоном и инкубируют 18 - 24 часа при 37 ЬC.
При удовлетворительном прохождении контрольных тестов, в пробирки
с ночной культурой добавляют стерильный глицерин в количестве 1/10 от
объема культуры. Содержимое тщательно перемешивают и вносят по 1 мл в
промаркированные пластиковые криопробирки из расчета 4 - 5 пробирок на
каждый планируемый год хранения. Криопробирки с запасом эталонной
культуры устанавливают в криобокс (штатив для криопробирок) и
закладывают на хранение при температуре (70 +/- 10) ЬC. Альтернативным
вариантом является хранение в жидком азоте при наличии
соответствующего оборудования.
Закладку запасов эталонной культуры на длительное хранение
осуществляют единожды на весь период ее использования. Запасы
эталонной культуры восполнению не подлежат.
Данный блок выполняет задачу накопителя биомассы эталонного
штамма, что позволяет избежать необходимости восполнять запасы рабочей
культуры за счет повторных пассажей эталонного штамма через
питательные среды и удлиняет "срок службы" культуры, полученной из
одной ампулы.
10.3.3. Создание запасов рабочей культуры
Температуру криопробирки из запасов эталонной культуры доводят до
комнатной температуры. Содержимое аккуратно перемешивают, вносят в
пробирку с 8 - 10 мл питательного бульона и инкубируют при 37 град. C
18 - 20 часов. После инкубации из питательного бульона выполняют высев
в две пробирки со скошенным питательным агаром.
+
Для E.coli К12 F Str-r - на питательный агар, содержащий
стрептомицин. Посевы инкубируют в термостате (18 - 24) часа при 37 ЬC.
Оставшуюся бульонную культуру E.coli M17-02 используют для оценки
степени диссоциации, как указано в пункте 10.4.1.
Один из посевов на скошенном питательном агаре используют для
постановки тестов на соответствие полученного штамма паспортным
(типовым) свойствам. Второй посев используют для создания запасов
рабочей культуры.
При несоответствии штамма видовым и паспортным свойствам
использование культуры не допускается. В этом случае необходимо
разморозить еще одну емкость с эталонной культурой и подвергнуть ее
аналогичному исследованию.
Если культура снова не прошла контроль, ее снимают с хранения и в
дальнейшем не используют. Необходимо получить новую ампулу с эталонной
культурой и начать процедуру ведения тестового штамма сначала.
При удовлетворительном прохождении тестов культуру из пробирки со
скошенным питательным агаром засевают уколом в 3 - 6 пробирок с
полужидким агаром из расчета 1 - 2 пробирки на месяц в зависимости от
интенсивности работы лаборатории. Посев инкубируют 18 - 24 часа при 37
град. C. Пробирки закрывают резиновыми или силиконовыми пробками и
хранят при 4 - 8 град. C.
Запасы рабочей культуры создают 1 раз в 3 месяца, используя для
этой цели новую пробирку из запаса эталонной культуры. Повторное
замораживание размороженной эталонной культуры запрещается. Запасы
рабочей культуры желательно хранить в отдельном холодильнике.
10.3.4. Подготовка культуры для целевого использования
Подготовку культуры для целевого использования осуществляют, как
описано в п. 10.2.4.
10.4. Контроль эталонных бактериальных культур
Постановка контроля включает:
- оценку степени диссоциации культуры Е.coli M17-02;
- проверку видовых свойств бактериальных культур;
+
- проверку способности E.coli К12 F Str-r лизироваться
специфичным фагом MS2;
+
- проверку культуры E.coli К12 F Str-r на однородность и
отсутствие загрязнения фагом.
10.4.1. Оценка степени диссоциации
культуры E.coli. M17-02
Из 18-часовой бульонной культуры делают 10-кратные разведения
физиологическим раствором. По 0,1 мл из 5 и 6 разведения засевают на 2
чашки питательного агара, предварительно подсушенные в термостате.
Шпателем посевы распределяют по поверхности агара до полного
исчезновения влаги и инкубируют в термостате при температуре (37 +/-
1) ЬC в течение 18 - 24 часов.
Выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 100 колоний. Проверку
тест-штаммов на диссоциацию производят путем визуального просмотра
изолированных колоний на чашках в прямом и косонаправленном свете
через бинокулярную лупу или микроскоп на малом увеличении.
На питательном агаре колонии бактерий вида Е.coli образуют
колонии средней величины (3 - 5 мм), плоско-выпуклые, круглые, гладкие
с ровным краем (S-форма), влажные, блестящие, прозрачные в прямом и
непрозрачные (опалово-мутные) в косопроходящем свете. В косопроходящем
свете колонии эшерихий могут иметь равномерную зернистость.
В R-форме колонии эшерихий более плоские, большего размера,
неправильной формы с неровными краями и шероховатой матовой
поверхностью.
При наличии диссоциации (по размеру, S-R-диссоциация, др.)
подсчитывают количество измененных колоний и общее количество
просмотренных колоний. Общее количество просмотренных бактерий не
должно быть менее 30. Затем рассчитывают процент диссоциации по
формуле:
----------------------------------------------------------------------
| количество |
| измененных колоний |
| % диссоцации = --------------------- x 100%. |
| общее количество |
| просмотренных колоний |
----------------------------------------------------------------------
Если процент диссоциированных колоний превышает 25%, то данная
культура не пригодна для дальнейшего использования.
В связи с полиморфизмом колоний для штаммов Pseudomonas
+
aeruginosa и Pseudomonas fluorescens, а также E.coli К12 F Str-r
оценка R-S-диссоциации не проводится.
10.4.2. Контроль видовых свойств
+
E.coli M17-02 и E.coli К12 F Str-r
После восстановления лиофилизированной культуры проводится
типирование культуры по биохимическим свойствам до вида.
Идентификацию рекомендуется проводить с использованием
тест-систем биохимической идентификации семейства Enterobacteriaceae,
разрешенных к применению. При этом следует руководствоваться
рекомендациями производителя. Правомочна постановка отдельных
биохимических тестов.
Перед очередным ежеквартальным созданием запаса рабочей культуры
оценку эталонного штамма E.coli проводят путем подтверждения следующих
основных свойств:
- отсутствие оксидазной активности;
- грам-негативности;
- способности образовывать на среде Эндо характерные
темно-красные (малиновые) колонии с металлическим блеском и отпечатком
на среде;
- способности утилизировать лактозу до кислоты и газа при
температуре 37 и 44 град. C в течение 24 - 48 часов;
- способность утилизировать глюкозу до кислоты и газа при
температуре 37 град. C в течение 24 часов.
Если культура не соответствует видовым свойствам или выявлено
наличие посторонних микроорганизмов, то она не пригодна для
дальнейшего использования.
10.4.3. Проверка чувствительности
+
E.coli К12 F Str-r к фагу
+
Способность E.coli К12 F Str-r лизироваться специфичным фагом,
являющимся основополагающим свойством тест-культуры, на котором
основан метод определения колифагов в воде.
+
Контроль чувствительности E.coli К12 F Str-r к фагу
осуществляется каждый раз, когда из запасов хранения берется новая
пробирка с рабочей культурой на полужидком агаре.
Выполнение анализа
+
Бактериальную взвесь E.coli К12 F Str-r готовят по стандарту
мутности, как указано в разделе 9. На 100 мл расплавленного и
остуженного до 45 - 49 ЬC питательного агара вносят 1 мл бактериальной
взвеси и разливают в чашки. После застывания чашки на поверхность
агара наносят каплю (0,05 мл) суспензии фага (не захватывая
хлороформа). Инкубируют при 37 ЬC 18 - 24 часа. Просмотр посевов
следует осуществлять в проходящем свете.
Культура считается восприимчивой и пригодной для проведения
анализов воды при наличии четких зон лизиса.
При отсутствии зон лизиса культура не пригодна для использования
и подлежит замене.
10.4.4. Проверка культуры
+
E.coli К12 F Str-r на загрязненность фагом
+
Бактериальную взвесь E.coli К12 F Str-r готовят по стандарту
мутности, как указано в разделе 9, вносят в расплавленный и остуженный
до температуры 45 - 49 ЬC питательный агар из расчета 1 мл взвеси на
100 мл агара. Чашку Петри заливают приготовленной смесью, инкубируют
при температуре 37 ЬC 18 - 24 часа.
Посевы просматривают в проходящем свете. Культура должна давать
равномерный газон роста. Наличие зон лизиса в контроле свидетельствует
о загрязненности культуры фагами.
Загрязненная культура не пригодна для дальнейшего использования.
10.4.5. Контроль видовых свойств
Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens
Оценку эталонного штамма Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas
fluorescens проводят путем подтверждения следующих свойств:
- наличия оксидазной активности;
- грам-негативности;
- роста на ПБ в виде серебристой пленки на поверхности с
образованием кольца сине-зеленого пигмента;
- наличия сине-зеленого пигмента пиоцианина при росте на ПА при
37 град.C;
- способности роста на питательном агаре при 42 град.C в течение
24 часов (для Pseudomonas aeruginosa);
- способности роста на питательном агаре при 4 град.C в течение
24 часов (для Pseudomonas fluorescens) либо при температурном
оптимуме, указанном в паспорте.
Если культура не соответствует видовым свойствам, то она не
пригодна для дальнейшего использования.
10.5. Культивирование, хранение и контроль
эталонных культур бактериофагов
В качестве эталонного штамма для проведения контроля культуры
клеток хозяина при проведении анализа на колифаги используется
РНК-содержащий фаг MS2.
Процесс ведения эталонного штамма колифага MS2 состоит из 2
функциональных блоков:
- восстановление лиофилизированной культуры;
- создание запасов эталонной культуры и культуры для целевого
использования.
10.5.1. Восстановление лиофилизированной культуры
Оттянутый конец ампулы с лиофилизированными культурами нагревают
над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона
прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины.
Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной
70Ь-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.
После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в
течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с
остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят ~= 0,5 мл
питательного бульона для регидратации.
10.5.2. Создание запасов эталонной культуры фага
и культур для целевого использования
+
Рабочую культуру E.coli К12 F Str-r, хранящуюся на полужидком
агаре, засевают в пробирку с 10 мл питательного бульона. Посевы
инкубируют при (37 +/- 1) ЬC 18 - 24 часа.
После инкубации 0,1 мл полученной бульонной культуры повторно
засевают в 3 - 4 пробирки с 10 мл питательного бульона и помещают в
термостат при (37 +/- 1) ЬC. Через 2 часа инкубации в каждую пробирку
вносят регидрированную культуру фага MS2, инкубацию продолжают до 18 -
24 часов. После инкубации в пробирки добавляют по 1 мл хлороформа,
герметично укупоривают, интенсивно встряхивают и оставляют на ночь в
холодильнике.
Пипеткой отбирают бульон над осевшим хлороформом и переносят в
стерильные пробирки, добавляют по 1 мл хлороформа, герметично
укупоривают, встряхивают и хранят в холодильнике.
Одну пробирку используют для целевого назначения в контроле
+
чувствительности культуры E.coli К12 F Str-r к фагу согласно п.
10.4.3. Две другие служат запасом эталонного фага.
Активность полученной культуры определяется титром фага. Через
год хранения титр фага может снизиться. В этой связи необходимо
получить новую культуру или провести определение титра хранящегося
фага.
10.5.3. Определение титра фага
Для определения титра фага выполняется серия десятикратных
разведений хранящейся бульонной суспензии эталонного фага, как описано
в разделе 9.
+
Бактериальную взвесь E.coli К12 F Str-r готовят по стандарту
мутности, как указано в разделе 9, вносят в расплавленный и остуженный
до температуры 45 - 49 ЬC питательный агар из расчета 1 мл взвеси на
100 мл агара.
По 1 мл каждого разведения эталонного фага вносят в чашки
Петри и заливают приготовленной смесью питательного агара и E.coli К12
+
F Str-r. Посевы инкубируют при 37 ЬC 18 - 24 часа. Пробирки с
разведениями закупоривают резиновыми или силиконовыми пробками и
хранят до получения результатов при температуре 4 - 8 град.C.
После инкубации просчитывают количество бляшек на чашках. Учету
подлежат чашки, на которых отмечается рост 30 - 100 негативных колоний
фага.
7 8
Для использования допускается культура с титром более 10 - 10 .
7
При получении титра менее 10 фаг можно размножить. Для нарастания
титра необходимо повторить описанную процедуру.
После выполнения работ с культурами фагов необходимо провести
тщательную обработку помещения дезсредствами и обеззараживания
ультрафиолетовым излучением.
Раздел составлен на основе:
бактериологического контроля питательных сред. Методические
рекомендации в помощь бактериологам санитарно-эпидемических станций и
больниц. Хабаровск, 1979;
Методических рекомендаций к контролю питательных сред по
биологическим показателям. М., 1980;
ФС 42-3588-98. Питательная среда для выделения сальмонелл сухая
(висмут-сульфит агар), срок действия до 15.10.03;
сборника инструкций по общим методам контроля стерильности,
физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих
агентов и токсичности медицинских иммунобиологических препаратов. Утв.
Приказом МЗ СССР N 31 от 13.01.83;
Руководства по аккредитации для лабораторий, производящих
микробиологическое тестирование;
ISO 10705-1:1995 "Water quality - Detection and enumeration of
bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA
bacteriophages";
ISO 10705-1:1995 "Water quality - Detection and enumeration of
bacteriophages - Part 2: Enumeration of somatic bacteriophages".
11. КОНТРОЛЬ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
Качество питательных сред является одним из важнейших факторов,
влияющих на достоверность результата анализа. Жесткая регламентация
приготовления питательных сред и выполнения комплекса процедур
внутреннего контроля качества является неотъемлемой частью обеспечения
достоверности, а также воспроизводимости и повторяемости результатов
количественных микробиологических анализов.
На конечный результат качества готовой питательной среды может
оказать влияние множество различных моментов. Поэтому контроль
качества питательных сред должен осуществляться на всех этапах
технологического процесса, начиная от момента закупки среды до
непосредственного использования в анализе, и включать следующие этапы:
1. Проверку документации и визуальный контроль питательных сред
при их получении.
2. Контроль условий и сроков хранения питательных сред.
3. Контроль питательных сред на этапе приготовления.
4. Контроль биологических свойств питательных сред.
5. Контроль на этапе использования питательных сред.
Данный раздел регламентирует процедуры внутреннего контроля
качества питательных сред, которые используются для выполнения
текущего производственного и государственного санитарно -
эпидемиологического контроля воды по санитарно - микробиологическим
индикаторным показателям. Применение питательных сред без
подтверждения их качества не допускается. Результаты выполнения
процедур контроля качества должны быть документально зафиксированы.
11.1. Проверка документации и визуальный контроль
питательных сред
Данный этап контроля позволяет избежать покупки продукции у фирм,
не имеющих надлежащих документов, удостоверяющих и гарантирующих ее
качество, а также выявить грубые нарушения, возникшие при
транспортировании (разгерметизация упаковки, несоответствие внешнего
вида обезвоженной среды или отдельных компонентов описанию
изготовителя и др.). Контроль осуществляют при каждом поступлении в
лабораторию новых сред.
При первом контакте с фирмой, производящей и (или) реализующей
питательные среды, необходимо затребовать копии лицензии на право
производства и реализации данных питательных сред. Обязательным
условием поставки питательных сред является наличие следующих
сопроводительных документов:
1. Копии сертификата соответствия на реализуемую среду.
2. Паспорта отдела контроля организации-изготовителя на
реализуемую серию препарата.
3. Инструкции по применению.
Среды импортного производства должны иметь сертификаты качества
серии ISO 9000.
При получении питательных сред необходимо проверить целостность
упаковки (оценивается визуально) и наличие сопроводительной
документации (сертификата соответствия, паспорта, инструкции по
применению, этикеток на упаковках). Сопроводительная документация
должна содержать следующую информацию:
- название среды и ее назначение;
- название предприятия-изготовителя;
- номер серии;
- номер протокола контрольных испытаний;
- дата изготовления;
- срок годности;
- состав среды;
- условия хранения;
- рецептура приготовления;
- описание внешнего вида и консистенции сухой и готовой среды;
- условия и длительность хранения готовой среды.
Обо всех обнаруженных отклонениях необходимо сообщить
руководителю лаборатории.
11.2. Контроль условий и сроков хранения
питательных сред
Данный этап контроля позволяет обеспечить правильность и
постоянство условий хранения сред, а также своевременное пополнение их
запаса.
Контроль осуществляют 1 раз в неделю или чаще.
Сухие питательные среды и реактивы, если не указаны особые
условия хранения, необходимо поместить в сухое, защищенное от света
место с температурой воздуха 10 - 25 ЬC.
Материалы, требующие пониженной температуры хранения, необходимо
поместить в холодильник с соответствующей степенью охлаждения.
Особое внимание следует уделить сохранению герметичности вскрытых
упаковок со средами, т.к. повышение влажности и комкование сухой
питательной среды существенно ухудшает ее качество. Если питательная
среда упакована в пакет из ламинированной бумаги и весь объем среды не
используется за один раз, то после вскрытия пакета оставшуюся часть
среды желательно перенести в чистую сухую емкость оранжевого стекла
(или другого светозащитного инертного материала) с плотно
закрывающейся крышкой.
Готовые питательные среды хранят при температуре (2 - 8) град.C.
Срок хранения готовой питательной среды определяется изготовителем.
Сухие питательные среды с истекшим сроком годности, но с
неизменившимися цветом и консистенцией, подвергают количественным
методам контроля питательных сред по биологическим показателям с целью
принятия решения о продлении срока годности.
Все приготовленные среды следует промаркировать с указанием
названия среды, а также даты приготовления и срока годности. Дату
приготовления питательной среды заносят в журнал (Прилож. 8.1).
Контейнеры (флаконы) с завинчивающимися крышками более пригодны
для продолжительного хранения готовых жидких и плотных питательных
сред, нежели чашки Петри или емкости с ватно-марлевыми пробками.
Температуру воздуха в местах хранения питательных сред проверяют
1 раз в неделю. Результаты проверки заносят в журнал регистрации
температур.
11.3. Контроль питательных сред
на этапе приготовления
Для приготовления питательных сред и растворов, используемых в
микробиологическом анализе, допускается применение химических веществ
по степени чистоты не ниже ЧДА. Требования к качеству воды для
приготовления питательных сред для микробиологических анализов
изложены в разделе 7.
При условии, что приобретена продукция надлежащего качества,
одним из основных факторов, определяющих качество и дальнейшую
пригодность питательной среды, является правильность ее приготовления.
Приготовление сред должно осуществляться со строгим соблюдением
рецептуры приготовления и условий стерилизации, определенных
изготовителем.
Контроль питательных сред на этапе приготовления включает:
- оценку внешнего вида готовой среды;
- измерение pH готовой среды;
- определение стерильности (отсутствия контаминации) готовой
среды;
- постановку качественного контроля биологических свойств среды
(раздел 11.4.1).
Контроль питательных сред на этапе приготовления проводят каждую
варку.
11.3.1. Оценка внешнего вида готовой среды
Оценку внешнего вида питательной среды проводят визуально.
Цвет, прозрачность и консистенция сухой и приготовленной среды
должны быть типичны для данного продукта и соответствовать описанию
изготовителя.
Некоторыми очевидными ошибками при приготовлении сред являются:
- потемнение среды вследствие перегревания и недостаточного
перемешивания;
- неполное растворение порошкообразной среды;
- образование осадка.
В агаризованных средах осадок может образовываться вследствие
продолжительной стерилизации, повторных плавлений твердого агара или
длительного содержания расплавленного агара при высокой температуре.
В этих случаях появление осадка свидетельствует о непригодности
питательной среды.
Кроме того, агаризованные среды могут образовывать хлопьевидный
осадок, если расплавленная среда остается в водяной бане при
температуре от 43 до 45 ЬC более 30 мин., вследствие начинающегося
процесса застывания агара. Такой хлопьевидный осадок агара можно
рассеять путем повторного нагревания среды до 60 ЬC.
11.3.2. Измерение pH
Значение водородного показателя определяют с помощью pH-метра,
для агаризированных сред - бумажной индикаторной системы с шагом
измеряемого диапазона не более 0,3 единиц. Определение проводят
согласно инструкции по использованию прибора или индикаторной системы.
Величину водородного показателя измеряют у стерилизованной среды,
а при работе с плотной средой измеряют у стерилизованной среды после
ее отвердения. Результаты регистрируют в журнале (Прилож. 8.1).
Отклонение pH среды за пределы диапазона, указанного в паспорте,
приводит к ухудшению ее биологических свойств, вплоть до полной
непригодности.
Отклонения водородного показателя или другие проблемы с pH могут
быть вызваны:
- перегревом;
- недостаточным перемешиванием;
- чрезмерной стерилизацией;
- использованием щелочного стекла;
- загрязнением емкостей, в которых готовилась среда;
- дистиллированной водой низкого качества.
11.3.3. Определение стерильности
Определение стерильности (для стерилизуемых сред) и отсутствия
контаминации (для нестерилизуемых сред) проводят путем инкубации чашки
или пробирки с исследуемой средой в термостате при температуре и в
течение времени, определенных для этих сред методическими документами
по исследованию воды.
По истечении срока инкубации на (в) исследуемых питательных
средах должны отсутствовать визуально определяемые признаки роста
микроорганизмов.
Результаты регистрируют в журнале (Прилож. 8.1).
11.4. Контроль биологических свойств питательных сред
Оценка биологических (ростовых) свойств питательных сред
проводится по следующим показателям.
Чувствительность - максимальное разведение тестовой культуры, при
котором на всех засеянных чашках (во всех пробирках) обнаруживается
рост.
Скорость роста - минимальное время инкубации после посева
культур, достаточное для визуального выявления роста (выражается в
часах).
Дифференцирующие свойства - оцениваются по выраженности основных
отличительных признаков, характеризующих рост тестовых штаммов на
данной питательной среде.
Кроме того, для дифференциальных сред необходимо определять
ингибирующее действие среды. Ингибирующее действие среды определяется
как в отношении основного тестового микроорганизма, так и по отношению
к сопутствующим микроорганизмам.
Оценка ингибирующих свойств проводится по двум показателям.
Процент извлекаемости - процентное соотношение среднего значения
количества колоний, выросших на исследуемой среде, к среднему значению
количества колоний, выросших на контрольной среде.
Показатель ингибиции - степень подавляющего воздействия на
постороннюю микрофлору, выражается минимальным разведением, при
котором полностью отсутствует рост посторонней флоры.
Основным тестовым микроорганизмом для оценки биологических
свойств среды, используемых для текущего санитарно -
бактериологического контроля воды, является E.coli.
Дополнительно используются следующие тест - штаммы:
- для выявления дифференцирующих свойств среды - Shigella sonnei
"S-form" в качестве вида, не ферментирующего лактозу;
- при определении показателя ингибиции посторонней микрофлоры -
Staphylococcus aureus.
Контроль биологических свойств готовых питательных сред включает
два этапа: качественный и количественный контроль, каждый из которых
имеет свое целевое предназначение.
Задачей качественного контроля является выявление грубых
нарушений технологии приготовления, приводящих к выраженному снижению
ростовых и (или) дифференцирующих свойств. Качественный контроль
проводят после каждой варки среды.
Количественный контроль позволяет выявлять относительные
изменения (ухудшение) ростовых свойств из-за ряда причин, возникающих
на этапах транспортирования, хранения, приготовления, стерилизации, а
также при изменении технологических требований в процессе производства
питательных сред, в результате которых они оказываются менее
эффективными.
Количественный контроль выполняется:
- при поступлении каждой новой партии среды;
- при необходимости решения вопроса о продлении срока годности
среды либо возможности ее дальнейшего использования в случае выявления
нарушений условий хранения.
Учитывая, что разные серии питательных сред одного производителя
иногда имеют различие по качеству, контролю подлежит каждая серия
среды поступившей партии.
Количественный контроль также может служить инструментом выбора
более эффективной среды среди продукции, предлагаемой на современном
рынке.
11.4.1. Качественный контроль
В процессе качественного контроля оценивают принципиальную
способность основного тестового штамма расти на данной среде, а также
наличие характерных дифференцирующих признаков для специфических сред.
Качественный контроль выполняется лабораторией после каждой варки
питательной среды.
Методика исследования
Накануне исследования тестовую культуру готовят, как указано в п.
10.2.4.
Контроль выполняют путем посева тестового штамма в жидкие,
полужидкие или на плотные питательные среды с помощью общепринятых
методик. Для плотных сред метод посева должен обеспечивать получение
изолированных колоний микроорганизмов (например, метода "штриха").
Пробирки и чашки с посевами инкубируют в термостате при (37 +/- 1)
град.C в течение 18 - 24 часов.
Оценка результатов качественного контроля
Среду считают пригодной, если по истечении срока инкубации
тестовый штамм дает хорошо различаемый рост со всеми типичными для
него отличительными признаками, которые предполагается выявлять на
данной среде.
Этими признаками могут быть: помутнение жидкой или полужидкой
среды, изменение цвета, образование газа, отличительная форма,
структура, окраска колоний, наличие и диаметр зоны изменения цвета и
прозрачности среды вокруг колоний. Результаты качественного контроля
заносят в журнал (Прилож. 8.1).
11.4.2. Количественный контроль
Выполнение количественного контроля должно осуществляться
лабораторией, имеющей лицензию на работу с необходимыми патогенными
микроорганизмами, аттестованной (аккредитованной) в этой области и
располагающей персоналом соответствующей квалификации.
11.4.2.1. Подготовительный этап
Питательные среды
Для исследования следует использовать свежеприготовленные среды
одной варки. Исследуемые и контрольные среды готовят согласно
инструкции изготовителя.
Среды, предназначенные для прямого поверхностного посева,
разливают в чашки Петри слоем не менее 2 мм и предварительно
асептически подсушивают одним из следующих способов:
1. Перевернутые чашки Петри с открытыми крышками выдерживают в
термостате или сушильном шкафу при температуре 25 - 50 град.C до
исчезновения капель влаги с поверхности агара. Не пересушивать!
2. Закрытые неперевернутые чашки Петри выдерживают в ламинарном
боксе в течение ночи.
3. Чашки Петри с полуоткрытыми крышками помещают в ламинарный
бокс на 30 мин.
В качестве неселективной среды при определении ингибирующих и
дифференцирующих свойств контролируемой среды используют мясопептонный
агар, питательный агар на основе гидролизата кильки, рыбной муки
(ГРМ-агар) и их аналоги.
Разбавитель
Для исследования необходимо использовать стерильный
физиологический раствор, содержащий 0,1% (по массе) пептона. Это
сводит до минимума воздействие разбавителя на микроорганизмы. При
невозможности приготовления данного разбавителя допускается
использование стерильного физиологического раствора без пептона.
Подготовка инокулята
За два дня до исследования тестовую культуру микроорганизма
пересевают со среды хранения на скошенный питательный агар согласно п.
10.2.4. На следующий день из полученной агаровой культуры с
использованием стандарта мутности готовят суспензию тестового штамма в
9
стерильном разбавителе с концентрацией 10 кл/мл и десятикратные
серийные разведения (по 8 разведение включительно) согласно п. 9.
Для контроля разбавления из 6 и 7 разведения высевают по 0,1 мл
(100 мкл) суспензии прямым поверхностным посевом на чашки с
питательным агаром. Из каждого разведения делают по три таких посева.
После высева пробирки с разведениями немедленно переносятся в
холодильник. Чашки с посевами инкубируют в термостате при (37 +/- 1)
град. C в течение 18 - 24 часов.
В день исследования для каждой серии посевов подсчитывают среднее
число колоний, выросшее на трех чашках. При правильно выполненном
разведении среднее количество колоний, выросших при посеве 0,1 мл
суспензии тестового микроорганизма из 6-го разведения, должно
составлять около 100 КОЕ. Соотношение полученных средних значений при
посеве из 6 и 7 разведений должно быть близко к 10:1.
В случае, если концентрация микроорганизмов в разведениях
значительно отклоняется от расчетной и (или) не соблюдена кратность
разведения, данный инокулят тестового штамма не пригоден для
дальнейшего использования. Подготовку инокулята необходимо повторить.
Для показателей, требующих определения количества внесенных
микроорганизмов, рассчитывают посевную дозу. Посевная доза - объем
конкретного разведения, содержащий необходимое для посева количество
жизнеспособных клеток тестового микроорганизма. Расчет дозы выполняют,
основываясь на ранее определенных концентрациях тестового
микроорганизма в 6 и 7 разведениях, исходя из требований, что посев на
одну чашку не должен превышать 50 - 100 микробных клеток. При
правильно выполненном разведении посевная доза составляет 50 - 100 мкл
суспензии из 6 разведения.
После расчета посевной дозы определяют необходимое количество
повторов посевов (не менее 5) исходя из расчета, что суммарное
количество колоний на всех чашках на одной среде должно составлять не
менее 200 КОЕ.
Приготовленные суспензии можно использовать, если они были
охлаждены сразу же после приготовления и произведения контрольных
высевов и не хранились более 24 часов. Перед исследованием инокулят
следует тщательно перемешивать, чтобы добиться однородности суспензии
микроорганизмов.
11.4.2.2. Методики посевов
Посев в жидкую питательную среду
Данный метод посева используется при количественном определении
показателей ростовых и дифференцирующих свойств жидких и полужидких
питательных сред. Суспензию нужного разведения тестовой культуры
тщательно перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Посевную дозу
суспензии асептически помещают при помощи пипетки в пробирку с
исследуемой питательной средой и перемешивают. Инкубируют в термостате
при (37 +/- 1) град. C в течение 18 - 24 часов.
Посев прямым поверхностным методом
Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно
перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Посевную дозу суспензии
асептически помещают при помощи пипетки на поверхность заранее
подготовленной питательной среды (п. 11.4.2.1). Стерильным шпателем
культуру распределяют по поверхности питательного агара, чтобы
добиться равномерного распределения инокулята. После впитывания
инокулята чашки переворачивают и инкубируют в термостате при (37 +/-
1) ЬC в течение 18 - 24 часов.
11.4.2.3. Определение показателей
"чувствительности" и "скорости роста"
Методика исследования
При определении показателей чувствительности и скорости роста
используют по 0,1 мл из 5, 6, 7 и 8 разведений для посева на плотные
питательные среды и по 1,0 мл из 4, 5, 6, 7 - для посева в жидкие
среды. Разведения готовят и контролируют, как указано в п. 11.4.2.1.
Посев каждой дозы инокулята выполняют не менее чем на 3 чашки или
пробирки в соответствии с пунктом 11.4.2.2. Посевы инкубируют при 37
ЬC в течение 24 часов. Визуальный учет скорости роста культуры в
каждом взятом в опыт разведении микробной взвеси производят для
плотных сред через 12 и 24, а для жидких - через 3, 6 и т.д. часов
инкубации.
Оценка результата
Чувствительностью среды считается наибольшее разведение исходной
суспензии тестового штамма с исходной концентрацией около
9 10 КОЕ/мл, обеспечивающее формирование колоний на всех засеянных
чашках или визуально видимый рост во всех пробирках с исследуемой
средой.
Чувствительность среды должна соответствовать параметру,
указанному изготовителем в паспорте данной среды. Если данный параметр
изготовителем не указан, то чувствительность должна составлять не
менее чем 0,1 мл суспензии из 6 разведения для плотных и 1 мл
суспензии из 7 разведения для жидких питательных сред.
При отсутствии роста в одной пробирке или на одной чашке с
посевом разведения, указанного в паспорте как чувствительность, опыт
повторяется на удвоенном числе пробирок или чашек. Приемлемым
считается наличие роста в 5 посевах оцениваемого разведения из 6. Если
при повторном исследовании чувствительность среды не соответствует
паспортному значению, то ее бракуют.
Скорость роста контрольной культуры - минимальное время инкубации
посевов, за которое при соответствующем разведении обеспечен
отчетливый, видимый невооруженным глазом рост культуры во всех
пробирках с жидкими питательными средами (помутнение, наличие пленки,
изменение цвета среды) или формирование типичных, легко
дифференцируемых колоний на чашках с плотной средой.
Скорость роста не должна превышать время инкубации, указанное в
нормативных документах для исследований, в которых эта среда
используется.
Результат заносят в протокол оценки питательной среды по
биологическим показателям (Прилож. 8.2).
11.4.2.4. Оценка дифференцирующих свойств
среды Эндо и ее аналогов
Для оценки дифференцирующих свойств сред используют два тестовых
штамма, отличающихся по основному дифференцируемому признаку
+ -
ферментации лактозы E.coli (Lac ) и Shigella sonnei (Lac ).
Подготовка инокулятов
Разведения тестовых штаммов готовят, как указано в п. 11.4.2.1.
Посевная доза должна содержать 50 - 100 микробных клеток на чашку,
рассчитанная по контрольному посеву.
Методика исследования
Из разведений тестовых штаммов, содержащих исходя из контрольных
посевов 500 - 1000 микробных клеток в 1 мл, готовят 3 смеси:
+ -
1. По 1 мл каждого штамма E.coli (Lac ) и Shigella sonnei (Lac ).
+
2. По 1 мл штамма E.coli (Lac ) и разбавителя.
-
3. По 1 мл штамма Shigella sonnei (Lac ) и разбавителя.
Приготовленные смеси тщательно перемешивают. Из каждой смеси в
соответствии с рассчитанной посевной дозой (по 50 - 100 мкл) засевают
поверхностным методом не менее чем на 3 чашки с исследуемой средой.
Посевы инкубируют при (37 +/- 1) ЬC в течение 18 - 24 часов.
По окончании инкубации учитывают выраженность дифференциальных
+
признаков при росте колоний тестового микроорганизма E.coli (Lac ),
ферментирующего лактозу на исследуемой среде (характерный цвет
колоний, среды), и их отсутствие в посевах тестового штамма Shigella
-
sonnei (Lac ), не обладающего способностью к ферментации лактозы.
Оценка результатов
Дифференцирующие свойства среды считают удовлетворительными, если
она обеспечивает определенный в паспорте перечень признаков и степень
их выраженности у тестового штамма, обладающего искомыми свойствами.
Результат заносится в протокол оценки питательной среды по
биологическим показателям (Прилож. 8.2).
11.4.2.5. Определение процента извлекаемости
(% всхожести)
Этот показатель позволяет выявить и оценить наличие и степень
ингибирующего влияния исследуемой среды на E.coli по сравнению с
контрольной средой. В качестве контрольной используют ранее
проведенную неселективную среду.
Определение процента извлекаемости (% всхожести) особенно важно
для сред, используемых в методах прямого количественного подсчета
(прямой посев исследуемой воды на чашку или фильтр), где наличие даже
относительного ингибирующего влияния среды на искомые микроорганизмы
будет искажать результат и снижать чувствительность метода.
Методика исследования
Готовят инокуляты для посева и осуществляют расчет посевной дозы,
как указано в п. 11.4.2.1. Посев на контрольную и исследуемую среду
выполняют прямым посевом согласно п. 11.4.2.2.
Чашки с посевами инкубируют в термостате при (37 +/- 1) град.C в
течение 18 - 24 часов.
После инкубации подсчитывают количество колоний, выросших на
каждой чашке. Общее количество колоний во всех повторах (не менее 5)
на контрольной неселективной среде должно быть не менее 200. Вычисляют
среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на
контрольной и исследуемой средах.
Обработка результатов
Процент извлекаемости рассчитывают по формуле:
----------------------------------------------------------------------
| С |
| ис |
| В % = --- x 100%, |
| сх С |
| кс |
----------------------------------------------------------------------
где:
В % - процент всхожести на исследуемой среде;
сх
С - среднее арифметическое значение количества колоний, выросших
ис
на исследуемой среде;
С - среднее арифметическое значение количества колоний, выросших
кс
на контрольной среде.
Оценка результатов
Среда признается приемлемой при условии, что различие между
средними значениями количества колоний на контрольной и исследуемой
средах недостоверно. При этом, как правило, % извлекаемости
(всхожести) составляет не менее 80%.
Расчет достоверности различий средних значений количества
колоний, выросших на контрольной и исследуемой средах, приведен в
Прилож. 10.
Результат заносится в протокол количественной оценки питательной
среды по биологическим показателям (Прилож. 8.2).
В случае получения достоверного различия результатов исследование
повторяют, удваивая количество повторов: не менее 10 чашек с общей
численностью количества учитываемых колоний на неселективной среде не
менее 400.
11.4.2.6. Оценка показателя ингибиции
Для оценки ингибирующих свойств среды Эндо (и ее аналогов) по
отношению к микробам-ассоциантам используют тестовый штамм
Staphylococcus aureus.
Подготовка инокулята
Разведения тестового штамма готовят и контролируют, как указано в
п. 11.4.2.1.
Методика контроля
-1 8
Взвесь штамма-ассоцианта из разведений 10 (10 микробных клеток в
мл) по 100 мкл засевают на 3 чашки Петри с испытуемой и контрольной
(неингибиторной) средами. В качестве контрольной среды используется
питательный агар. Через 24 - 48 часов инкубации при температуре (37
+/- 1) град. C определяют число колоний, сформировавшихся на
испытуемой и контрольной средах.
Оценка результатов
Ингибирующие свойства среды являются удовлетворительными, если в
-1
разведении 10 отсутствует рост микроба-ассоцианта при наличии роста в
контрольных посевах. Результат заносят в протокол оценки питательной
среды (Прилож. 8.2).
11.4.3. Рекомендации по сравнительной оценке
эффективности питательных сред с использованием
мембранных фильтров
Основным методом концентрирования в санитарно-бактериологических
исследованиях воды является фильтрование через мембранные фильтры.
Введение дополнительного фактора, мембранного фильтра, в систему
"микроорганизм - питательная среда" может оказать влияние на
показатели роста микроорганизмов и биологические свойства среды.
В настоящее время ведущие зарубежные производители питательных
сред выпускают среды, обеспечивающие своим составом оптимальные
условия роста микроорганизмов при использовании мембранных фильтров и
целенаправленно предназначенные для исследования воды мембранным
методом. В отличие от своих аналогов для клинических исследований или
прямых посевов воды без концентрирования эти среды имеют индекс m,
например: m Endo agar.
В нашей стране подобные среды пока не производятся и в
нормативных требованиях к качеству питательных сред такой важный
момент, как комплексная оценка системы "микроорганизм - фильтр -
среда", не нашел отражения.
Тем не менее, в случаях необходимости сделать выбор между
средами, предлагаемыми разными производителями, оценка качества среды
в комплексе с используемыми в анализе мембранными фильтрами, наряду с
перечисленными в п. п. 11.1 - 11.4.2 исследованиями, будет
способствовать повышению объективности получаемых результатов, а в
отдельных случаях может стать определяющим фактором в принятии
решения.
Однозначно признано, что исследования, выполненные на чистых
культурах модельных микроорганизмов, не могут учесть влияния всего
многообразия микроорганизмов естественных водоемов. В этой связи, при
проведении сравнительной оценки дифференцирующих и ингибирующих
свойств различных сред, может оказаться полезным использование
природной воды для приближения к натурным условиям.
Однако при выполнении этих исследований необходимо всегда иметь в
виду наличие индивидуальных особенностей каждого водоема, а также
нестабильность во времени как микробиологических характеристик
природных вод, так и уровней химического загрязнения. Эти факты
существенно снижают важность полученных результатов и ограничивают их
применение конкретным водоемом.
С учетом изложенного описанная методика носит рекомендательный
характер.
11.4.3.1. Подготовительный этап
Мембранные фильтры
Процент извлекаемости используемых мембранных фильтров должен
составлять не менее 80% на полноценной неселективной среде. Мембранные
фильтры должны быть стерильными.
Питательные среды
Питательные среды для посева мембранных фильтров не
подсушиваются, но на поверхности разлитых в чашки сред не должно быть
видимой влаги.
Подготовка инокулята
Подготовку инокулята тестовых культур микроорганизма
осуществляют, как указано в п. 11.4.2.1. В качестве тестовой культуры
используют модельный штамм E.coli M17-02. Посевная доза на фильтр
должна составлять от 25 до 100 КОЕ для фильтров диаметром 47 мм и 25 -
60 КОЕ для фильтров диаметром 35 мм.
Расчетное засеваемое общее количество тестовых микроорганизмов
должно быть не менее 200, при количестве повторов - не менее 5.
Природная вода используется как естественный источник водных
сапрофитов для оценки ингибирующих и дифференцирующих свойств
исследуемых сред. За сутки до начала исследований природная вода,
предназначенная для подготовки инокулята, должна быть оценена по
общепринятым методикам на общее содержание микроорганизмов (ОМЧ) и
наличие искомых колиформных микроорганизмов и до начала основных
исследований помещена в холодильник.
По результатам выполненных контрольных посевов рассчитывают
необходимый объем природной воды. Объем инокулята природной воды
должен содержать сотни - тысячи сапрофитных микроорганизмов.
Использование обедненных по микробному составу природных вод в данных
исследованиях нецелесообразно.
В установленный по содержанию сапрофитных микроорганизмов объем
природной воды вносят расчетную посевную дозу тестового микроорганизма
(E.coli).
Если природная вода содержит достаточное количество колиформных
бактерий для посева требуемого количества на один фильтр, модельные
микроорганизмы не используются. При необходимости природная вода может
быть разведена в 10 и более раз.
11.4.3.2. Посев методом мембранной фильтрации
Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно
перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Предварительно
рассчитанную посевную дозу суспензии вносят в пробирки, содержащие не
менее 10 мл разбавителя. Содержимое пробирок тщательно перемешивают.
Количество пробирок, содержащих посевную дозу тестового
микроорганизма, должно соответствовать количеству предполагаемых
посевов методом мембранной фильтрации.
Фильтровальную установку готовят согласно общепринятым
процедурам. Контроль стерильности фильтровальной установки проводят,
как указано в п. 6.5. Стерильным пинцетом помещают мембранный фильтр
на основание держателя фильтра и присоединяют фильтровальную воронку.
При отключенном вакууме прибавляют 20 - 30 мл стерильного разбавителя
или стерильной дистиллированной воды. Содержимое пробирки с посевной
дозой тщательно перемешивают и асептически переносят в воронку с
разбавителем, включают вакуум и отфильтровывают.
Дважды, при включенном вакууме, ополаскивают воронку 20 - 30 мл
стерильного разбавителя или стерильной дистиллированной воды.
Вакуум отключают, снимают фильтровальную воронку и стерильным
пинцетом переносят мембранный фильтр с основания на питательную среду.
Между мембранным фильтром и поверхностью агара не должно быть
пузырьков воздуха. Чашки с посевами переворачивают и инкубируют в
термостате при (37 +/- 1) ЬC в течение 18 - 24 часов.
Посев инокулята природной воды осуществляется аналогично
описанному выше с коррективами в отношении объема инокулята природной
воды, который может быть 10 мл и более. В этом случае вносят
соответствующее меньшее количество разбавителя или стерильной
дистиллированной воды. Обязательно проводят двойное споласкивание
воронки, как указано выше.
11.4.3.3. Методика сравнительных исследований
На первом этапе осуществляют отбор сред по параметрам, описанным
в п. п. 11.1 - 11.3, 11.4.1 - 11.4.2.4.
На втором этапе отобранные среды оценивают по показателю "процент
извлекаемости" с использованием двух способов посевов: прямого (по п.
11.4.2.5) и методом мембранных фильтров. Для каждой исследуемой среды
и варианта посева должно быть выполнено не менее 5 повторов.
Контролями служат прямой посев (контроль N 1) и посев мембранным
методом (контроль N 2) на неселективную среду.
При необходимости могут быть проведены параллельные
дополнительные исследования с инокулятом природной воды. Инокуляты
природной воды с внесенными тестовыми микроорганизмами (или без них)
засевают методом мембранных фильтров на исследуемые селективные среды.
Учет результатов
Рассчитывается среднее количество колоний для каждой среды,
способа посева и контрольных посевов. Общее количество колоний
тестового микроорганизма на неселективной среде при посеве прямым
методом должно быть не менее 200.
Согласно разделу 12 подтверждают качество используемых в
эксперименте мембранных фильтров путем расчета "процента
извлекаемости" для мембранных фильтров по средним результатам
контрольных посевов (прямого N 1 и мембранного N 2) на неселективный
агар.
Далее по п. 11.4.2.5 производят расчет процента извлекаемости и
оценку достоверности различий для исследуемых сред. Контрольным
результатом при этом служит среднее количество колоний, выросших при
прямом посеве на неселективном агаре (контроль N 1).
При посевах природной воды с дополнительным внесением тестовых
микроорганизмов в дальнейших расчетах учитывают полученные накануне
результаты контрольного посева на наличие колиформ. Далее процент
извлекаемости рассчитывается так же, как и в исследованиях с чистыми
культурами: в сравнении с результатами прямого посева тестовых
микроорганизмов на неселективный агар (контроль N 1).
В случае посевов природной воды без дополнительного внесения
тестовых микроорганизмов оценивают достоверность различий результатов,
полученных при посевах на исследуемые среды.
При получении недостоверных различий результатов исследований для
выбора наиболее оптимальной среды необходимо проанализировать
следующие характеристики:
- четкость проявления дифференцирующих признаков для тестового
микроорганизма;
- подавление сопутствующей микрофлоры;
- выявление ингибирующего действия микробного населения природной
воды на тестовую культуру Е.coli.
11.5. Контроль на этапе использования питательных сред
В процедуре анализа возможны нарушения использования питательных
сред (перегрев, чрезмерная инкубация при высокой температуре и т.д.),
приводящие к ухудшению их ростовых свойств. Кроме того, возможно
неверное толкование полученного результата вследствие слабой
выраженности признака у исследуемого микроорганизма. Контроль на этом
этапе позволяет минимизировать подобные проблемы.
Контроль сред на этапе использования включает:
- контроль температурного режима водяных бань, предназначенных
для поддержания плотных питательных сред в расплавленном состоянии;
- учет времени нахождения среды в расплавленном состоянии;
- постановку положительного и отрицательного контролей в процессе
идентификации микроорганизмов.
Данный вид контроля проводится при каждом использовании
питательных сред.
11.5.1. Контроль температурного режима водяных
бань, предназначенных для поддержания плотных
питательных сред в расплавленном состоянии
Температура водяной бани должна находиться в пределах (47 +/- 2)
град.C.
11.5.2. Контроль времени нахождения питательной
среды в расплавленном состоянии
Питательная среда не должна находиться в расплавленном состоянии
более 8 часов. Повторное плавление плотной питательной среды не
допускается.
11.5.3. Постановка положительного
и отрицательного контролей
Постановку контролей осуществляют в процессе идентификации
микроорганизмов при выполнении подтверждающих тестов.
Тестовые культуры
В качестве тестовой культуры используют штамм Е.coli M17-02.
Подготовка инокулята. Накануне исследования тестовую культуру готовят,
как указано в п. 10.2.4.
Методика контроля
Постановку положительного контроля осуществляют путем внесения
одной петли агаровой культуры тестового штамма в пробирку с
используемой средой (средами) для идентификации. Отрицательным
контролем служит пробирка с аналогичной средой без посева. Обе
пробирки маркируют и помещают в термостат вместе с посевами.
Учет результатов
По истечении срока инкубации в пробирке с положительным контролем
должен наблюдаться хорошо различаемый рост, со всеми типичными для
него отличительными признаками, которые предполагается выявлять на
данной среде. Цвет индикатора среды должен изменяться на цвет,
определяемый в паспорте среды, как положительный результат утилизации
данного углевода. В пробирке с отрицательным контролем среда должна
находиться без изменений. Результаты положительного и отрицательного
контролей заносятся в рабочий журнал основного исследования.
11.6. Ростовые характеристики ряда сред
отечественного производства, применяемых
в санитарно-бактериологическом анализе воды
ГРМ-бульон, питательный бульон и их аналоги
В качественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового
штамма Е.coli в виде диффузного помутнения среды не позднее 18 - 24
часов инкубации при (37 +/- 1) ЬC. В количественном контроле среда
должна обеспечивать рост тестового штамма во всех пробирках при посеве
-7
1,0 мл из разведения 10 не позднее 20 - 24 часов инкубации при (37 +/-
1) град.C.
ГРМ-агар, питательный агар и их аналоги
В качественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового
штамма Е.coli в виде бесцветных прозрачных круглых колоний в S-форме
не позднее 20 - 24 часов инкубации при (37 +/- 1) ЬC. В количественном
контроле среда должна обеспечивать рост тестового штамма Е.coli в виде
бесцветных прозрачных круглых колоний в S-форме на всех чашках при
-6
посеве 100 мкл (0,1 мл) из разведения 10 не позднее 18 - 20 часов
инкубации при (37 +/- 1) град.C.
Если среду предполагается использовать в качестве контрольной в
исследовании по определению показателя ингибиции, то процент всхожести
должен составлять не менее 80% по сравнению со средой ранее
проверенной партии, а различие между ними должно быть недостоверно.
Агар Эндо с добавками
В качественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового
штамма Е.coli в виде красных (малиновых) с металлическим блеском
круглых колоний диаметром 2,0 - 3,0 мм, с образованием зоны потемнения
среды вокруг колонии ("отпечатка") не позднее 20 - 24 часов инкубации
при (37 +/- 1) град.C.
В количественном контроле среда должна обеспечивать рост типичных
колоний Е.coli на всех чашках при посеве 100 мкл (0,1 мл) из
-6
разведения 10 не позднее 18 - 20 часов инкубации при (37 +/- 1)
град.C.
При посеве смеси тест-штаммов должна наблюдаться четкая
дифференциация колоний: в отличие от малиновых колоний Е.coli колонии
шигелл более мелкие с окраской от белого до слабо-розового цвета, без
отпечатка на среде.
Среда должна подавлять рост Staphylococcus aureus при посеве 0,1
-1
мл микробной взвеси из разведения 10 .
Среды с лактозой и глюкозой
(жидкие и полужидкие)
В качественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового
штамма в виде диффузного помутнения среды не позднее 18 - 24 часов
инкубации при (37 +/- 1) ЬC. При этом цвет индикатора среды должен
изменяться на цвет, определяемый в паспорте среды как положительный
результат утилизации данного углевода до кислоты, визуально должно
определяться образование газа в виде наполненных и (или) спавшихся
пузырьков в толще полужидкой среды или скопления газа в поплавке для
жидкой среды.
Количественный контроль для данных сред не проводится.
Железосульфитный агар
Данная среда не выпускается отечественной промышленностью в виде
обезвоженного полуфабриката, а готовится из составных частей ex
temporo, что исключает возможность ее стандартизации. Это приводит к
колебаниям качества среды от варки к варке, что зависит от целого ряда
факторов.
Поэтому вопрос о контроле данной среды или ее аналогов на уровне
производственной лаборатории остается открытым.
Раздел составлен на основе следующих документов:
международного стандарта ISO 9998:1991 (E) "Качество воды -
методы оценки и контроля сред, предназначенных для подсчета колоний
микроорганизмов, используемых при тестировании качества воды";
Методических рекомендаций к контролю питательных сред по
биологическим показателям. М., 1980;
бактериологического контроля питательных сред. Методические
рекомендации в помощь бактериологам санитарно-эпидемических станций и
больниц: МЗ РСФСР. Хабаровск, 1979;
ФС 42-3377-97 "Питательный агар для культивирования
микроорганизмов сухой (ГРМ-агар)";
ФС 42-3378-97 "Питательный бульон для культивирования
микроорганизмов сухой (ГРМ-бульон)";
ФС 42-3504-97 "Питательная среда для выделения энтеробактерий
сухая (агар Эндо)".
12. КОНТРОЛЬ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕМБРАННЫХ ФИЛЬТРОВ
12.1. Общие положения
В практике лабораторий, проводящих санитарно-бактериологический
контроль воды, используются мембранные фильтры диаметром 47 или 35 мм
и средним размером пор 0,45 мкм.
Мембранные фильтры применяются:
- в анализе на общие и термотолерантные колиформные
микроорганизмы;
- в анализе на споры сульфитредуцирующих клостридий.
Качество используемых мембранных фильтров может оказать
существенное влияние на результаты анализа. При этом качество
мембранных фильтров одного производителя может меняться от партии к
партии. При поступлении каждой новой партии фильтров, а также при
необходимости принятия решения о возможности продления сроков годности
осуществляется контроль эффективности мембранных фильтров.
При наличии в поступившей партии нескольких серий фильтров
контроль проводится для каждой серии.
Фильтры, допущенные к проведению анализа, используются
однократно. Повторное применение мембранных фильтров запрещается.
Принцип метода
Эффективность мембранных фильтров определяется путем сравнения
числа колоний микроорганизмов, выросших на полноценной питательной
среде в результате прямого поверхностного посева суспензии культуры
контрольного микроорганизма, и числа колоний, выросших на этой же
среде в результате посева способом мембранной фильтрации.
Оценка эффективности мембранных фильтров осуществляется по
показателю "процент извлекаемости". Мембранные фильтры считаются
пригодными, если при посеве способом мембранной фильтрации вырастает
не менее 80% от числа колоний, полученных при прямом посеве.
Отбор фильтров для контрольного исследования должен проводиться
"слепым" методом, т.е. фильтры для контроля необходимо отбирать
произвольно из разных упаковок анализируемой партии.
12.2. Подготовительный этап
Питательные среды
В качестве неселективной среды можно использовать мясопептонный
агар, питательный агар на основе гидролизата рыбной муки (ГРМ-агар) и
их аналоги. Для выполнения исследования допускаются питательные среды,
прошедшие контроль, как указано в разделе 11. Все используемые среды
следует готовить из одной партии материалов и реактивов в одно и то же
время. Готовую среду разливают в чашки Петри слоем толщиной не менее 2
мм. Чашки со средой, предназначенные для прямого поверхностного
посева, предварительно асептически подсушивают одним из следующих
способов:
1. Перевернутые чашки Петри с открытыми крышками выдерживают в
термостате или сушильном шкафу при температуре 25 - 50 ЬC до
исчезновения капель влаги с поверхности агара. Не пересушивать!
2. Закрытые неперевернутые чашки Петри выдерживают в ламинарном
боксе в течение ночи.
3. Чашки Петри с полуоткрытыми крышками помещают в ламинарный
бокс на 30 мин.
Мембранные фильтры
Исследуемые мембранные фильтры должны быть стерильными.
Тестовые культуры
В качестве тестовой культуры используют штамм E.coli M17-02.
Разбавитель
Для исследования необходимо использовать стерильный
физиологический раствор, содержащий 0,1% (по массе) пептона. Это
сводит до минимума воздействие разбавителя на микроорганизмы. При
невозможности приготовления данного разбавителя допускается
использование стерильного физиологического раствора без пептона.
Подготовка инокулята
За два дня до исследования тестовую культуру микроорганизма
пересевают со среды хранения на скошенный питательный агар, как
указано в п. 10.2.4. На следующий день из полученной агаровой культуры
готовят суспензию тестового штамма в стерильном разбавителе с
9
концентрацией 10 кл/мл. Суспензию и необходимые разведения готовят с
использованием стандарта мутности согласно разделу 9. Из 6 и 7
разведения (~= 1000 и 100 кл/мл, соответственно) высевают по 0,1 мл
суспензии прямым поверхностным посевом на чашки с питательным агаром.
Из каждого разведения делают по три таких посева. Чашки с посевами
инкубируют в термостате при (37 +/- 1)ЬC в течение 18 - 24 часов.
После высева пробирки с разведениями немедленно переносятся в
холодильник. Срок хранения суспензии в холодильнике до использования в
основном исследовании не должен превышать 24 часов.
В день исследования для каждого разведения подсчитывают среднее
число колоний, выросшее на 3 чашках, и исходя из полученных
результатов рассчитывают посевную дозу. Посевная доза должна
составлять от 25 до 100 КОЕ на чашку или фильтр для фильтров диаметром
47 мм и 25 - 60 КОЕ для фильтров диаметром 35 мм. При правильно
выполненном разведении посевная доза, чаще всего, составляет 50 - 100
мкл суспензии из 6 разведения.
12.3. Методика исследования
Выполняются параллельные посевы суспензии чистой культуры
тестового микроорганизма способом мембранной фильтрации через
исследуемые мембранные фильтры и прямым (поверхностным) способом.
Необходимо выполнить, как минимум, пять повторов посева каждым
способом. Количество повторов должно быть достаточным для обеспечения
суммарного значения числа колоний в прямом посеве - не менее 200 КОЕ.
12.3.1. Посев методом мембранной фильтрации
Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно
перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Предварительно
рассчитанную посевную дозу суспензии вносят в пробирки, содержащие 10
мл разбавителя. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Количество
пробирок, содержащих посевную дозу тестового микроорганизма, должно
соответствовать количеству предполагаемых посевов методом мембранной
фильтрации (не менее 5). После подготовки посевного материала пробирку
с разведением культуры тестового микроорганизма, из которой
производился отбор посевных доз для посева фильтрацией, немедленно
переносят в холодильник.
Фильтровальную установку готовят согласно общепринятым
процедурам. Контроль стерильности фильтровальной установки проводят,
как указано в п. 6.5. С помощью стерильного пинцета помещают
мембранный фильтр на основание держателя фильтра. Присоединяют и при
необходимости закрепляют фильтровальную воронку. При отключенном
вакууме прибавляют 20 - 30 мл стерильного разбавителя или стерильной
дистиллированной воды. Содержимое пробирки, содержащей посевную дозу,
тщательно перемешивают и асептически переносят в воронку, содержащую
разбавитель.
Включают вакуум и отфильтровывают содержимое воронки. В пробирку,
ранее содержащую суспензию, вносят 10 мл разбавителя, тщательно
перемешивают и отфильтровывают, после чего дважды, при включенном
вакууме, ополаскивают воронку 20 - 30 мл стерильного разбавителя или
стерильной дистиллированной воды. Вакуум отключают, снимают
фильтровальную воронку и стерильным пинцетом мембранный фильтр
переносят на чашку с питательной средой (п. 11.2). Между мембранным
фильтром и поверхностью агара не должно быть пузырьков воздуха. Посевы
инкубируют в термостате при (37 +/- 1) ЬC в течение 18 - 24 часов.
После инкубации, при условии стерильности фильтровальной
установки, подсчитывают количество типичных колоний, выросших на
каждом фильтре. Вычисляют среднее арифметическое значение количества
колоний, выросших на фильтрах при посеве методом мембранной
фильтрации. Результаты заносят в протокол (Прилож. 9).
12.3.2. Посев прямым поверхностным методом
Для прямого поверхностного посева используют материал из той же
пробирки с разведением культуры тестового микроорганизма, из которой
производился отбор посевных доз для посева фильтрацией.
Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно
перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Предварительно
рассчитанную посевную дозу суспензии асептически помещают при помощи
пипетки на поверхность питательной среды (п. 11.4.2.1). Выполняют не
менее 5 повторов. Стерильным стеклянным шпателем культуру распределяют
по поверхности питательного агара, чтобы добиться равномерного
распределения инокулята. Чашки переворачивают и инкубируют в
термостате при (37 +/- 1) ЬC в течение 18 - 24 часов.
Вычисляют среднее арифметическое значение количества колоний,
выросших на чашках при прямом поверхностном посеве. Общее количество
колоний во всех повторах должно быть не менее 200 КОЕ. Результаты
заносят в протокол (Прилож. 9).
12.3.3. Расчет "процента извлекаемости"
и оценка результатов
Для оценки исследуемых мембранных фильтров вычисляют процент
извлекаемости (удержания) мембранных фильтров по формуле:
----------------------------------------------------------------------
| СЧ |
| мф |
| И% = ---- x 100%, |
| СЧ |
| ч |
----------------------------------------------------------------------
где:
И% - процент извлекаемости (удержания);
СЧ - среднее арифметическое значение количества колоний, выросших
мф
на фильтрах при посеве методом мембранной фильтрации;
СЧ - среднее арифметическое значение количества колоний, выросших
ч
на чашках при прямом поверхностном посеве.
Пригодными считаются мембранные фильтры, имеющие процент
извлекаемости (удержания) >= 80%.
В случае получения менее 80% извлекаемости тестового
микроорганизма исследования следует повторить с удвоенным количеством
повторов (не менее 10), с суммарным учетом по контрольному прямому
посеву не менее 400 КОЕ.
12.3.4. Рекомендации по сравнительной оценке
эффективности различных мембранных фильтров
Описанная методика может быть использована для сравнительной
оценки стабильности качества разных партий фильтров, поставляемых
одним производителем, а также мембранных фильтров разных марок разных
производителей.
В этих целях выполняются следующие процедуры:
- подготовительный этап по п. 12.2;
- посевы методом мембранных фильтров с каждым видом (серией)
фильтров по п. 12.3.1;
- посев прямым поверхностным методом по п. 12.3.2;
- оценка по показателю "процент извлекаемости" по п. 12.3.3.
Проведение дальнейшего сравнения эффективности исследуемых
фильтров, показавших приемлемый "процент извлекаемости" >= 80%,
осуществляется путем оценки достоверности различия средних значений
количества колоний, выросших на мембранных фильтрах разных партий.
Достоверность различия средних значений количества колоний оценивают с
использованием критерия Стьюдента для вероятности 95% (Прилож. 10).
Оценка результатов
Если исследованию повергались различные партии эквивалентных
фильтров, выпускаемых одним изготовителем, то полученные средние
значения количества микроорганизмов для каждой партии фильтров не
должны отличаться с вероятностью 95%.
При сравнении мембранных фильтров разных марок, типов или разных
производителей выбирают мембранные фильтры, среднее число колоний
которых превышает аналогичный показатель для других фильтров с
достоверностью 95%.
Раздел составлен на основе:
международного стандарта ISO 7704-85 "Оценка мембранных фильтров,
используемых для микробиологических анализов" ("Water quality.
Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses").
13. ОСОБЕННОСТИ ПОСТАНОВКИ ТЕСТОВ
НА ЭТАПЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ
Идентификация должна проводиться только с чистой культурой.
Проведение биохимической идентификации штаммов, выделенных на
селективной питательной среде (Эндо или ее аналогах), предпочтительнее
проводить с субкультурой, полученной на одной из неселективных
питательных сред, не содержащих углеводов (ПА, ГРМ-агар, МПА).
Постановка подтверждающих тестов всегда должна сопровождаться
постановкой положительных и отрицательных контролей с эталонными
культурами, ферментативная активность которых определена ранее.
Минимальное количество колоний, необходимое для идентификации,
указано в нормативных документах на данный вид анализа.
Примечание (информационное). Достоверность количественного
результата повышается с увеличением числа идентифицированных колоний.
В частности, ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы
культивирования микроорганизмов" при необходимости подтверждения
характерных колоний требует отбирать не менее 5 изолированных колоний
с пересевом для дальнейшей идентификации на неселективную питательную
среду.
Французским комитетом по стандартизации АФНОР установлены
следующие правила отбора достаточного количества колоний для
подтверждения.
|