Страницы: 1 2
4.7.1.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76
Бутыли стеклянные для химических реактивов
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Колбы плоскодонные конические или круглые
разной вместимости ГОСТ 1770-74
Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81
Полистироловые планшеты U-образные
Пробирки типов П1, П2 ГОСТ 25336-82
Стекла предметные для микропрепаратов ГОСТ 6672-75
Термометр ртутный с диапазоном измерения
от 0 до 100 град. С (цена деления шкалы
1 град. С) ГОСТ 13646-68
Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932-90
Микробиологические петли
4.7.1.3. Реактивы и питательные среды
НД (ФС, ТУ)
Агар микробиологический ГОСТ 17206-84
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
D-глюкоза, ч ГОСТ 6038-79
D-лактоза, 1-водная ТУ 6-09-22-98-79
Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, ч ГОСТ 4198-75
Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный, хч ГОСТ 2493-75
Кислота соляная, хч ГОСТ 3118-77
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4328-77
Масло иммерсионное для микроскопии ГОСТ 31739-78
Набор реактивов для окраски по Граму
Спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300-87
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962-67
Экстракт дрожжевой <*>
Триптон <*>
Антибиотики разных групп <*>
Диски с антибиотиками <*>
--------------------------------
<*> Производства разных фирм, прошедшие государственную
регистрацию и разрешенные к использованию.
Питательные среды:
Для определения количества мезофильных
аэробных и факультативно-анаэробных
микроорганизмов ТУ 9229-083-00419785-97
Питательный бульон ТУ 10-02-02-789-176-94
Питательные среды для определения ТУ 9229-072-00419785-97
энтеробактерий ГОСТ 29184-91
Среды для определения дрожжей и ТУ 9229-083-00419785-97
микроскопических грибов (агар Сабуро,
сывороточный и др.) ГОСТ 10444.12-88
Среды для определения S. aureus
(типа Байд-Паркера, солевой агар) ГОСТ 10444.1, п. 5.1,
п. 5.4
Среды для выращивания бифидобактерий,
молочнокислых и пропионово-кислых бактерий
(ГМС, M17, MRS) ТУ 10-02-02-789-192-95
Планшеты для идентификации культур
производства разных фирм, прошедшие
государственную регистрацию в установленном
порядке и разрешенные к использованию
Реактивы для ряда тестов в зависимости
от идентифицируемого вида ГММ
Стандарт мутности по McFarland
4.7.1.4. Штаммы
ГММ, штамм-реципиент, контрольный
(референтный) штамм того же вида, что и ГММ
Контрольные (референтные) штаммы,
представляющие основные виды резидентной
микрофлоры человека:
Грамположительные облигатно-анаэробные
бактерии
Лактобактерии
Бифидобактерии
Пептострептококки
Грамотрицательные облигатно-анаэробные
бактерии
Бактероиды
Факультативно-анаэробные микроорганизмы
Кишечная палочка
Стафилококки
Стрептококки
Дрожжеподобные грибы рода Candida
Контрольные штаммы, используемые в настоящем разделе, должны
иметь паспортные данные и принадлежать к Американской типовой
коллекции культур (АТСС) или получены из музея живых культур
Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских
биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.
Допускается использование других разрешенных питательных сред и
диагностических тест-систем аналогичного назначения для проведения
исследований фенотипических свойств в соответствии с данным
документом. При их применении необходимо руководствоваться
рекомендациями изготовителя.
Питательные среды и биологические препараты импортного
производства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.
Питательные среды и препараты отечественного производства должны
соответствовать нормативной документации, утвержденной в установленном
порядке.
4.7.2. Сущность метода
Из выращенных на плотных или жидких питательных средах контрольных
штаммов и ГММ, штамма-реципиента и референтного штамма того же вида,
что и ГММ, готовят взвеси микроорганизмов с определенными
концентрациями КОЕ/мл. Далее готовят ряды пробирок с жидкой
питательной средой по 3 мл, на которой способны расти все исследуемые
микроорганизмы (например, триптиказо-соевый или L-бульон), и вносят по
1 3 5
0,5 мл 10 , 10 и 10 КОЕ/куб. см ГММ и такое же количество клеток
контрольного штамма (например, Bifidobacterium). Одновременно
осуществляют посевы на селективные питательные среды в разведениях для
точного подсчета клеток каждого вида микроорганизма. Например, для
точного подсчета количества клеток стафилококков посев осуществляется
на желточно-солевой агар при дальнейшем культивировании при 37 град. С
в течение 48 часов в аэробных условиях, в то время как для определения
количества клеток бифидобактерий взвесь микроорганизмов высевается на
модифицированную среду Блоурока, а культивирование производят в
анаэробных условиях при 37 град. С в течение 48 часов.
Через 6 и 24 часа осуществляют посевы на селективные питательные
среды и подсчитывают число клеток представителя резидентной микрофлоры
и ГММ. Контролями служат посевы, в которых выращивается только
представитель резидентной микрофлоры или ГММ. Вычисляется число клеток
представителя резидентной микрофлоры, выращенного в присутствии ГММ и
отдельно. При приблизительно одинаковом соотношении числа выросших
клеток отдельно и в присутствии ГММ можно считать, что ГММ не обладает
антагонистическим действием. При более высоких показателях числа
выросших клеток обоих видов, чем при выращивании каждого из
представителей в отдельности, можно констатировать, что оба вида
характеризуются симбиотическим действием. При превышении количества
клеток представителя резидентной микрофлоры в 5 и более раз,
выращенного без ГММ, чем в смеси с ГММ, можно полагать
антагонистическое действие ГММ на конкретного представителя нормальной
микрофлоры кишечника. В случае, если такое антагонистическое действие
ГММ проявляется ко всем или большинству из исследованных
представителей нормальной микрофлоры кишечника человека, делается
заключение о невозможности его использования в производстве пищевых
продуктов. При выявлении антагонистического действия ГММ к 1 - 2
представителям нормальной микрофлоры кишечника человека требуются
дополнительные исследования, включающие исследование антагонистической
активности ГММ и штамма-реципиента с представителями резидентной
микрофлоры кишечника человека in vivo, молекулярно-генетические
исследования по выявлению генов, детерминирующих данный феномен.
5. Молекулярно-генетическая оценка ГММ,
используемых для производства пищевой продукции
Необходимость проведения тех или иных исследований по данному
разделу и для каждого конкретного вида пищевой продукции, полученной с
использованием ГММ, определяется экспертом центра по
микробиологической и молекулярно-генетической экспертизе ГММ при ГУ
НИИЭМ им. Гамалеи РАМН. Это обусловлено большим разнообразием
последовательностей чужеродной ДНК, которые могут быть встроены в
геном ГММ. Эксперт обязан проанализировать представленную заявителем
документацию, соответствующие базы данных (в т.ч. и международные) и
составить перечень необходимых исследований в зависимости: 1) от
сложности конструкции ГММ; 2) характера и места использования ГММ в
технологии получения пищевых продуктов; 3) вероятности попадания живых
ГММ в организм человека.
Для точной идентификации таксономического положения и свойств ГММ
(при необходимости - штаммов - доноров и реципиентов) фирма-заявитель
должна представить паспорт штамма и/или справку о депонировании в
национальных или иных международно признанных коллекциях культур
микроорганизмов, в коллекциях научно-исследовательских организаций с
указанием:
1) наименования штамма в соответствии с действующей международной
номенклатурой (род, вид, номер штамма);
2) источника выделения;
3) сведений, подтверждающих безопасное использование данного
штамма и/или продуктов, выработанных с его применением, в питании
людей (Инвентарный перечень GRAS FDA, свидетельства о свободной
продаже в стране-изготовителе); для штаммов - продуцентов ферментных
препаратов и пищевых веществ - сведения о соответствии штамма СанПиН
2.3.2.1293-03 "Гигиенические требования к применению пищевых добавок",
Перечню Комиссии Кодекс Алиментариус, General Requirements, V. 1A;
4) сведений о непатогенности и нетоксигенности;
5) сведений о стабильности генома;
6) сведений о профиле антибиотикорезистентности;
7) сведений о резистентности к кислоте и желчи (для пробиотиков);
8) способности к симбиозу с резидентной микрофлорой ЖКТ (для
пробиотиков);
9) способности к адгезии (для пробиотиков);
10) способности к продукции биологически активных субстанций;
11) способности к иммуностимулирующему эффекту (для пробиотиков).
Для подтверждения таксономического положения штамма заявитель
должен представить информацию об уровне гомологии ГММ (в случае
необходимости штаммов - донора и реципиента) с штаммами этого вида,
допущенными для использования в пищевой промышленности при создании
аналогичной продукции. Также должны быть предоставлены данные
сравнения фенотипических свойств ГММ с характерными фенотипическими
свойствами его вида, описанными в определителе Берги (Bergey`s manual
of systematic bacteriology. Eds. Sneaht P.N.D. et al. Baltimore;
Williams and Wilkins, V. 2, 1986).
Заявитель (поставщик) должен представить информацию о
нуклеотидной последовательности генной вставки, а также материалы,
отражающие молекулярно-биологические характеристики ГММ (см. п. 3.3
настоящих МУ).
5.1. ПЦР-идентификация чужеродного
генетического материала в штаммах ГММ
Согласно рекомендациям ФАО/ВОЗ стратегия выявления генетических
модификаций у микроорганизмов, используемых в производстве пищевых
продуктов, должна быть направлена на выявление максимального
количества потенциальных рисков. Поэтому экспертные исследования
штаммов ГММ должны включать, с одной стороны, подтверждение природы
штамма-реципиента и целевой вставки чужеродной ДНК (согласно
представленной заявителем документации), а с другой стороны, выявлять
наличие возможных генетических модификаций, не указанных в
документации. Рекомендуемые стратегии выявления генетических
модификаций предлагают использовать для этих целей наиболее часто
употребляемые векторные последовательности: селективные гены (гены
антибиотикорезистентности, бактериоцинов или ауксотрофные селективные
маркеры), неэкспрессируемые последовательности (полилинкеры, промоторы
или терминаторы), а также последовательности мигрирующих элементов.
Обнаружение таких последовательностей будет свидетельствовать о
возможных незадокументированных генетических модификациях, что
потребует проведения дополнительных исследований штаммов ГММ. С точки
зрения безопасности пищевые ГММ не должны содержать гены
антибиотикорезистентности, встроенная ДНК не должна кодировать
выработку потенциально опасных веществ, а векторы класса food-grade
должны быть сконструированы таким образом, чтобы свести к минимуму
вероятность передачи нового генетического материала другим
микроорганизмам. Проведение дополнительных исследований может
потребовать использования таких методов, как различные виды
гибридизационного и рестрикционного анализа, секвенирование, анализ
функционирования вставки (ОТ-ПЦР и изучение продукции белка чужеродной
ДНК). Однако основным скрининговым методом является полимеразная
цепная реакция - ПЦР. Специально подобранные пары праймеров будут
использованы как для проверки целевого гена, так и для
последовательностей, свидетельствующих о возможных генетических
модификациях.
В настоящее время методы молекулярной биологии, основанные на
ПЦР-анализе, находят все более широкое применение в целях диагностики
и экспресс-анализа разнообразного биологического материала.
Преимущество подобных методик обусловлено высокой чувствительностью и
специфичностью ПЦР, совместимостью ПЦР-анализа с дополнительными
методами исследования (секвенирование, рестрикционный и
гибридизационный анализы амплифицированных фрагментов, изучение
информационных РНК (ОТ-ПЦР) и транслируемого ими белкового продукта).
Достоинством ПЦР-анализа являются также высокая воспроизводимость
результатов, технологичность проведения анализа в сочетании с
доступностью и сравнительно невысокой стоимостью оборудования для
организации ПЦР-лабораторий.
5.1.1. Метод идентификации целевых генов,
неэкспрессируемых последовательностей и селективных
маркеров, а также подтверждение видовой
принадлежности штамма при помощи ПЦР
5.1.1.1. Создание электронной базы данных
Для полной и надежной идентификации конкретного ГММ необходимо
создать электронную базу данных о целевых, селективных и маркерных
генах, мигрирующих элементах, неэкспрессируемых последовательностях и
регуляторных элементах, а также векторных конструкциях класса
food-grade, которые используются при создании ГММ. В такую базу данных
должна быть включена информация о видоспецифических генах, которые
могут быть использованы для подтверждения таксономической
принадлежности штамма. Также в базу данных должны быть включены
сведения о наличии в коллекциях штаммов ГММ, принадлежащих к 1, 2 и 3
классу безопасности, в различных странах.
Особое внимание при создании электронной базы данных следует
уделить информации о так называемых GRAS (generally recognized as
safe) микроорганизмах, которые чаще всего используются как доноры
генетической информации при конструировании ГММ.
5.1.1.2. Выбор праймеров
Для проведения экспертизы ГММ выбор праймеров должен проводиться
по следующим позициям:
1) для идентификации таксономической принадлежности
микроорганизма (гены 16S/23S рРНК или другие специфические
последовательности);
2) для идентификации целевых генов генетической вставки (гены,
кодирующие продукцию технологически важных ферментов, например таких,
как химозин; гены устойчивости к бактериофагам; гены - регуляторы
уровня кислотности; гены устойчивости к этанолу и другим стрессовым
факторам);
3) для идентификации генов селективных маркеров (гены
устойчивости к антибиотикам, бактериоцинам, ауксотрофным селективным
маркерам);
4) для идентификации маркерных (screenable) векторных генов (гены
Е. coli, кодирующие бета-галактозидазу или бета-глюкоронидазу, или
гены бактериофага Т7, кодирующие РНК полимеразу);
5) для идентификации неэкспрессируемых последовательностей
(полилинкеры, промоторы и терминаторы);
6) для идентификации мигрирующих элементов, используемых для
создания транспозируемых векторов (например, Ту-элементы).
Выбор праймеров должен осуществляться в соответствии с правилами
молекулярного дизайна. Для выбора праймеров должны быть использованы
программы Primer, Oligo или другие аналогичные программы, позволяющие
осуществлять многофакторный анализ выбранных последовательностей.
Должен быть произведен сравнительный анализ выбранных олигонуклеотидов
с помощью программы Blast для исключения наличия областей гомологии с
ДНК родственных и неродственных видов.
Конкретный набор тех или иных праймеров для проведения экспертизы
должен определяться таксономической принадлежностью штамма;
информацией о его генетическом статусе и характере генетических
модификаций, предоставленной заявителем; а также характера и места
использования ГММ в технологии получения пищевых продуктов и
вероятности попадания живых ГММ в организм человека (см. п. 3.4
настоящих МУ). Выбор, синтез и очистка праймеров производится в Центре
по микробиологической и молекулярно-биологической экспертизе ГММ при
ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
5.1.1.3. Выбор условий проведения ПЦР
Условия проведения реакции определяют степень точности и
воспроизводимости результатов, и их отработка должна производиться для
каждой конкретной пары праймеров. Выбор условий проведения ПЦР
включает подбор оптимального соотношения компонентов реакционной
смеси, структуры программы амплификации (временных и температурных
характеристик каждого этапа амплификации) и адекватного метода
детекции результатов. Выбор оптимальных условий проведения ПЦР
обеспечивает высокий уровень чувствительности и специфичности
прохождения реакции, исключающий наличие перекрестных реакций с
неспецифическими ДНК. Выбор оптимальных условий проведения ПЦР
осуществляется сотрудниками Центра по микробиологической и
молекулярно-биологической экспертизе ГММ при ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи
РАМН.
5.1.1.4. Выделение ДНК из культур ГММ и проведение ПЦР
5.1.1.4.1. Аппаратура и инструментарий
НД (ГОСТ, ТУ)
Программируемый термостат (ДНК-амплификатор)
типа "Терцик МС2" или аналоги
Термостат, поддерживающий температуру 45 град. С,
для пробирок объемом 1,5 мл
Центрифуга со скоростью вращения ротора
8000 - 12000 об./мин. для пробирок
вместимостью 1,5 и 0,5 мл типа "Эппендорф"
Прибор для горизонтального электрофореза
Встряхиватель вибрационный (типа "Вортекс")
Водяная баня с подогревом ГОСТ 12026-76
Ультрафиолетовый трансиллюминатор
Холодильная камера на -20 град. С
Пипетки полуавтоматические одноканальные
со сменяемыми наконечниками на 1 - 10,
5 - 40, 40 - 200, 200 - 1000 мкл типа
"Ленпипет"
5.1.1.4.2. Лабораторная посуда и материалы
Пробирки типа "Эппедорф" вместимостью
1,5 мл, совместимые с центрифугой
Пробирки типа "Эппедорф" вместимостью
0,5 мл, совместимые с амплификатором
Наконечники пластиковые на 1 - 200 мкл к
пипеткам полуавтоматическим
Наконечники пластиковые на 200 - 1000 мкл к
пипеткам полуавтоматическим
Перчатки резиновые ГОСТ 3-88
Колбы плоскодонные конические разной
вместимости ГОСТ 1770-74
Штативы для пробирок
5.1.1.4.3. Реактивы
Допускаются к использованию реактивы производства различных
отечественных и зарубежных фирм, прошедшие государственную регистрацию
и разрешенные для использования в установленном порядке.
Трис аминометан
ЭДТА
Хлористый натрий
Бычий сывороточный альбумин
Ацетат калия
Едкий натр
бета-меркаптоэтанол
Водный раствор дезоксинуклетидтрифосфатов
(0,1 М)
Термостабильная ДНК-полимераза
AMV-ревертаза (обратная траснскриптаза)
Бромфеноловый синий
Агароза для электрофореза
Бромистый этидий
Ледяная уксусная кислота
Вода деионизованная ГОСТ 6709-72
Масло вазелиновое ГОСТ 3164-78
5.1.1.4.4. Приготовление основных растворов
1 М Трис рН-7,5. Растворить 121,1 г Трис в 800 мл воды. Довести
рН до необходимого значения добавлением концентрированной HCl и
довести объем до 1 л. Раствор простерилизовать.
0,5 М ЭДТА рН-8,0. К 186,1 г ЭДТА добавить 800 мл воды. Довести
рН до 8,0 NaOH.
5 M NaCl (хч или чда). 29,22 г NaCl растворить в 80 мл воды,
довести объем до 100 мл, простерилизовать.
10%-ный SDS. 10 г SDS растворить в 90 мл воды, чтобы ускорить
растворение можно нагреть раствор до 60 град. С. Довести рН до 7,2
добавлением нескольких капель концентрированной НСl и довести до 100
мл. Внимание! При взвешивании SDS наденьте на лицо маску, т.к. при
попадании на слизистую оболочку носоглотки этот летучий порошок
вызывает сильное раздражение.
5 М Ацетат калия. 49,1 г ацетата калия растворить в 80 мл воды и
довести объем до 100 мл.
70%-ный этанол. Для приготовления 100 мл раствора требуется 73 мл
96% этанола и 27 мл воды.
5.1.1.4.5. Выделение ДНК из штамма ГММ
Для выделения ДНК из штамма ГММ может применяться
фенол-хлороформный или другой адекватный метод. Однако наиболее
надежные результаты в ПЦР дает ДНК, выделенная непосредственно перед
постановкой реакции из замороженной бактериальной пасты по методу
Бирнобойма и Доли:
20 - 40 мкл оттаявшей бактериальной массы суспендируют в 100 мкл
буфера I (50 mМ Трис-HCl, рН 8,0, 5 mМ ЭДТА, 50 мкг/мл РНКазы). К
суспензии добавляют 120 мкл лизирующего буфера (0,2 М NaOH, 1% SDS) и
ожидают лизиса бактерий, видимого по возрастанию вязкости суспензии.
После этого комплекс бактериальных белков и обломков клеточной стенки
осаждают добавлением 100 мкл 2,55 М ацетата калия при энергичном
встряхивании на вортексе в течение 5 мин. Затем смесь центрифугируют в
течение 5 - 10 мин. Надосадочную жидкость переносят в пробирку объемом
1,5 мл, содержащую 0,75 мл смолы марки Wizzard. Смесь тщательно
перемешивают и фильтруют через мини-колонку; промывают осадок смолы в
миниколонке 2 мл 80% изопропанола и центрифугируют 1 мин. при 12000g
для удаления остатков жидкости. Мини-колонку помещают в стерильную
пробирку объемом 1,5 мл, наносят в миниколонку 50 мкл стерильной
бидистиллированной или деионизованной воды и прогревают пробирку с
колонкой 5 мин. при плюс 70 град. С. Затем мини-колонку в пробирке
помещают в центрифугу и центрифугируют 1 мин. при максимальной
скорости для переноса раствора ДНК в пробирку. Описанным способом
получают порядка 5 мкг ДНК размером от 3 до 15 т.п.н. Полученные
препараты ДНК сохраняются при минус 70 град. С и используются для
анализа методом ПЦР. При условии использования стерильных растворов и
посуды получаемая ДНК может храниться при плюс 4 град. С в течение
полугода. Срок хранения препаратов ДНК при минус 20 град. С превышает
2 года.
5.1.1.4.6. Проведение ПЦР
ПЦР осуществляют с помощью ДНК-амплификаторов (термоциклеров).
Для проведения ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза,
соответствующий ей десятикратный ПЦР-буфер, растворы четырех
дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и выбранной пары праймеров. В типичных
экспериментах реакционную смесь объемом 50 мкл составляют так, чтобы
она содержала 350 нг геномной ДНК, 1,5 мМ каждого из четырех
дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, 1 ед. Taq-полимеразы. Затем к
реакционной смеси добавляют 30 пкМ пары олигонуклеотидных праймеров в
буферном растворе следующего состава: 67 мМ Трис-HCl буфер (рН 8,0 при
25 град. С), содержащий 16,6 мМ сульфат аммония, 15 мМ MgCl2, 10 мМ
2-меркаптоэтанол, 6,7 мкМ ЭДТА и бычий сывороточный альбумин в
концентрации 170 мкг/мл. Далее на каждую пробу наслаивают по 50 мкл
минерального масла и реакцию проводят по специально подобранным
программам в многоканальном амплификаторе ДНК.
При необходимости возможно проведение мультиплексной ПЦР для
анализа нескольких важных фрагментов вставки, а также второго раунда
ПЦР с внутренней парой праймеров (nested PCR) для повышения
специфичности реакции.
Продукты амплификации анализируют с помощью электрофореза в
пластине 6%-ного полиакриламидного геля (2,5 ч при 200 В).
ДНК-маркерами служит стандартный набор фрагментов ДНК плазмиды pBR322,
полученный под действием рестриктазы Alu 1. Окрашивание фрагментов ДНК
осуществляется этидиум бромидом. Анализ результатов и фотографирование
электрофореграммы осуществляют в условиях ультрафиолетовой подсветки
на трансиллюминаторе. Допустимо анализ продуктов ПЦР производить путем
электрофореза в 2% агарозном геле с последующей видео- или
фотодетекцией полученной на трансиллюминаторе картины. Фотоотпечатки
или оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее
600 точек на дюйм, должны быть приложены к протоколу проведения
испытаний.
5.1.2. Дополнительные методы идентификации
генетического материала ГММ
Дополнительными и уточняющими методами идентификации генетической
информации в штаммах ГММ являются рестрикционный анализ
амплифицированных фрагментов ДНК, а также метод определения их
нуклеотидной последовательности (секвенирование).
5.1.2.1. Аппаратура и инструментарий
Допускаются к использованию аппаратура и инструментарий
производства различных отечественных и зарубежных фирм, прошедшие
государственную регистрацию и разрешенные для использования в
установленном порядке.
1. Спектрофотометр.
2. Весы аналитические.
3. Планшетный ридер (rider).
4. Планшетный вошер (wosher).
5. Прибор для проведения электрофореза.
6. Прибор для проведения иммуноблоттинга.
7. Источник тока.
8. Термостатируемый шейкер.
9. Центрифуга настольная типа "Эппендорф".
10. Холодильник бытовой.
11. Компьютер, монитор, сканер, принтер.
12. Пипетки многоканальные и одноканальные с переменным объемом.
5.1.2.2. Методы оценки экспрессии целевого гена
Оценка экспрессии встроенного целевого гена осуществляется на
двух уровнях.
Первый уровень - транскрипционный. В этом случае определяется
наличие в клетке ГММ и РНК, синтезируемой под контролем целевого гена.
Второй уровень - трансляционный.
В этом случае определяется наличие белкового продукта
определенной молекулярной массы и/или определенной
иммуноспецифичности.
5.1.2.3. Определение иРНК, транскрибируемых с целевого гена
методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)
1 мкг РНК, выделенной из клеток культуры ГММ, предварительно
обработанной ДНКазой, отжигали с 10 пмоль одноцепочечного
олигонуклеотида: 20 мин. - 65 град. С и 10 мин. при комнатной
температуре. Затем проводили реакцию обратной транскрипции в общем
объеме 20 мкл. Состав реакционной смеси: 1 мкг РНК с отожженным
праймером, 50 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 50 мМ КСl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ ДТТ;
1 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата; 0,5 мМ спермидина; 1 Ед
AMV ревертазы. Реакцию проводили 30 мин. при 42 град. С. Далее эту
смесь анализировали с помощью полимеразной цепной реакции (методика
проведения ПЦР описана в разделе 5.1.1).
5.1.2.4. Определение белка, экспрессируемого целевым геном ГММ,
методом электрофоретического разделения в ПААГ-ДСН
Цель метода - сравнительный анализ белкового состава и
определение молекулярной массы полипептида, экспрессируемого целевым
геном.
Для проведения анализа используют следующие оборудование и
реактивы.
А. Электрофоретическая камера и источник питания (типа "Биорад"
или аналоги).
Б. Реактивы (производства фирм, прошедших государственную
регистрацию и разрешенных к использованию в установленном порядке):
1) раствор 40/0,8 (40% акриламида, 0,8% бис-акриламида);
2) раствор 20/0,3 (20% акриламида, 0,3% бис-акриламида);
3) буфер разделяющего геля (БРГ), рН 8,8;
4) буфер фокусирующего геля (БФГ), рН 6,8;
5) электродный буфер, рН 8,3;
6) буфер образца;
7) раствор ДСН (додецилсульфат натрия) 10%;
8) раствор персульфата аммония 10%;
9) раствор для окраски гелей ERZ Blue;
10) маркеры молекулярного веса.
Проведение электрофореза
I. Приготовление гелевой пластинки:
- вымыть части прибора в детергенте;
- промыть дистиллированной водой;
- смонтировать установку для заливки гелей;
- внести разделяющий гель, полимеризация 30 мин.;
- наслоить фокусирующий гель и вставить гребенку, полимеризация
10 мин.
После полимеризации (10 мин.) одномоментно удалить гребенку.
Гель можно хранить в полиэтилене, целлофане при температуре 4
град. С; использовать в течение 4 дней.
II. Пробоподготовка
К образцу, содержащему ~ 1 мг/мл белка (по поглощению при 280
нм), добавить буфер образца, прогреть при 100 град. С 5 минут.
III. Электрофорез:
- поместить гелевую пластину в камеру;
- заполнить камеры буфером;
- нанести образцы микрошприцем;
- включить источник питания;
- условия: сила тока - 20 мА на пластину;
- образцы концентрируются на анодном конце, затем разделяются по
молекулярной массе на основе эффекта молекулярного сита.
IV. Окраска геля
По окончании электрофореза гель вынуть из кассеты, поместить в
камеру для окраски. Окраска согласно протоколу, прилагаемому к
реагенту ERZ Blue.
V. Хранение
Для консервации применяют высушивание геля между целлофановыми
пленками.
Для сохранения данного изображения гель фотографируют в видимом
спектре или сканируют.
5.1.2.5. Определение специфичности белка, экспрессируемого
целевым геном ГММ, методом иммуноблоттинга
Цель метода - идентификация экспрессируемого полипептида с
помощью специфических моноклональных антител. Метод позволяет
определять идентичность синтезируемого белка продукту целевого гена,
указанного заявителем.
Для проведения анализа используют следующие оборудование и
реактивы.
А. Электрофоретическая камера, камера для переноса и источник
питания (типа "Биорад" или аналоги).
Б. Реактивы (производства фирм, прошедших государственную
регистрацию и разрешенных к использованию в установленном порядке).
Проведение иммуноблоттинга
I. Перенос белков
После электрофоретического разделения образца в ПААГ-ДСН
осуществляют перенос белков из пластин геля на нитроцеллюлозную
мембрану методом электропереноса в "полусухой" буферной системе.
Для этого на нижний угольный электрод (анод) ячейки для переноса
помещают 6 листов ватмана (N 3), пропитанного раствором "С" (0,03 М
Трис, 20% изопропилового спирта, рН 10,0). Следующим слоем помещают
PVDF-мембрану, затем накладывают пластину полиакриламидного геля с
разделенными белками и 6 листов бумаги, пропитанной раствором "А"
(0,025 М Трис, 0,04 М эпсилон-аминокапроновой кислоты, 20%
изопропилового спирта, 0,01% додецилсульфата лития, рН 9,4),
накладывают верхний электрод (катод) и плотно прижимают.
При сборке системы следят, чтобы между слоями не было пузырьков
воздуха. Размер листов фильтровальной бумаги и нитроцеллюлозных
фильтров должен соответствовать размеру геля. Перенос проводят при
постоянном токе 100 мА в течение 1,5 часов при комнатной температуре.
II. Обработка мембраны
Для блокирования несвязавшихся с белками участков нитроцеллюлозы
мембрану после переноса инкубируют в 0,1%-ном растворе Твин-20 в
течение 10 минут при 37 град. С, затем 30 мин. в растворе 3%-ного
казеина или сухого молока.
Последующие стадии обработки фильтров включают:
- инкубацию с моноклональными антителами;
- с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом;
- окрашивание мембраны.
Условия инкубации на каждой стадии: 1 час на шейкере при 37 град.
С. После окончания каждой стадии инкубации фильтр трижды отмывают
проточной водой и трижды 0,1%-ным раствором Твин-20 в течение 10 мин.
Проявление зон осуществляют субстратным раствором пероксидазы
(бета-хлорнафтол, диаминобензидин). Реакцию окрашивания останавливают
промыванием мембраны в воде.
После высушивания окрашенные реплики сканируют.
5.1.2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
Нуклеотидную последовательность ДНК определяют по методу Sanger.
Реакцию проводят по протоколу фирмы "Promega" в 3 стадии:
1. Радиомаркирование (кинирование) праймера
Реакция кинирования праймера проходит в объеме 10 мкл в следующих
условиях: 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5; 10 мМ MgCl2; 5 мМ DTT; 0,1 мМ
32
спермидина; 10 pmol праймера; 10 pM [гамма P]dATP; 5 ед.
Т4-полинуклеотидкиназы. Инкубировать 30 минут на 37 град. С, затем
активность фермента T4-Kinase останавливают повышением температуры до
90 град. С в течение 2 минут.
2. Синтез меченых цепей методом ПЦР
Кинированный праймер используется для синтеза методом ПЦР меченых
32
Р цепей ДНК разной длины, терминированных случайным включением ddNTP.
Реакция проводится в 17,5 мкл в условиях: 50 мМ Tris-HCl, рН 9,0; 10
мМ MgCl2; 1,5 pmol кинированного праймера; 40 fmol матричной ДНК; 5
ед. Taq-полимеразы. В заранее подготовленные 4 пробирки, содержащие
ddNTP, 50 мМ NaCl, раскапывают по 4 мкл реакционной смеси, сверху
наслаивают вазелиновое масло и проводят амплификацию. Реакция проходит
в следующих условиях: плавление цепей - 95 град. С - 0,5 мин.; отжиг
затравок - 42 град. С - 0,5 мин.; элонгация цепей ДНК - 70 град. С - 1
минута. Продолжительность амплификации составляет 30 циклов.
Останавливают реакцию добавлением 4 мкл буфера для нанесения (95%
формамид, 20 мМ ЭДТА; 0,05% бромфенолового синего и 0,05%
ксиленцианола FF).
3. Электрофорез
Полученные образцы прогревают 2 минуты при 70 град. С и наносят
на 6% полиакриламидный денатурирующий гель. В каждый слой геля наносят
по 3 мкл соответствующего образца. Электрофорез проводят при
постоянном напряжении (25 - 30 V/cm) при температуре 55 град. С. По
окончании электрофореза проводят фиксирование геля в 10%-ной уксусной
кислоте, затем гель сушат 30 минут на стекле при температуре 60 град.
С. Экспонирование с рентгеновской пленкой "Кодак" проводят в течение
15 - 48 часов при комнатной температуре.
5.1.2.7. Рестрикционный анализ ампликонов
Рестрикционный анализ проводят с помощью гидролиза ДНК
специфическими эндодезоксирибонуклеазами (рестриктазами) с последующим
фракционированием в агарозном геле. Выбор рестриктаз определяется
наличием специфических сайтов рестрикции в синтезированных ампликонах.
1. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами
Для гидролиза ДНК рестриктазами используют буферные смеси с
низкой, средней и высокой ионной силой, согласно рекомендациям фирм -
производителей этих ферментов. Время инкубации составляет от 1 до 4
часов при 37 град. С.
2. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в
агарозном геле
Разделение фрагментов ДНК проводят методом электрофореза в
горизонтальных агарозных гелях с концентрацией агарозы от 0,8 до 3%.
Электрофорез проводят при комнатной температуре в трис-ацетатном
буфере (0,04 М трис-ацетат, рН 8,1, 0,002 М ЭДТА) с содержанием 0,5
мкг/мл бромистого этидия, при напряженности электрического поля 10
В/см, в течение 30 - 60 мин. Гели с разделенными фрагментами
фотографируют в УФ-свете на пленку "Микрат-300" с использованием
оранжевого светофильтра или осуществляют видеодетекцию полученной на
трансиллюминаторе картины. Фотоотпечатки или оттиски, выполненные на
лазерном принтере с разрешением не менее 600 точек на дюйм, должны
быть приложены к протоколу проведения испытаний.
5.1.3. Методы оценки экспрессии целевого гена
Оценка экспрессии встроенного целевого гена осуществляется на
двух уровнях. Первый уровень - транскрипционный. В этом случае
определяется наличие в клетке ГММ иРНК, синтезируемой под контролем
целевого гена. Второй уровень - трансляционный. В этом случае
определяется наличие белкового продукта определенной молекулярной
массы и/или определенной иммуноспецифичности.
Определение иРНК, транскрибируемых с целевого гена методом
обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)
1 мкг РНК, выделенной из клеток культуры ГММ, предварительно
обработанной ДНКазой, отжигали с 10 пмоль одноцепочечного
олигонуклеотида: 20 мин. - 65 град. С и 10 мин. при комнатной
температуре. Затем проводили реакцию обратной транскрипции в общем
объеме 20 мкл. Состав реакционной смеси: 1 мкг РНК с отожженным
праймером; 50 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 50 мМ КСl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ ДТТ;
1 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата, 0,5 мМ спермидина, 1 Ед
AMV ревертазы. Реакцию проводили 30 мин. при 42 град. С. Далее эту
смесь анализировали с помощью полимеразной цепной реакции (методика
проведения ПЦР описана в разделе 5.1.1).
Электрофорез белка, экспрессируемого целевым геном ГММ, в ПААГ в
присутствии ДСН (PAGE-SDS)
Цель метода - определение молекулярного веса состава белка.
Для проведения анализа используют следующие оборудование и
реактивы.
А. Электрофоретическая камера и источник питания.
Б. Реактивы:
1) раствор 40/0,8 (40% акриламида, 0,8% бис-акриламида);
2) раствор 20/0,3 (20% акриламида, 0,3% бис-акриламида);
3) буфер разделяющего геля (БРГ), рН 8,8 доводить
концентрированной HCl (1,8 мл);
4) буфер фокусирующего геля (БФГ), рН 6,8 доводить
концентрированной HCl (1 мл);
5) электродный буфер, рН 8,3, ДСН (SDS) - 4,0 г;
6) раствор ДСН (SDS) 10%;
7) раствор персульфата аммония 10%;
8) раствор для окраски гелей ERZ Blue.
Проведение электрофореза
I. Приготовление гелевой пластинки:
- вымыть части прибора в детергенте;
- ополоснуть дистиллированной водой;
- смонтировать установку;
- внести разделяющий гель, полимеризация 30 мин.;
- наслоить фокусирующий гель и вставить гребенку.
После полимеризации (10 мин.) одномоментно удалить гребенку.
Гель можно хранить в полиэтилене, целлофане при температуре 4
град. С; использовать в течение 4 дней.
II. Пробоподготовка
К образцу, содержащему ~ 1 мг/мл белка (по поглощению при 280
нм), добавить буфер образца с дитиотрейтолом, инкубировать при 100
град. С 3 минуты.
III. Электрофорез:
- поместить гелевую пластину в камеру;
- заполнить камеры буфером;
- нанести образцы микрошприцем;
- включить источник питания;
- условия: ток - 20 мА на пластину;
- образцы концентрируются на анодном конце, затем разделяются по
молекулярному весу на основе эффекта молекулярного сита.
IV. Окраска
По окончании электрофореза гель вынуть из кассеты, поместить в
камеру для окраски. Окраска согласно протоколу, прилагаемому к
реагенту ERZ Blue.
V. Хранение
Для консервации применяют высушивание геля между целлофановыми
пленками.
Для сохранения данного изображения гель фотографируют в видимом
спектре или сканируют.
Иммуноблоттинг (Western-blotting Immunoassay)
Метод иммуноблоттинга позволяет с помощью специфических
моноклональных антител определять идентичность синтезируемого белка
продукту целевого гена, указанного заявителем.
После электрофоретического разделения в ПААГ-ДСН (PAGE-SDS) белки
переносят из пластин геля на нитроцеллюлозную мембрану методом
электропереноса в "полусухой" буферной системе.
Для этого на нижний угольный электрод (анод) ячейки для переноса
помещают 6 листов фильтровальной бумаги (W N 3), пропитанной раствором
"С" (0,03 М Трис, 20% изопропилового спирта, рН 10,0). Следующим слоем
помещают нитроцеллюлозную мембрану ВА 85, затем накладывают пластину
полиакриламидного геля с разделенными белками и 6 листов бумаги,
пропитанной раствором "А" (0,025 М Трис, 0,04 М
эпсилон-аминокапроновой кислоты, 20% изопропилового спирта, 0,01%
додецилсульфата лития, рН 9,4), накладывают верхний электрод (катод) и
плотно прижимают.
При сборке системы следят, чтобы между слоями не было пузырьков
воздуха. Размер листов фильтровальной бумаги и нитроцеллюлозных
фильтров должен соответствовать размеру геля. Перенос проводят при
постоянном токе 100 мА в течение 1,5 часов при комнатной температуре.
Обработка мембраны.
Для блокирования не связавшихся с белками участков нитроцеллюлозы
мембрану после переноса инкубируют в 0,1% растворе Твин-20 в течение
10 минут при 37 град. С, затем 30 мин. в растворе 3% казеина.
Последующие стадии обработки фильтров включают:
- инкубацию с моноклональными антителами (поликлональными
антителами);
- с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом;
- окрашивание мембраны.
Условия инкубации на каждой стадии: 1 час на шейкере при 37 град.
С. После окончания каждой стадии инкубации фильтр трижды отмывают
проточной водой и трижды 0,1% раствором Твин-20 в течение 10 мин.
Проявление зон осуществляют субстратным раствором пероксидазы
(бета-хлорнафтол, диаминобензидин). Реакцию окрашивания останавливают
промыванием мембраны в воде.
После высушивания окрашенные реплики сканируют.
5.2. Определение ДНК ГММ в готовых продуктах питания
Полная микробиологическая и молекулярно-генетическая,
медико-биологическая и технологическая оценка ГММ проводится для
пищевых продуктов 1 группы (см. п. 3.4 настоящих МУ). Такая оценка
предусматривает наряду с анализом документации как исследования
культур ГММ (таксономии и свойств доноров, реципиентов, самих ГММ,
последовательностей генных вставок, наличия биомаркеров и т.д.), так и
продуктов с ГММ.
Для продукции, относимой ко второй группе (само по себе
длительное использование которой в питании населения без вреда для
здоровья является одним из свидетельств безопасности), основными
подходами могут быть микробиологическая и молекулярно-генетическая
оценка образцов готовых продуктов (идентификация ДНК генной вставки,
наличие селективных маркеров или маркеров генной модификации
(векторных генов, линкеров и т.п.); либо комплексная фено- и
генотипическая идентификация выделенного из продукта ГММ <*>) и/или
экспертиза документации.
------------------------------------
<*> При экспертизе продуктов, содержащих жизнеспособные ГММ.
Стандартно принятыми методами для определения наличия чужеродного
генетического материала в продуктах являются иммунологический анализ и
выявление ДНК ГММ при помощи ПЦР.
Критерием в пользу выбора ПЦР как метода анализа является высокая
чувствительность метода, превосходящая как минимум на два порядка
чувствительность известных иммунологических методов. Помимо этого, ПЦР
является гораздо менее дорогим и более стабильным методом, чем другие
методы анализа. Немаловажным достоинством ПЦР является то, что
используемые в реакции синтетические олигонуклеотиды при правильном их
выборе могут быть применены для проведения анализов различных ГММ, что
в случае иммунологических методов невозможно.
5.2.1. ПЦР-идентификация ДНК ГММ в готовых
продуктах питания
5.2.1.1. Выделение ДНК ГММ из тестируемого продукта
В выборе метода выделения ДНК определяющую роль играет содержание
жиров в продуктах питания. При повышенном содержании жиров проводится
дополнительная экстракция суспензией неполярных растворителей с водой.
Это позволяет перевести содержащуюся в пищевом продукте ДНК в водную
фазу, в которой и производится дальнейшая очистка.
Обычная длина ПЦР фрагмента при выявлении ДНК ГММ не превышает
1000 пар оснований, поэтому в основу нижеследующих методик легли
процедуры выделения и очистки, позволяющие получить достаточно чистые
препараты ДНК для проведения ПЦР. Вторым критерием отбора методик
явилось требование минимизации времени, затрачиваемого на выделение
одного препарата ДНК.
1. 0,5 г образца пищевого продукта гомогенизируют при помощи
тефлонового пестика в 0,5 мл буфера А (100 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 50 mM
NaCl, 10 мМ р-меркаптоэтанола).
2. После гомогенизации добавляют 100 мкл 20% SDS. Смесь тщательно
перемешивают и инкубируют 20 - 30 мин. при 65 град. С.
3. Охлаждают до 4 град. С, добавляют 0,3 мл 5 М ацетата калия,
перемешивают в вортексе и центрифугируют 10 мин. при 15000 об./мин.
при комнатной температуре.
4. К надосадку добавляют 1 мл смолы Wizard MaxiPreps и инкубируют
смесь 10 мин. при 25 град. С.
5. Затем фильтруют полученную смесь сквозь мини-колонку,
промывают 2 мл 80%-ного изопропанола, центрифугируют (15000 об./мин.,
2 мин.) и удаляют оставшийся в мини-колонке изопропанол.
6. Добавляют в мини-колонку 50 мкл дистиллированной воды,
подогретой до 65 град. С.
7. Инкубируют мини-колонку с водой 10 мин. при 65 град. С,
центрифугируют (15000 об./мин., 2 мин.) и переносят раствор ДНК в
чистую стерильную пробирку.
В зависимости от содержания ДНК в конкретном пищевом продукте на
проведение единичной полимеразно-цепной реакции в объеме 50 мкл
требуется от 2 до 20 мкл полученного препарата ДНК.
Образцы пищевых продуктов с повышенным содержанием масла перед
выделением ДНК требуется подвергнуть дополнительной экстракции
эмульсией хлороформа в воде.
Для этого 0,5 г исследуемого продукта гомогенизируют в смеси 0,5
мл буфера А и 0,5 мл хлороформа и инкубируют гомогенат 20 мин. при 56
град. С. Затем охлаждают его до 4 град. С и центрифугируют 10 мин. при
15000 об./мин. на микроцентрифуге при комнатной температуре. Водную
фазу собирают и переносят в чистую пробирку. Далее продолжают, начиная
с пункта 2 вышеизложенной методики.
5.2.1.2. Выбор праймеров для проведения ПЦР
Для точного определения наличия ДНК вставки в штаммах ГММ
фирмой-заявителем должна быть представлена информация о нуклеотидной
последовательности целевого гена и его регуляторных элементов, а также
о структурных элементах и маркерах вектора.
Это требование вводится для того, чтобы можно было точно
идентифицировать наличие конкретной генетической конструкции. В таком
случае синтетические олигонуклеотиды для проведения ПЦР будут
синтезированы таким образом, чтобы выявить факт наличия генетических
модификаций. Длина используемых при анализе специфических праймеров
должна составлять не менее 20 пар нуклеотидов с целью избежания
появления в результате ПЦР неспецифических продуктов реакции.
В случае, когда подобная информация по каким-то причинам не может
быть представлена (например, фирма - изготовитель продуктов питания
закупает используемые в технологическом процессе штаммы
микроорганизмов у специализированного производителя), необходимо
проводить проверку на присутствие в выделяемой из тестируемой
продукции ДНК наборами праймеров, позволяющими подтвердить видовую
идентификацию штамма и выявить наличие возможных генетических
модификаций. Рекомендуемые стратегии выявления генетических
модификаций предлагают использовать для этих целей наиболее часто
употребляемые векторные последовательности: селективные гены (гены
антибиотикорезистентности, бактериоцинов или ауксотрофные селективные
маркеры), неэкспрессируемые последовательности (полилинкеры, промоторы
или терминаторы), а также последовательности мигрирующих элементов.
Обнаружение таких последовательностей будет свидетельствовать о
возможных незадокументированных генетических модификациях, что
потребует проведения дополнительных исследований, подтверждающих или
опровергающих это предположение.
5.2.1.3. Выбор условий проведения ПЦР
Для ПЦР-анализа ДНК, выделенной из продуктов питания, подбираются
оптимальные условия проведения реакции для каждой конкретной пары
праймеров, обеспечивающие максимальную чувствительность и
специфичность анализа, исключающую наличие перекрестных реакций с
неспецифическими ДНК.
Выбор условий проведения ПЦР включает подбор оптимального
соотношения компонентов реакционной смеси, структуры программы
амплификации (временных и температурных характеристик каждого этапа
амплификации) и адекватного метода детекции результатов.
5.2.1.4. Проведения ПЦР
Для проведения ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза,
соответствующий ей десятикратный ПЦР-буфер, растворы четырех
дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и выбранной пары праймеров. В типичных
экспериментах реакционную смесь объемом 50 мкл составляют так, чтобы
она содержала 350 нг геномной ДНК, 1,5 мМ каждого из четырех
дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, 1 ед. Taq-полимеразы. Затем к
реакционной смеси добавляют 30 пкМ пары олигонуклеотидных праймеров в
буферном растворе следующего состава: 67 мМ Трис-HCl буфер (рН 8,0 при
25 град. С), содержащий 16,6 мМ сульфат аммония, 67 мМ MgCl, 10 мМ
2-меркапто-этанол, 6,7 мкМ ЭДТА и бычий сывороточный альбумин в
концентрации 170 мкг/мл. Далее на каждую пробу наслаивают по 50 мкл
минерального масла и реакцию проводят по специально подобранным
программам в многоканальном амплификаторе ДНК.
При необходимости возможно проведение мультиплексной ПЦР для
анализа нескольких важных фрагментов вставки, а также второго раунда
ПЦР с внутренней парой праймеров (nested PCR) для повышения
специфичности реакции.
Продукты амплификации анализируют с помощью электрофореза в
пластине 6%-ного полиакриламидного геля (2,5 ч при 200 В).
ДНК-маркерами служит стандартный набор фрагментов ДНК плазмиды pBR322,
полученный под действием рестриктазы Alu 1. Окрашивание фрагментов ДНК
осуществляется этидиум бромидом. Анализ результатов и фотографирование
электрофореграммы осуществляют в условиях ультрафиолетовой подсветки
на трансиллюминаторе. Допустимо анализ продуктов ПЦР производить путем
электрофореза в 2%-ном агарозном геле с последующей видео- или
фотодетекцией, полученной на трансиллюминаторе картины. Фотоотпечатки
или оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее
600 точек на дюйм, должны быть приложены к протоколу проведения
испытаний.
Приложение
ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Пищевые продукты - продукты в натуральном или переработанном
виде, употребляемые человеком в пищу (в т.ч. продукты детского
питания, продукты диетического питания), бутылированная питьевая вода,
алкогольная продукция (в т.ч. пиво), безалкогольные напитки,
жевательная резинка, а также продовольственное сырье, пищевые добавки
и биологически активные добавки.
Продовольственное сырье - сырье растительного, животного,
микробиологического, минерального и искусственного происхождения и
вода, используемые для изготовления пищевых продуктов.
Качество пищевых продуктов - совокупность характеристик пищевых
продуктов, способных удовлетворять потребности человека в пище при
обычных условиях их использования.
Безопасность пищевых продуктов - состояние обоснованной
уверенности в том, что пищевые продукты при обычных условиях их
использования не являются вредными и не представляют опасности для
здоровья нынешнего и будущих поколений.
Удостоверение качества и безопасности пищевых продуктов -
документ, в котором изготовитель удостоверяет соответствие качества и
безопасности каждой партии пищевых продуктов требованиям нормативных,
технических документов.
Нормативные документы - государственные стандарты, санитарные и
ветеринарные правила и нормы, устанавливающие требования к качеству и
безопасности пищевых продуктов, контролю за их качеством и
безопасностью, условиям их изготовления, хранения, перевозок,
реализации и использования, утилизации или уничтожения некачественных,
опасных пищевых продуктов, материалов и изделий.
Технические документы - документы, в соответствии с которыми
осуществляются изготовление, хранение, перевозка и реализация пищевых
продуктов, материалов и изделий (технические условия, технологические
инструкции, рецептуры и др.).
Генная инженерия - совокупность методов и технологий, в т.ч.
технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и
дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма,
осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.
Генно-инженерная деятельность - деятельность, осуществляемая с
использованием методов генной инженерии и
генно-инженерно-модифицированных (генно-модифицированных) организмов.
Генетически модифицированный организм (ГМО) - организм или
несколько организмов, любые неклеточные, одноклеточные или
многоклеточные образования, способные к воспроизводству или передаче
наследственного генетического материала, отличные от природных
организмов, полученные с применением методов генной инженерии и
содержащие генно-инженерный материал, в т.ч. гены, их фрагменты или
комбинацию генов.
Генетически модифицированный микроорганизм (ГММ) - микроорганизмы
(бактерии, дрожжи и др.), в которых генетический материал
(дезоксирибонуклеиновая кислота) изменен с использованием методов
генной инженерии.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ
1. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых
продуктов/Под ред. И.М. Скурихина и В.А. Тутельяна. М.: "Брандес -
Медицина", 1998.
2. ФАО/ВОЗ Стратегии оценки безопасности пищевых продуктов,
полученных с помощью биотехнологии//Материалы объединенного совещания
ФАО/ВОЗ по оценке биотехнологических методов производства и
переработки пищевых продуктов с точки зрения их безопасности. Женева.
Швейцария, 1990.
3. РАО/WHO Protein quality evaluation, Report of a Joint FАО/WHO
Expert Consultation Held in Bethesda, Md, USA, 4 - 8 December, 1989,
FAO Rome.
4. РАО/WHO Biotechnology and food safety, Report of a Joint
FAO/WHO Expert Consultation, 1996. UN Food and Agriculture
Organization, Rome.
5. ILSI Safety assassment of viable genetically modified
microorganisms used in food, ILSI Europe Workshop on the Safety
Assessment of Viable GMM, Microbial ecology in health and desiase,
1999, 11: 198 - 207.
6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической
инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Из-во "Мир", 1984.
7. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот.
Наука, 1985.
8. Laemmly U.К. Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4//Nature, 1970. V. 227. P. 680
- 685.
9. Blum H., Beir H., Cross H. Improved silver staining of plant
proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels//Electrophoresis, 1987.
V. 8. P. 126 - 129.
10. Ohnashi T. et al. Preparative night-yield electroelution of
proteins offer separation by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis and its application to analysis of aminoacid sequences
and to riseantibodyes //J. Chromatogr., 1991. V. 585. P. 153 - 159.
11. Towbin H., Staehelin T., Gordon J., Jordan J. Electrophoretic
transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose
sheets: prosedure and some applications//Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
1979. V. 79. P. 4350 - 4354.
12. Bredford M.M. A rapid and sensitive method for the
quantitation of micrograme quantities of protein utilising the
principle of protein-dye binding//Anal. Biochem., 1976. V. 72.
13. MacCormick C.A., Griffin H.G., Underwood H.M., Gasson M.J.
Common DNA sequences with potential for detection of genetically
manipulated organisms in food//J. Appl. Microbiol., 1998. 84, 969 -
980.
14. Gasson M. Genetic manipulation of dairy cultures //Bulletin
of the IDF, 1997, 320: 41 - 44.
15. Koning W.N. et al. Lactic acid bacteria: the bugs of the new
millennium//Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3 (3): 276 - 282.
16. Pridmore R.D. et al. Genomics, molecular genetics and the
food industry//J. Bio-technol., 2000, 78, 3, 251 - 258.
17. Romanos M.A., Scorer C.A., Clare J.J. Foreign gene expression
in yeast: a review//Yeast, 1992, 8, 423 - 488.
18. McKay L.L. Update on dairy starter cultures: genetics and
biotechnology of dairy streptococci. In: Proceedings of the ILSI
International seminar on biotechnology, Tokyo, 1988.
19. Lindemann J. Biotechnology in food: a summary of major issues
regarding safety assurance//Regular Toxilogy and Farmacology, 1990,
12: 96 - 104.
20. Holst-Jensen A., Sissel B.R., Lovseth A., Berdal K.G. PCR
technology for screening and quantification of genetically modified
organisms (GMOs)//Ann. Bioannal. Chem., 2003. 375: 985 - 993.
21. Методические указания по определению остаточных количеств
антибиотиков в продуктах животноводства. Утв. МЗ СССР 29.06.84, N
3049/84. М., 1985.
22. АОAC Official methods of analysis, AOAC International, 1996.
V. 2, chapter 33, 45, 48.
23. Теоретические и клинические аспекты науки о питании/Под ред.
Волгарева М.Н. Т. 8. 1987. 210 с.
24. Госфармакопея СССР ГФ. Т. 2. 1990.
25. Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шефтель В.О., Оникиенко Ф.А.
Показатели нормы у лабораторных животных в токсикологическом
эксперименте. М.: Медицина, 1978.
26. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под
редакцией Меньшикова В.В. М.: Медицина, 1987.
27. Тиц Н. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. М.:
Лабинформ, 1997.
28. Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шефтель В.О., Оникиенко Ф.А.
Показатели нормы у лабораторных животных. М.: Медицина, 1978.
29. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Бобринев Е.Ф. и др. Методы
первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с
помощью бактериальных тест-систем: Методические указания. М., 1985. 34
с.
30. Kaufman Р.В., Wu W., Kim D., Cseke L.J. Handbook of Molecular
and Cellular Methods in Biology and Medicine: CRC Press, 1995.
31. Гринберг К.Н., Кухаренко В.И., Ляшко В.Н., Терехов С.М.,
Пичугина Е.М., Фрейдин М.И., Черников В.Г./В кн.: Методы
культивирования клеток. Л.: Изд-во "Наука", 1988. С. 250 - 257.Страницы: 1 2 |