МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. Методика. Главный государственный санитарный врач РФ. 15.01.02 МУ 4.2.1097-02

Оглавление


Страницы: 1  2  3  



        МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.     
                   ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ
     
                              МЕТОДИКА

             ГЛАВНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНИТАРНЫЙ ВРАЧ РФ

                         15 января 2002 года
                          N МУ 4.2.1097-02

                                 (Д)


                                                             Утверждаю
                                               Главный государственный
                                                       санитарный врач
                                                 Российской Федерации,
                                                    Первый заместитель
                                              Министра здравоохранения
                                                  Российской Федерации
                                                          Г.Г.ОНИЩЕНКО
                                                   15 января 2002 года
     
                                                       Дата введения -
                                                    1 апреля 2002 года
     
     
     1. Разработаны    сотрудниками    Министерства    здравоохранения
Российской Федерации Ю.М. Федоровым, Н.Я. Жилиной; Ростовского-на-Дону
научно-исследовательского противочумного института Ю.М.  Ломовым, Б.Н.
Мишанькиным,  Л.С. Подосинниковой, Л.Г. Воронежской, И.Я. Черепахиной,
Т.А.  Кудряковой,  Б.Л.  Мазрухо,  Л.М.  Смоликовой,  И.В. Рыжко, Р.И.
Цураевой,  Э.А.  Москвитиной,  Б.П.  Голубевым;  Противочумного Центра
Минздрава  России  А.А.  Кюрегяном,  С.М.  Ивановой,  Ю.С.  Королевым;
Российского   научно-исследовательского    противочумного    института
"Микроб"   А.К.   Адамовым,  З.В.  Малыхиной,  Т.В.  Бугорковой,  Н.И.
Смирновой,  Л.Ф.   Ливановой;   Иркутского   научно-исследовательского
противочумного   института   А.С.   Марамовичем,  В.С.  Ганиным,  Л.Я.
Урбанович, В.И. Погореловым; Ставропольского научно-исследовательского
противочумного     института    В.Н.    Савельевым;    Причерноморской
противочумной  станции  Г.В.  Гальцевой;  Государственного  Центра  по
антибиотикам   С.В.   Сидоренко;   Российской   медицинской   академии
последипломного образования Е.А.  Ведьминой;  ГИСК им. Л.А. Тарасевича
Минздрава России Т.И. Анисимовой, Л.В. Саяпиной.
     2. Утверждены   Главным   государственным    санитарным    врачом
Российской  Федерации  -  Первым заместителем Министра здравоохранения
Российской Федерации Г.Г. Онищенко 15 января 2002 г.
     3. Введены   взамен   "Инструкции  по  организации  и  проведению
противохолерных мероприятий",  утвержденной МЗ и МП РФ от  09.06.95  N
01-19/50-11.
     
                        1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
     
     1.1. Настоящие  Методические указания разработаны для внедрения и
применения   санитарно-эпидемиологических   правил   СП    3.1.1086-02
"Профилактика холеры.  Общие требования к эпидемиологическому надзору"
в части,  касающейся организации и проведения лабораторной диагностики
холеры.
     1.2. Настоящие   Методические    указания    предназначены    для
специалистов бактериологических лабораторий центров госсанэпиднадзора,
лечебно-профилактических и противочумных учреждений.
     
                        2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
     
     2.1. Санитарные правила по безопасности работ с  микроорганизмами
СП   1.2.006-93.   Ч.   I:  Порядок  выдачи  разрешения  на  работу  с
микроорганизмами  I  -  IV  групп   патогенности   и   рекомбинантными
молекулами ДНК.
     2.2. Безопасность  работы  с  микроорганизмами  I  -   II   групп
патогенности: СП 1.2.011-94.
     2.3. Порядок  учета,  хранения,  передачи   и   транспортирования
микроорганизмов I - IV групп патогенности: СП 1.2.036-95.
     2.4. Безопасность  работы  с  микроорганизмами  III  -  IV  групп
патогенности и гельминтами: СП 1.2.731-99.
     2.5. Условия    транспортирования    и    хранения    медицинских
иммунобиологических препаратов: СП 3.3.2.028-95.
     2.6. Профилактика холеры.  Общие требования к эпидемиологическому
надзору: СП 3.1.1086-02.
     2.7. Профилактика  холеры.  Организационные  мероприятия.  Оценка
противоэпидемической  готовности  медицинских  учреждений к проведению
мероприятий на случай возникновения очага холеры: МУ 3.1.1096-02.
     
                 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ
     
     Холера -  острая  инфекционная  болезнь  из  группы   карантинных
инфекций, с диарейным синдромом, фекально-оральным механизмом передачи
возбудителя,    водным,    пищевым    и    контактно-бытовым    путями
распространения инфекции.
     Холерные вибрионы относятся к виду V.  cholerae, который включает
как   патогенные,   способные   вызывать   заболевания,   склонные   к
эпидемическому и пандемическому распространению, так и свободноживущие
в   воде   вибрионы,   безопасные  для  человека  или  обусловливающие
спорадические случаи диарей  и  инфекций  с  внекишечной  локализацией
возбудителя.   Известно  около  200  О-серологических  групп  холерных
вибрионов,  из  которых  лишь  холерные  вибрионы  O1  серогруппы   до
последнего десятилетия являлись возбудителями грозной инфекции. С 1993
г.  по решению ВОЗ как  холеру  регистрируют  заболевания,  вызываемые
холерными  вибрионами  O139  серогруппы.  Таким образом,  к настоящему
времени известны три варианта возбудителя холеры: холерные вибрионы O1
серологической группы - классические и эльтор (варианты Огава,  Инаба,
Гикошима) и холерные вибрионы новой O139 серогруппы.
     Наличие гена  холерного  токсина  (ctx  AB),  независимо  от  его
экспрессии,  отличает токсигенные (эпидемические)  от  свободноживущих
холерных   вибрионов  O1  и  O139  серогрупп;  кроме  того,  в  геноме
токсигенных эпидемически значимых вариантов  присутствует  ряд  генов,
кодирующих  синтез  белка  ТОХ Т,  передающего сигналы запуска синтеза
холерного токсина (СТ),  токсинкорегулируемых пилей  адгезии  (TCP)  и
фактора колонизации (ACF).  Известно, что свободноживущие атоксигенные
холерные  вибрионы  O1  чрезвычайно  редко  имеют  tcp  ген  в   своей
хромосоме.
     Характеристика генома             выделенных              штаммов
молекулярно-биологическими   методами   может  быть  использована  для
эпидемиологического анализа и решения вопросов заноса, распространения
и укоренения инфекции.
     Известно многообразие   фенотипических   изменений   атоксигенных
холерных вибрионов,  выделенных на свободных от холеры территориях,  а
также распространение эпидемически значимых фагорезистентных вариантов
холерных   вибрионов   и   штаммов   с   множественной   лекарственной
устойчивостью.
     
               4. ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
     
     Диагностические исследования  на  холеру   в   регламентированном
объеме могут проводить:
     - бактериологические    лаборатории    территориальных    центров
госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических учреждений и ведомственных
служб,  имеющие разрешение на работу  с  микроорганизмами  III  группы
патогенности;
     - лаборатории особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора  в
субъектах Федерации (республиканских,  краевых, областных, городских),
ведомственных   учреждений,   имеющие   разрешение    на    проведение
диагностических исследований на холеру;
     - лаборатории противочумных  учреждений,  имеющие  разрешение  на
проведение  диагностических  исследований  на  холеру  и  на  работу с
возбудителем холеры.
     Организация и выполнение диагностических исследований на холеру в
лабораториях должны  осуществляться  в  соответствии  с  требованиями,
регламентирующими:
     - безопасность  работы  с  микроорганизмами  III   -   IV   групп
патогенности   и  гельминтами  -  для  бактериологических  лабораторий
центров  госсанэпиднадзора,  лечебно-профилактических   учреждений   и
ведомственных служб;
     - безопасность  работы  с   микроорганизмами   I   -   II   групп
патогенности   -   для  лабораторий  особо  опасных  инфекций  центров
госсанэпиднадзора ведомственных и противочумных учреждений;
     - порядок   учета,   хранения,   передачи   и   транспортирования
микроорганизмов I - IV групп патогенности.
     Порядок получения    лабораториями   разрешения   на   работу   с
микроорганизмами I - IV групп патогенности  определяется  действующими
нормативными  документами  о  порядке  выдачи  разрешений  на эти виды
работ.
     Все диагностические    лаборатории,    выполняющие    работы    с
микроорганизмами I - IV групп патогенности,  должны иметь лицензию  на
деятельность,  связанную  с  использованием  возбудителей инфекционных
заболеваний.
     В условиях  осложнения  эпидемиологической  обстановки  временное
разрешение  на  проведение  диагностических  исследований  на   холеру
бактериологическим лабораториям центров госсанэпиднадзора,  включенным
в  состав  лабораторной  службы  очага,   в   случае   расширения   их
функциональных  обязанностей,  предоставляется  решением  медицинского
штаба очага.
     
          4.1. При осуществлении эпидемиологического надзора
     
     4.1.1. Бактериологические лаборатории центров госсанэпиднадзора в
городах и районах, учреждений лечебно-профилактических и ведомственных
служб:
     - проводят   плановые   диагностические  исследования  на  холеру
материала  от  больных  острыми  кишечными  инфекциями,  определенного
контингента здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды в объеме,
предусмотренном    для    соответствующего    типа    территорий    по
эпидпроявлениям    холеры.    Исследования   ведут   до   установления
отрицательного  результата  анализа  или  до  выделения   культуры   с
характерным для вибрионов ростом на агаровой и полиуглеводной средах и
положительной реакцией на оксидазу.  Культуры проверяют на  чистоту  в
мазке, окрашенном по Граму, на подвижность и в реакции агглютинации на
стекле (далее - слайд-агглютинации) с холерными сыворотками O1, Огава,
Инаба, РО и O139.
     При положительном   результате   слайд-агглютинации    немедленно
сообщают  в  территориальный  центр  госсанэпиднадзора,  культуру  для
окончательной идентификации немедленно доставляют в специализированную
лабораторию в установленном порядке.
     При отрицательном результате слайд-агглютинации:
     - культуру,   выделенную  от  людей,  направляют  для  дальнейшей
идентификации в специализированную лабораторию;
     - неагглютинирующиеся культуры, выделенные из объектов окружающей
среды,  идентифицируют  на  месте  или  по  согласованию  передают   в
территориальный центр госсанэпиднадзора.
     4.1.2. Лаборатории     особо     опасных     инфекций     центров
госсанэпиднадзора   в   республиках,   краях,   областях,   городах  и
ведомственных учреждений:
     - выполняют  диагностическое  исследование материала от больных и
умерших с подозрением на холеру и проб из объектов окружающей среды;
     - идентифицируют культуры вибрионов, выделенных в территориальных
и   ведомственных   лабораториях,   определяя    их    таксономическую
принадлежность,    а   также   определяют   эпидемическую   значимость
(токсигенность) и антибиотикочувствительность холерных вибрионов O1  и
O139 серогрупп по регламентированным для лабораторий тестам;
     - осуществляют  (или  организуют)   бактериологический   контроль
качества   питательных   сред  и  других  диагностических  препаратов,
используемых в территориальных лабораториях;
     - представляют   оперативную   информацию   о  выделении  культур
холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп;
     - в  установленном  порядке немедленно передают в территориальное
противочумное учреждение культуры холерных вибрионов,  таксономическая
принадлежность   или   токсигенность   которых  имеющимися  средствами
диагностики не определяется;
     - в  течение  5  дней  после  окончания  идентификации передают в
территориальное противочумное  учреждение  или  головной  по  проблеме
"Холера"  противочумный  институт  все культуры холерных вибрионов O1,
O139,  независимо от объекта  обследования,  и  других  серогрупп  при
выделении от больных;
     - контролируют    деятельность    территориальных    лабораторий,
оказывают  им  методическую  помощь  по  всем  вопросам  лабораторного
обеспечения эпидемиологического надзора за холерой.
     4.1.3. Лаборатории противочумных учреждений:
     - проводят  исследования  материала  от  больных  и   умерших   с
подозрением   на   заболевание  холерой,  а  также  проб  из  объектов
окружающей среды;
     - подтверждают  таксономическую  принадлежность  культур холерных
вибрионов, выделенных на курируемой территории;
     - идентифицируют  все  атипичные  культуры  холерных  вибрионов с
использованием дополнительных методов серологической,  биохимической и
других   видов   идентификации   с   целью  уточнения  таксономической
принадлежности;
     - определяют    эпидемическую    значимость   (токсигенность)   и
антибиотикочувствительность культур;
     - осуществляют   методическое   руководство   по   всем  вопросам
лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора  за  холерой  на
курируемой территории;
     - в  установленном  порядке  передают  с  паспортами   выделенные
культуры  холерных вибрионов в территориальный противочумный институт,
в    головной    по    проблеме    "Холера"    -    Ростовский-на-Дону
научно-исследовательский противочумный институт.  Кроме того, паспорта
на эти же культуры направляют в Противочумный центр Минздрава России.
     Лабораторное обеспечение  эпидемиологического  надзора за холерой
осуществляют в  соответствии  с  планом  противохолерных  мероприятий,
действующими     нормативными     и     методическими     документами.
Профилактические исследования на холеру проводят в  пределах  рабочего
дня с использованием соответствующих питательных сред, диагностические
исследования материала от подозрительных на холеру больных (трупов)  -
в условиях круглосуточного режима работы лаборатории.
     
         4.2. При проведении противоэпидемических мероприятий
     
     Организация и регламентирование деятельности лабораторий, а также
формирование лабораторной  службы  в  очаге  холеры  осуществляется  в
соответствии  с  действующими  методическими  указаниями  по  вопросам
профилактики    холеры,    организации    мероприятий     и     оценки
противоэпидемической  готовности  медицинских  учреждений к проведению
мероприятий на случай возникновения очага холеры.
     
                  5. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
     
     В системе противохолерных мероприятий значительное место занимает
бактериологический   анализ,   от   правильности   и   своевременности
проведения  которого  зависит  характер  и  объем  профилактических  и
противоэпидемических мероприятий.
     Исследования проводят с целью:
     - выявления больных холерой и вибриононосителей;
     - установления окончательного диагноза при вскрытии  трупов  лиц,
умерших от подозрительного на холеру заболевания;
     - обоснования выбора средств этиотропной терапии холеры;
     - бактериологического   контроля  эффективности  лечения  больных
холерой и вибриононосителей;
     - бактериологического контроля объектов окружающей среды,  в т.ч.
поверхностных водоемов;
     - бактериологического  контроля  эффективности  обеззараживания в
очаге инфекции.
     
           5.1. Отбор и доставка материала на исследование
     
     Материалом для   бактериологического   анализа   могут    служить
испражнения,  рвотные массы,  желчь, трупный материал (отрезки тонкого
кишечника и  желчный  пузырь);  предметы,  загрязненные  испражнениями
(постельное и нательное белье и др.);  вода,  ил, гидробионты, сточные
воды,  содержимое выгребных  туалетов;  смывы  с  объектов  окружающей
среды, пищевые продукты, мухи и др.
     Материал от  больного  забирает  медицинский  персонал  лечебного
учреждения  немедленно  после  выявления  больного и до начала лечения
антибиотиками.  Руководитель  несет  ответственность  за  правильность
отбора, хранения и доставки проб в лабораторию.
     Необходимо учитывать высокую чувствительность холерных  вибрионов
к дезинфицирующим средствам и кислотам, возможность антагонистического
действия  сопутствующей  микрофлоры  и   предполагаемую   концентрацию
возбудителя  в  исследуемом  материале.  Если  в  материале от больных
                                                               6     9
алгидной   формой  холеры концентрация возбудителя достигает 10  - 10
     м.к./мл, то в  испражнениях  больных  легкой  формой  и  леченных
антибиотиками,   реконвалесцентов   и  носителей  количество  холерных
                                2     4
вибрионов обычно не превышает 10  - 10  м.к./г.
     Для отбора  проб  используют   чистую   стерильную   посуду,   не
содержащую  следов  дезинфицирующих  растворов.  Стерилизацию посуды и
других средств  забора  материала  проводят  автоклавированием,  сухим
жаром или кипячением в 2-процентном растворе пищевой соды.
     Материал для исследования должен  быть  доставлен  не  позже  чем
через  2  ч  после  его  взятия.  В  случае  удлинения сроков доставки
используют  транспортные  среды.   Наиболее   удобной   и   достаточно
эффективной является 1-процентная пептонная вода (рН 8,4 +/- 0,1).
     В пептонную воду в качестве ингибитора сопутствующей флоры  может
быть добавлен теллурит калия из расчета 1:100000 - 1:200000 или моющее
средство "Прогресс" в концентрации 0,1 - 0,2%. В отдельных случаях для
транспортирования    материала   могут   быть   использованы   солевые
консерванты (см. раздел 7).
     На флаконах   (пробирках)   с  пептонной  водой,  передаваемых  в
стационары для  отбора  проб,  должна  быть  этикетка  или  надпись  с
указанием названия среды и даты ее приготовления.
     Среды во  флаконах  или   пробирках,   закрытых   ватно-марлевыми
пробками,  рекомендуется  хранить  не более 2 суток при температуре не
выше (10,0  +/-  0,2)  ёC  при  условии  сохранения  их  стерильности.
Целесообразно  обеспечение  стационаров  и групп забора проб средами в
закатанных флаконах.
     При наличии   у  больного  диареи  материал  забирают  до  начала
этиотропной терапии в количестве 10 - 20 мл, у больных легкими формами
- 1 - 2 г испражнений. От больных тяжелой формой материал направляют в
лабораторию нативным и в 1-процентной пептонной воде.  В  транспортную
среду вносят 1 - 2 мл или 1 - 2 г материала на 5 - 6 мл среды.
     При вынужденном удлинении сроков доставки материала в лабораторию
(длительное   плавание,  круиз  и  т.п.)  можно  использовать  полоски
фильтровальной   (промокательной)   бумаги.   Жидкими    испражнениями
пропитывают  полоску обычной плотной промокательной бумаги или другого
гигроскопичного материала и герметично упаковывают в пластиковый пакет
для предохранения от высыхания при транспортировании в лабораторию. На
таких полосках холерные вибрионы выживают до  четырех-пяти  или  более
недель, пока сохраняется влага.
     При обследовании  на   вибриононосительство   материал   забирает
медицинский  персонал  лечебно-профилактических учреждений,  в очаге -
создают специальные группы по отбору проб, работающие под руководством
эпидемиологов.
     Материал в  количестве  1  -  2  г  может   быть   доставлен   на
исследование  нативным,  в  1-процентной  пептонной  воде  или  другой
транспортной среде.
     5.1.1. Способы отбора проб от больных холерой,  вибриононосителей
и контактных с ними лиц, секционного материала.
     Испражнения и  рвотные  массы  в количестве 10 - 20 мл собирают в
стерильную посуду  стерильными  ложками  или  стеклянными  трубками  с
резиновой  грушей  из индивидуального судна,  на дно которого помещают
меньший  по  размеру  сосуд  (лоток),  удобный   для   обеззараживания
кипячением.
     Для взятия материала у больных с обильным водянистым стулом можно
использовать  резиновый  катетер,  один конец которого вводят в прямую
кишку,  а другой опускают в банку.  Жидкие испражнения стекают в сосуд
свободно или при легком массаже брюшной стенки.
     Стерильный ректальный  ватный  тампон  из  гигроскопической  ваты
вводят  в прямую кишку на глубину 5 - 6 см и собирают им содержимое со
стенок  кишечника.  Тампон  опускают  во   флакон   или   пробирку   с
1-процентной пептонной водой, обломив часть деревянного стержня.
     Стандартную стерильную  петлю  из  алюминиевой  проволоки   перед
забором материала смачивают стерильным 0,9-процентным раствором натрия
хлорида и вводят в  прямую  кишку  на  8  -  10  см.  Взятый  материал
переносят во флакон или пробирку с 1-процентной пептонной водой.
     Желчь берут при дуоденальном зондировании в лечебном  учреждении.
В отдельные пробирки собирают две порции: из желчного пузыря и желчных
протоков (В и С). Материал доставляют нативным.
     От умерших с подозрением на холеру берут отрезки (длиной около 10
см) верхней,  средней и нижней частей тонкой кишки,  разрез производят
между  двойными  лигатурами,  предварительно  наложенными на оба конца
изымаемого участка кишечника.  Желчный пузырь после перевязки  протока
извлекают  целиком.  Содержимое кишечника и желчь от трупа можно взять
стерильным шприцем с толстой иглой в объеме до 10  мл  и  перенести  в
емкость  с 1-процентной пептонной водой.  Взятые образцы органов трупа
укладывают раздельно в стерильные банки.
     Банки, пробирки  с материалом закрывают непромокаемыми пробками и
пергаментной  бумагой,  тщательно  обрабатывают   снаружи   салфеткой,
смоченной дезинфицирующим раствором, избегая затекания его внутрь. Все
пробы  этикетируют,  укладывают  в   специально   подготовленную   для
транспортирования   металлическую   тару   и  перевозят  на  служебном
транспорте с сопровождающим. Форма направления дана в Приложении 1.
     5.1.2. Отбор проб из объектов окружающей среды.
     Воду (питьевую, из поверхностных водоемов и др.) для исследования
берут  в  количестве  1  л  на  одну  пробу в двух объемах по 500 мл в
стерильную посуду с непромокаемой пробкой.
     Из водопроводных  кранов  пробы воды берут после предварительного
обжигания их спиртовым факелом и спуска воды в  течение  10  мин.  при
полном открытии крана.
     Хозяйственно-бытовые сточные воды отбирают для исследования двумя
способами: в объеме 1 л также в двух емкостях по 500 мл или тампонами,
приготовленными из марлевых салфеток размером 10 x 10 см,  сложенных в
10 - 15 слоев.  Последние закрепляют у места забора воды,  через сутки
помещают в стерильную банку и доставляют в лабораторию.
     Гидробионтов (рыб,  лягушек  и др.) отлавливают из водоемов любым
способом и в закрытых банках,  ведрах и других  сосудах  доставляют  в
лабораторию.
     Исследовать зоопланктон (дафнии,  циклопы и др.) можно  групповым
методом, объединяя в один посев 10 - 30 образцов, отловленных на одном
участке водоема.  В этом случае они  могут  быть  доставлены  в  одном
сосуде. При исследовании рыб берут содержимое желудка и жабры.
     Смывы с различных объектов  окружающей  среды  берут  ватным  или
марлевым тампоном,  смоченным 0,9-процентным раствором натрия хлорида,
с поверхности площадью 10 x 10  см.  Тампон  опускают  во  флакон  или
пробирку с 1-процентной пептонной водой.
     Для сбора  мух  расставляют   мухоловки,   в   которые   наливают
1-процентную пептонную воду с 1% сахара.
     Остатки пищи в очаге и по показаниям пищевые продукты отбирают по
200  г  плотных  и  0,5  л  жидких,  помещают  в  стеклянную  посуду и
закрывают.  При необходимости в  жидкие  продукты  добавляют  основной
пептон до 1-процентной концентрации.
     Пробы объектов   окружающей    среды    этикетируют,    заполняют
направление  (Приложение  2)  и  отправляют  в  лабораторию с нарочным
согласно действующим СП.
     Перечень предметов,  входящих  в укладки для отбора проб,  см.  в
Приложениях 3, 4.
     
                      5.2. Порядок исследования
     
     При бактериологическом   исследовании   на   холеру    используют
различные питательные среды:  жидкие среды обогащения,  щелочной агар,
элективные дифференциально-диагностические  среды  и  набор  сред  для
идентификации.
     Применяют сухие среды производственного выпуска,  имеющие  номера
госрегистрации и лицензии,  или среды,  консерванты, приготовленные по
рецептуре   и   технологии,   изложенной   в   разделе   7.   Перечень
производственных  питательных  сред  и  диагностических препаратов для
выделения и идентификации возбудителя холеры приведен в Приложении  5.
При   транспортировании  и  хранении  медицинских  иммунобиологических
препаратов следует руководствоваться СП 3.3.2.028-95. Используемые для
диагностики  холеры  питательные  среды  подлежат  бактериологическому
контролю в установленном порядке.
     Агаровые среды   перед   использованием   должны  быть  тщательно
подсушены.  Посев делают так, чтобы получить рост в виде изолированных
колоний. Все посевы инкубируют при температуре (37,0 +/- 0,5) ёC.
     Посевы исследуемого  материала  на  всех  этапах   выращивают   в
1-процентной  пептонной  воде  6 - 8 ч,  в пептонной воде с теллуритом
калия - 12 - 18 ч,  на щелочном агаре - не менее  14  -  16  ч,  а  на
плотных  элективных  средах  -  18  -  24  ч.  Теллурит  калия следует
добавлять в 1-процентную пептонную воду с рН не ниже 8,3 +/-  0,1,  до
внесения  исследуемого материала.  Продолжительность хранения рабочего
раствора теллурита калия (1:1000) -  7  дней,  а  питательных  сред  с
теллуритом  калия  -  не  более  2  суток  при условии содержания их в
холодильнике.
     5.2.1. Исследование   проб   от   больных   и  вибриононосителей,
секционного материала (рис. 1).
     
------------------------------------------------------------------
|                      Исследуемый материал                      |
------------------------------------------------------------------
       |         |                                     |
       |         |                                     |
       \/        \/                                    \/
    --------   ----------------------------->---------------------
    |ЩА, ЭС|   | I |        ------           |Ускоренные методы: |
    --------   ------------>| II |---------->|- МФА              |
       |         |          ------           |- РИВ              |
       |         \/           |              |- РНГА             |
       |     --------         \/             |- ПЦР              |
       |     |ЩА, ЭС|       ------           ---------------------
       |     --------       | ЩА |
       |         |          ------
       |         |            |
       \/        \/           \/
   ---------------------------------------
   |- отбор колоний                      |
   |- высев подозрительных колоний на ЩА |
   |и ПУС                                |
   ---------------------------------------
                                   |
                                   \/
                    ----------------------------
                    |Отбор культур по ПУС и ОП |
                    ----------------------------
                                         |
                                         \/
  -------------------------------------------------------------
  |          |           |         |             |            |
  \/         \/          \/        \/            \/           \/
------     -------     -------   ------        ------       ------
|ПУС+|     |ПУС+*|     |ОП+* |   |ПУС-|        |ПУС-|       |ПУС+|
|ОП+ |     -------     -------   |ОП+ |        |ОП- |       |ОП- |
------                           ------        ------       ------
  |                                 |            |            |
  -----------------------------------            \/           \/
                  |                            -----------  -----------
                  \/                           |Не       |  |Исследуют|
    -------------------------------            |исследуют|  |на       |
 ---| ОРА с сыворотками O1 и O139 |---------¬  -----------  |кишечную |
 |+ -------------------------------       - |               |группу   |
 |                                          |               -----------
 |                                          |
 |                                          |
 \/                                         \/
---------------------------------------   ------------------------
|Сокращенная схема идентификации:     |   |Определение           |
|- морфология и подвижность микробных |   |принадлежности к роду |
|клеток                               |   |Vibrio, виду          |
|- ОП                                 |   |V. cholerae или другим|
|- O/F тест и отношение к отдельным   |   |видам патогенных      |
|углеводам (табл. 4)                  |   |вибрионов             |
|- МФА                                |   ------------------------
|- РИВ                                |   ------------------------
|- РА с сыворотками O1, Инаба, Огава, |   |Условные обозначения: |
|РО или слайд-агглютинация с O139     |   |I и II - среда        |
|- чувствительность к фагам холерным  |   |накопления; ЩА -      |
|классическому и эльтор               |   |щелочной агар; ЭС -   |
|Дополнительные признаки биовара      |   |элективная среда для  |
|V. cholerae:                         |   |выделения холерных    |
|- гемагглютинация                    |   |вибрионов; ПУС -      |
|- чувствительность к полимиксину В   |   |полиуглеводная среда; |
|50 ед./мл                            |   |ОП - оксидазная проба;|
|- реакция Фогес - Проскауэра         |   |ОРА - ориентировочная |
|Определение антибиотикограммы        |   |реакция агглютинации; |
|Оценка эпидемической значимости:     |   |РА - развернутая      |
|- гемолитическая активность по Грейгу|   |реакция агглютинации; |
|- чувствительность к фагам холерным  |   |МФА - метод           |
|эльтор ctх+ и ctx-                   |   |флюоресцирующих       |
|- ПЦР, ДНК-зондирование              |   |антител; РИВ - реакция|
|- токсигенность на кроликах-сосунках |   |иммобилизации         |
|Уточнение родовой и видовой          |   |вибрионов; РНГА -     |
|принадлежности атипичных культур по  |   |реакция непрямой      |
|расширенному набору признаков        |   |гемагглютинации; ПЦР -|
|(табл. 2, 3)                         |   |полимеразная цепная   |
---------------------------------------   |реакция;              |
                                          |* - в случае отбора   |
                                          |колоний только на ПУС |
                                          |или ЩА.               |
                                          ------------------------

          Рис. 1. Схема лабораторного исследования на холеру
     
     I этап
     Испражнения, рвотные массы больных, а также содержимое кишечника,
желчного пузыря и суспензию кусочков слизистой тонкого кишечника трупа
в  объеме  0,5  - 1,0 мл засевают пипеткой в 50 - 100 мл накопительной
среды,  петлей - на щелочной агар и одну  из  элективных  сред  (СЭДХ,
TCBS).
     При исследовании  материала   от   больных   с   подозрением   на
заболевание   холерой   не   допускается   использование  1-процентной
пептонной воды с теллуритом калия в качестве накопительной среды.
     В случае поступления материала от больных с подозрением на холеру
целесообразно    применять     ускоренные     методы     исследования:
иммунолюминесцентный, иммобилизацию и ПЦР со специфическими праймерами
(см. раздел 6).
     Материал от  подозреваемых  на вибриононосительство засевают в 50
мл среды накопления при индивидуальных анализах  и  в  100  мл  -  при
групповых,  объединяя в один флакон по 0,5 - 1,0 мл пробы не более чем
от 5 человек.  К групповым посевам  прибегают  в  редких  случаях  при
проведении массовых обследований на вибриононосительство.
     Материал, доставленный  в  5  мл  1-процентной  пептонной   воды,
полностью  используют  для  посева в 50 мл среды накопления.  В случае
поступления в лабораторию материала,  забранного в 50 мл  1-процентной
пептонной  воды  во флаконе,  и доставки его не позже 2 ч после забора
пробы флакон помещают в термостат на 6 ч для  накопления  возбудителя.
При доставке материала в более поздние сроки 5 мл его засевают в 50 мл
1-процентной пептонной воды.
     В отдельных    случаях,   при   бактериологическом   исследовании
материала от лиц,  принимавших антибиотики,  активные по  отношению  к
возбудителю холеры, его засевают в 200 - 300 мл 1-процентной пептонной
воды (предпочтительно в широкогорлые колбы) и  на  2  чашки  щелочного
агара  так,  чтобы получить рост в виде изолированных колоний.  Посевы
инкубируют при 37 ёC в течение 24 ч, производя последовательные высевы
через  8  -  10  ч  инкубации с поверхностного слоя среды на пластинки
щелочного агара. Использование второй среды обогащения в этом варианте
исследования нецелесообразно.
     II этап (через 6 - 8 ч от начала исследования)
     С первой среды накопления делают высев на щелочной агар и одну из
элективных сред и в 5 - 8  мл  второй  среды  накопления.  Пересевы  в
жидкие  и  на  плотные среды делают с поверхности жидкой среды большой
бактериологической петлей диаметром 5 мм.
     При отрицательных  результатах  исследования  нативного материала
ускоренными методами их повторяют после 6  ч  инкубации  первой  среды
накопления.
     III этап (через 12 - 16 ч от начала исследования)
     Высев со второй среды накопления на щелочной агар.
     В случае  необходимости  ускорения  хода  анализа  материала   от
больного  или  подозрительного на заболевание холерой отбор колоний со
щелочного агара,  засеянного в начале исследования, можно начинать уже
на этом этапе, в остальных случаях - на следующем.
     IV этап (через 18 - 24 ч от начала исследования)
     Отбор подозрительных  на  холерный  вибрион  колоний в посевах на
плотные среды нативного материала,  а также в высевах  из  1-й  и  2-й
накопительных сред.
     Чашки с посевами просматривают в проходящем  свете  невооруженным
глазом  или  с  помощью  лупы,  а  также (особенно в вечернее и ночное
время) под стереоскопическим микроскопом в  косо  проходящем  свете  и
отбирают   подозрительные   на   вибрионы   колонии  для  выделения  и
идентификации культуры.
     На щелочном  агаре колонии холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп
в  типичной  S-форме  -  круглые,   гладкие,   плоские,   голубоватые,
гомогенные,   с  ровными  краями,  прозрачные  в  проходящем  свете  и
светло-серые с голубым или зеленоватым оттенком под  стереоскопическим
микроскопом в косо проходящем свете (Приложение 6).
     Колонии холерных вибрионов на элективных средах TCBS и СЭДХ имеют
ярко-желтую  окраску на зеленом или синем фоне среды,  полупрозрачные.
Размеры колоний на щелочном агаре через 10 - 12 ч инкубации обычно  не
превышают  1  мм,  а к 18 - 24 ч достигают 2 - 3 мм в диаметре.  Темпы
формирования колоний холерных вибрионов на элективных средах несколько
замедлены, поэтому просмотр посевов на СЭДХ или TCBS следует проводить
не ранее чем через 18 - 20 ч инкубации,  когда размеры  их  становятся
близки к колониям, вырастающим на щелочном агаре.
     В отдельных случаях в посевах могут также  встречаться  атипичные
колонии:  мутные  с плотным центром,  пигментированные (коричневые или
светло-желтые), мельчайшие коккоподобные, шероховатые.
     Следует иметь  в  виду,  что  состав  и качество питательных сред
оказывают влияние на величину и плотность колоний холерных  вибрионов,
а также на морфологию клеток.
     При отборе колоний можно использовать пробу на  индофенолоксидазу
с  однокомпонентным  реактивом (без альфа-нафтола) или с индикаторными
бумажками из набора СИБ-1 для идентификации  вибрионов.  С  колониями,
обнаруженными  на  элективных  средах,  пробу  на  оксидазу ставить не
рекомендуется.
     Подозрительные колонии    проверяют    в   слайд-агглютинации   с
сывороткой холерной O1 в разведении 1:50 -  1:100.  При  положительной
реакции   и   достаточном  количестве  подозрительных  колоний  ставят
слайд-агглютинацию с варианто-специфическими сыворотками Инаба и Огава
в  том  же  разведении,  приготавливают  мазки  для окраски по Граму и
обработки  флюоресцирующими   иммуноглобулинами.   При   отрицательных
результатах  колонии,  обнаруженные  в  посевах  материала от больных,
проверяют в слайд-агглютинации с холерными сыворотками O139 и РО.
     Положительная ориентировочная  реакция агглютинации с холерной O1
сывороткой в разведении 1:100 и  варианто-специфической  в  разведении
1:50  или положительная реакция с флюоресцирующими иммуноглобулинами в
сочетании   с   морфологическими,    культуральными    признаками    и
специфической иммобилизацией позволяют выдать на соответствующем этапе
предварительный ответ об обнаружении в исследуемом материале холерного
вибриона  O1,  а  в  случае  положительной реакции с сывороткой O139 -
холерного вибриона O139 серогруппы.
     Подозрительные на   вибрионы   колонии,  агглютинирующиеся  и  не
агглютинирующиеся холерными O1 и O139 сыворотками, отсевают на одну из
полиуглеводных    сред    (лактозосахарозная,    Ресселя,    Клиглера,
маннозосахарозная или др.) и (или) на сектор пластинки щелочного агара
для   выделения   чистой  культуры,  ее  идентификации  и  определения
чувствительности к антибиотикам.
     V этап (через 24 - 36 ч от начала исследования)
     Отбор культур для идентификации.
     На полиуглеводных   средах  отбирают  культуры  с  типичными  для
вибрионов характером роста и изменениями:
     - на двууглеводных средах (лактозосахарозная,  глюкозолактозная и
Клиглер)  наблюдается  характерное  для кислой реакции изменение цвета
столбика при сохранении цвета скошенной части без образования газа,  а
также сероводорода, улавливаемого в среде Клиглера;
     - в  маннозосахарозной  среде за счет ферментации обоих углеводов
окрашиваются и  столбик,  и  скошенная  часть,  а  также  улавливается
образование сероводорода.
     Культуры, выросшие  на  щелочном  агаре,  проверяют  на   наличие
индофенолоксидазы.
     Определяют морфологию  микроорганизмов   и   чистоту   отобранных
культур, выросших на щелочном агаре и полиуглеводных средах, с помощью
окрашенных по Граму мазков.
     Культуры, дающие характерные изменения на полиуглеводных средах и
положительные  в  пробе  на  оксидазу,  проверяют  в   ориентировочной
слайд-агглютинации с холерными сыворотками O1 в разведении 1:100,  РО,
Инаба и Огава - в разведении 1:50.  При  отрицательных  результатах  с
этими сыворотками ставят слайд-агглютинацию с холерной сывороткой O139
серогруппы, используя ее в соответствии с инструкцией по применению.
     На основании положительных результатов агглютинации с сыворотками
O1,  Инаба или/и Огава выдают предварительный  положительный  ответ  о
выделении  из  исследуемого  материала  культуры холерного вибриона O1
соответствующего серовара.
     Если выделенная культура реагирует с холерной сывороткой O139 при
отрицательных результатах с сыворотками O1 серогруппы,  выдают ответ о
выделении холерного вибриона O139 серогруппы.
     Проводят идентификацию выделенных на полиуглеводных средах или на
щелочном  агаре  агглютинирующихся  и не агглютинирующихся сыворотками
O1,  РО или O139 серогрупп оксидазопозитивных культур  по  сокращенной
или полной схеме.
     VI этап (через 36 - 48 ч от начала исследования)
     Учитывают результаты идентификации и выдают окончательный ответ о
выделении культуры холерного  вибриона  соответствующей  серогруппы  и
биовара.
     Для холерных вибрионов O1 эпидемическую значимость  оценивают  по
тестам  гемолитической  активности  и  чувствительности к фагам эльтор
ctx+ и ctx-,  а в специализированных учреждениях - по результатам  ПЦР
или  генетического  зондирования  на  присутствие  в геноме выделенной
культуры   ctx   AB   гена,   а   также   токсигенности   на    модели
кроликов-сосунков.  Эпидемическую  значимость  холерных вибрионов O139
серогруппы определяют по тем же тестам, кроме чувствительности к фагам
эльтор  ctx+ и ctx-.  К окончанию этого этапа исследования должна быть
определена антибиотикочувствительность выделенной культуры.
     При выделении от больного или вибриононосителя культуры холерного
вибриона, не агглютинирующейся холерными сыворотками O1 и O139, выдают
ответ  о  выделении  холерных  вибрионов не O1 и не O139.  При наличии
вибрионных  агглютинирующих   диагностических   сывороток   определяют
принадлежность к другим серогруппам (О2 - О83).
     Идентификацию культур,  агглютинирующихся  РО-сывороткой,  см.  в
разделе 5.3.
     5.2.2. Исследование объектов окружающей среды.
     Схема анализа  объектов  окружающей  среды  отличается  от  схемы
исследования материала от больных только на I этапе,  II  -  VI  этапы
изложены выше.
     
     Вода поверхностных водоемов и водопроводная
     В зависимости  от  времени  доставки  пробы  возможны   следующие
варианты посевов с целью первичного накопления вибрионов:
     - к исследуемой  воде  добавляют  раствор  основного  пептона  до
1-процентной  концентрации,  определяют  рН,  в  случае  необходимости
подщелачивают 10-процентным раствором едкого натрия до рН 8,4 +/- 0,1.
Время  инкубации  в  1-й  среде  накопления - 8 - 10 ч.  Объем 2 среды
накопления - 10 мл; время инкубации в среде без теллурита калия 6 ч, а
с теллуритом калия - 18 - 20 ч;
     - в исследуемую  воду  добавляют  раствор  основного  пептона  до
1-процентной  концентрации  и  теллурит  калия  из рабочего разведения
1:1000 до концентрации 1:100000 или 1:200000 в соответствии с  данными
проверки.  Устанавливают рН - 8,4 +/- 0,1.  Время инкубации 18 - 24 ч;
вторая среда накопления - 10  мл  среды  без  теллурита  калия,  время
инкубации 6 - 8 ч;
     - исследование проб воды можно также проводить с использованием в
качестве  ингибитора  посторонней  флоры моющего средства "Прогресс" в
концентрации 0,1 - 0,2%;
     - после  добавления  основного  раствора  пептона до 1-процентной
концентрации и  установления  щелочной  реакции  пробы  сохраняют  при
комнатной   температуре   (не  выше  25  ёC)  до  утра  (первая  среда
накопления). В начале следующего дня засевают 5 мл поверхностного слоя
в  100  мл  1-процентной  пептонной  воды  (вторая среда накопления) и
делают высев на  щелочной  агар;  высев  со  второй  среды  накопления
производят через 6 - 8 ч инкубации;
     - воду фильтруют через мембранные фильтры  N  2  или  3,  смыв  с
которых сеют в накопительную среду и на агаровые пластинки. Из смыва с
фильтра можно делать  мазки  для  окраски  флюоресцирующими  холерными
иммуноглобулинами,   а  также  ставить  РНГА,  ПЦР  со  специфическими
праймерами.
     При интенсивном бактериальном загрязнении проб можно использовать
3 среду накопления.
     
     Хозяйственно-бытовые сточные воды
     Сточные воды, доставленные в объеме 1 л, фильтруют через бумажный
или матерчатый фильтр для освобождения от механических  примесей  (при
необходимости).
     После добавления  к  пробам   основного   раствора   пептона   до
1-процентной  концентрации устанавливают рН 8,4 +/- 0,1 и инкубируют в
объемах по 500 мл 8 - 10 ч (1  среда  накопления)  или  с  добавлением
теллурита калия 1:100000 (1:200000) - 18 - 24 ч.
     При заборе сточных вод марлевыми тампонами последние  помещают  в
широкогорлые  колбы  или банки с накопительной средой (500 мл) и далее
исследуют, как указано выше.
     
     Гидробионты
     Лягушку непосредственно  перед исследованием обездвиживают уколом
иглы в спинной мозг и фиксируют на препаровальной доске брюшком вверх.
Поверхность  брюшка обрабатывают спиртом и ножницами делают медиальный
разрез.  Желчный  пузырь  отсекают  от  печени,  разрезают  и   делают
отпечаток на пластинке щелочного агара. Остатки желчи вместе с желчным
пузырем помещают во флаконы с 50 - 100 мл 1-процентной пептонной воды.
Содержимое   желудка   засевают   в  1-процентную  пептонную  воду,  а
внутренней поверхностью стенки делают отпечатки на агаровые пластинки.
Посев  кишечника  делают таким же образом,  отсекая несколько петель в
верхнем, среднем и нижнем отделах кишечника.
     У крупных  рыб  в  том  же порядке засевают в накопительную среду
содержимое желчного пузыря,  желудка,  кишечника и жабры.  Мелких  рыб
(мальков) измельчают ножницами по 10 - 20 экз.  в одной пробе и делают
посев суспензии петлей на чашку с агаром и  в  1-процентную  пептонную
воду.
     Дафний, циклопов и др.  рачков  растирают  в  ступке  и  засевают
петлей в 1-процентную пептонную воду.
     У раков исследуют кишечник и жабры,  делая  посев  содержимого  в
среду накопления, и слизистой стенки - отпечатком на агаровую среду.
     
     Пищевые продукты
     Безалкогольные напитки исследуют тем же методом, что и воду.
     Молоко в  количестве 5 мл сеют в 50 - 100 мл среды накопления или
к 0,5 л молока добавляют  основной  раствор  пептона  до  1-процентной
концентрации его в молоке.  Другие молочные продукты (кефир,  сметану,
творог,  мороженое  и  т.д.)  в  количестве  5  -  10  мл  засевают  в
1-процентную пептонную воду.
     Твердые пищевые  продукты  измельчают,  растирают  в   ступке   с
физиологическим  раствором  и  засевают  в  количестве  10  г в 100 мл
накопительной среды и петлей на агаровые среды.
     Масло засевают  в  жидкую среду накопления в количестве 5 - 10 г,
размягчив его в термостате,  или делают посев смыва с поверхности  его
кусков.
     После посева продукта устанавливают рН среды 8,4 +/- 0,1.
     Смывы с  объектов  внешней  среды  и  мух засевают в 1-процентную
пептонную воду и исследуют по обычной схеме.
     5.2.3. Порядок   исследования   в   условиях  односменной  работы
лаборатории.
     При осуществлении  эпиднадзора  за холерой исследование материала
от обследуемых контингентов может выполняться в следующих вариантах.
     В качестве  1-й  или 2-й среды накопления используют 1-процентную
пептонную воду  (рН  8,4  +/-  0,1)  с  теллуритом  калия  в  конечной
концентрации  1:100000  -  1:200000  в соответствии с результатами его
контроля.
     Вопрос выбора  транспортной среды и порядка исследования решают в
зависимости от разницы времени с момента взятия пробы  до  поступления
ее  в  лабораторию.  Примерная  схема  забора  материала  от больных в
1-процентную пептонную воду и порядок дальнейшего его исследования  на
холеру с учетом различного времени доставки в лабораторию представлены
в табл.  1.  В течение  рабочей  недели  для  отбора  проб  используют
1-процентную пептонную воду без теллурита калия в объеме 5 - 10 мл, во
флаконах или пробирках (транспортная среда).
     
                                                             Таблица 1
     
       ПОРЯДОК ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВРЕМЕНИ
             ОТБОРА И ДОСТАВКИ ЕГО В ЛАБОРАТОРИЮ В 1% ПВ
     
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|N        |Время       |Время      |Среда    |Назначение   |1-я среда    |2-я среда            |Высев со    |
|вариантов|взятия      |доставки в |для      |среды        |накопления   |накопления.          |2-й среды   |
|         |материала   |лабораторию|взятия   |             |             |Высев с 1-й среды    |накопления  |
|         |            |           |проб     |             |             |накопления           |            |
|---------|------------|-----------|---------|-------------|-------------|---------------------|------------|
|1        |6.00 -      |До 10.00   |а) 1% ПВ |Среда        |Среда с      |Через 6 ч инкубации  |В начале    |
|         |10.00       |           |50 мл    |накопления   |доставленны  |пересев в 1% ПВ с    |следующего  |
|         |            |           |б) 1% ПВ |             |м            |ТК                   |рабочего    |
|         |            |           |5 - 10   |Транспортная |материалом   |и высев на щелочной  |дня         |
|         |            |           |мл       |среда        |Посев в      |агар и (или) ЭС      |            |
|         |            |           |         |             |50 мл 1% ПВ  |                     |            |
|---------|------------|-----------|---------|-------------|-------------|---------------------|------------|
|2        |10.00 -     |После      |1% ПВ    |Транспортная |Посев 5 -    |9.00 следующего дня  |Через 6     |
|         |до конца    |10.00      |5 - 10   |среда        |10           |пересев в 1% ПВ,     |часов       |
|         |рабочего    |в течение  |мл       |             |мл среды с   |высев на щелочной    |инкубации   |
|         |дня         |рабочего   |         |             |материалом   |агар и (или) ЭС      |            |
|         |лаборатории |дня        |         |             |в            |                     |            |
|         |            |лаборатори |         |             |50 мл 1% ПВ  |                     |            |
|         |            |и          |         |             |с ТК         |                     |            |
|---------|------------|-----------|---------|-------------|-------------|---------------------|------------|
|3        |По          |До 10.00   |1% ПВ    |Транспортная |Посев 5 -    |Через 6 ч инкубации  |В начале    |
|         |окончании   |следующего |5 - 10   |среда        |10           |пересев в 1% ПВ с    |следующего  |
|         |рабочего    |дня        |мл       |             |мл среды с   |ТК,                  |рабочего    |
|         |дня         |           |         |             |материалом   |высев на щелочной    |дня         |
|         |лаборатории |           |         |             |в            |агар и (или) ЭС      |            |
|         |            |           |         |             |50 мл 1% ПВ  |                     |            |
|---------|------------|-----------|---------|-------------|-------------|---------------------|------------|
|4        |Выходные    |До 10.00   |1% ПВ с  |Транспортная |Посев 5 -    |Через 6 ч инкубации  |В начале    |
|         |дни         |рабочего   |ТК 50 мл |среда        |10           |пересев в 1% ПВ с    |следующего  |
|         |лаборатории |дня        |         |             |мл среды с   |ТК,                  |рабочего    |
|         |            |           |         |             |материалом   |высев на щелочной    |дня         |
|         |            |           |         |             |в 50 мл 1%   |агар и (или) ЭС      |            |
|         |            |           |         |             |ПВ           |                     |            |
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------

     Обозначения: ТК - теллурит калия; ПВ - пептонная вода;
     ЭС - элективная среда для выделения холерного вибриона

     Пробы до  отправки  в   лабораторию   сохраняют   при   комнатной
температуре  (24,0  +/-  1,0)  ёC  в  биксах,  ящике,  шкафу и т.д.  в
специально    выделенной    комнате,    закрывающейся    на     замок.
Продолжительность сохранения проб в указанных условиях - до 24 ч.
     В случаях,  когда  температура  в  помещении  превышает  25   ёC,
материал  следует  брать  в  1-процентную  пептонную воду с теллуритом
калия.
     В лаборатории  в пробы во флаконах доливают соответствующую среду
накопления в количестве до 50  мл,  а  из  пробирок  все  5  -  10  мл
транспортной  среды  с  материалом  переносят  пипеткой  в 50 мл среды
накопления.
     На период   выходного   дня   лаборатории  в  порядке  исключения
допускается следующий вариант:  забор материала в 50  мл  1-процентной
пептонной  воды  с теллуритом калия (транспортная среда);  допускаемое
время сохранения проб до начала исследования при температуре (20,0 +/-
1,0)  ёC  -  60 ч,  (27,0 +/- 3,0) ёC - 48 ч.  В лаборатории 5 - 10 мл
поверхностного слоя среды с материалом переносят в 50 мл  1-процентной
пептонной воды без теллурита калия (1 среда накопления) и делают высев
на чашку щелочного агара  с  дальнейшим  исследованием  по  изложенной
схеме.
     Пептонную воду повышенной  щелочности  в  качестве  накопительной
среды рекомендуется использовать только на первом этапе исследования с
удлинением срока инкубации ее до 18 - 24 ч. Основной раствор пептона и
1-процентную  пептонную  воду с рН 9,5 +/- 0,5 можно готовить впрок по
общепринятой методике  с  подщелачиванием  до  необходимого  уровня  и
последующей стерилизацией при температуре 120 ёC - 20 мин.
     Для подщелачивания пептонной воды используют 10 - 20% NaOH.
     
            5.3. Идентификация культур холерных вибрионов
     
     Культуры, выделенные на различных этапах,  идентифицируют с целью
определения  их  принадлежности к виду Vibrio cholerae соответствующей
серогруппы (O1, O139 или др.).
     К виду   V.  cholerae  относят  грамотрицательные,  аспорогенные,
полиморфные палочки, слегка изогнутые или прямые, активно подвижные, с
одним  полярно  расположенным жгутиком,  образующие индофенолоксидазу,
ферментирующие глюкозу в аэробных и  анаэробных  условиях  до  кислоты
(без газа),  расщепляющие маннит,  маннозу, сахарозу, но не активные в
отношении  к  арабинозе,  инозиту,   салицину   и   некоторым   другим
субстратам.  Холерные вибрионы декарбоксилируют лизин и орнитин, но не
обладают   дигидролазой    аргинина,    образуют    индол,    обладают
нитратредуктазой,    не   продуцируют   сероводород.   Таксономическое
положение  холерных  вибрионов  и  признаки,  дифференцирующие  их  от
родственных микроорганизмов, приведены на рис. 2 и в табл. 2, 3, 4.
     
                   ------------------------
                   |Семейство Vibrionaceae|
                   |Shewan and Veron, 1965|
                   ------------------------
                              |---------------------
                              \/                   |
                   ------------------------        |
                   |  Типовой род Vibrio  |        |
                   |     Pacini, 1854     |        |
                   ------------------------        \/
---------------------      |  |             ----------------------
|36 видов вибрионов,|<------  |             |Другие роды:        |
|в т.ч. патогенных  |         \/            |Aeromonas Kluyver et|
|для человека:      |   -----------------   |Van Niel, 1936;     |
|V. alginolyticus   |   |  Типовой вид  |   |Enhydrobacter Staley|
|V. cincinnatiensis |   |Vibrio cholerae|   |et al, l987;        |
|V. damsela <**>    |   -----------------   |Photobacterium      |
|V. fluvialis       |          |            |Beijerinc, 1889;    |
|V. furnissii       |          |            |Plesiomonas Habs et |
|V. harveyi         |          \/           |Schubert, 1962      |
|V. hollisae        |   -----------------   L---------------------
|V. metschnikovii   |   |  Серогруппы   |
|V. mimicus         |   -----------------
|V. parahaemolyticus|       |  |  |
|V. vulnificus      |       |  |  |
---------------------       |  |  |
              ---------------  \/ ---------
    --------- |            ---------      | ---------
    |  O1   |<-            | O139  |      ->|  non  |
    |       |--------------|       |        |O1/O139|
    ---------      |       ---------        ---------
        |          \/                           |
        |   Возбудители холеры     Возбудители  |  гастроэнтеритов
        |                          и системных  |  инфекций
        \/                                      \/
 ------------------                  ------------------------
 |    Биовары     |                  |V. cholerae O2 - O138,|
 ------------------                  |O140 - O190...        |
    ----- ------------               |(по международной     |
    |                |               |классификации)        |
    \/               \/              |V. cholerae O2 - O83  |
 V. cholerae      V. cholerae        |(по отечественной     |
   cholerae         eltor            |классификации) <***>  |
    |                |               ------------------------
    ----        ------
       \/       \/
 ------------------
 |   Серовары:    |
 |     Inaba      |
 |     Ogava      |
 |    Hikojima    |
 ------------------
     
                 Рис. 2. Классификация вибрионов <*>
     
     ------------------------------------
     <*> Таксономия   вибрионов  представлена  по  Bergeys  manual  of
Determinative Bacteriology, 1994.
     <**> Предложено  McDonell  & Colwell (1985) отнести к новому роду
Listonella.
     <***> Типовые штаммы О2 - О39 соответствуют Sakazaki (1970);  О40
- О83,  а также O12;  О23 и О26 не изучены в сравнении с международной
коллекцией типовых штаммов.
     
                                                             Таблица 2
     
            ОСНОВНЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ РОДА VIBRIO
                  И НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
     
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|Признаки              |Роды сем. Vibrionaceae                                             |Enterobacteriaceae|Pseudomonadaceae|
|                      |-------------------------------------------------------------------|                  |                |
|                      |Vibrio          |Aeromonas|Enhydrobacter|Plesiomonas|Photobacterium|                  |                |
|                      |----------------|         |             |           |              |                  |                |
|                      |V.      |другие |         |             |           |              |                  |                |
|                      |cholerae|виды   |         |             |           |              |                  |                |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|1                     |2       |3      |4        |5            |6          |7             |8                 |9               |
|----------------------|-------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|Окраска по            |Грамотрицательные                                                                                      |
|Граму,                |полиморфные прямые или слегка изогнутые палочки                                                        |
|морфология            |                                                                                                       |
|----------------------|-------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|Подвижность           |+       |+(-)   |+(-)     |-            |+          |+             |+(-)              |+               |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Оксидаза              |+       |+(-)   |+        |+            |+          |+(-)          |-                 |+(-)            |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Рост на средах        |+       |-(+)   |+        |+            |+          |-             |-                 |-               |
|без NaCl              |        |       |         |             |           |              |                  |                |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Чувствительность      |+       |+(-)   |-        |-            |+          |+             |-                 |-               |
|к О129 <*>            |        |       |         |             |           |              |                  |                |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|О/Ф глюкозы           |+/+     |+/+    |+/+      |+/+          |+/+        |+/+           |+/+               |+/-             |
|в среде               |        |       |         |             |           |              |                  |                |
|Хью - Лейфсона        |        |       |         |             |           |              |                  |                |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Газ из глюкозы        |-       |-(+)   |+(-)     |-            |-          |+             |+/-               |-               |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Лизиндекарбоксилаза   |+       |+(-)   |-(+)     |+            |+          |+             |+/-               |-(+)            |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Орнитиндекарбоксилаза |+       |+/-    |-(+)     |+            |+          |+             |+/-               |-(+)            |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Аргининдигидролаза    |-       |-(+)   |+        |+            |+          |+             |-/+               |+/-             |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Ферментация:          |        |       |         |             |           |              |                  |                |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|лактозы               |-       |-(+)   |-(+)     |-            |+          |X             |+/-               |-(+)            |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|маннита               |+       |+(-)   |+(-)     |X            |-          |-             |+(-)              |+(-)            |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|арабинозы             |-       |-(+)   |+(-)     |X            |-          |-             |+(-)              |-(+)            |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|сахарозы              |+       |+(-)   |+        |X            |-          |-(+)          |+/-               |-               |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|инозита               |-       |-(+)   |-        |X            |+          |-             |-(+)              |X               |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Образование:          |        |       |         |             |           |              |                  |                |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|ацетилметилкарбинола  |+(-)    |-(+)   |+(-)     |-            |-          |+             |-(+)              |X               |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|индола                |+       |+(-)   |+(-)     |-            |-          |-             |+(-)              |+/-             |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|нитратредуктазы       |+       |+(-)   |+        |+            |+          |+(-)          |+                 |+/-             |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|бета-галактозидазы    |+       |+(-)   |+        |X            |+          |+             |-(+)              |X               |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|желатиназы            |+       |+(-)   |+        |X            |-          |+             |-(+)              |+/-             |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Биолюминесценц        |-(+)    |-(+)   |-        |X            |-          |+             |-                 |-               |
|ия                    |        |       |         |             |           |              |                  |                |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Мол. % G + C          |38      |51     |57 -     |66           |51         |40 -          |39 -              |58 -            |
|в ДНК                 |        |       |63       |             |           |44            |59                |70              |
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
     ----------------------------------------
     <*> Бактериостатический агент 2,4-диамино-6,7-диизопропилптериоидин.
     
     Условные обозначения:
     Х - нет данных;
     + - положительный результат в 90%;
     - - отрицательный результат в 90%;
     +/- - положительный  и  отрицательный  результаты  встречаются  в
равной степени;
     +(-) или -(+) - в скобках редко наблюдаемый результат.
     
                                                             Таблица 3
     
             ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИДОВ
                             РОДА VIBRIO
     
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|Признаки             |V.      |V.           |V.            |V.     |V.       |V.       |V.     |V.      |V.           |V.     |V.              |V.        |
|                     |cholerae|alginolyticus|cicinnatiensis|damsela|fluvialis|furnissii|harveyi|hollisae|metschnikovii|mimicus|parahaemolyticus|vulnificus|
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|1                    |2       |3            |4             |5      |6        |7        |8      |9       |10           |11     |12              |13        |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Морфология           |        |             |              |       |         |         |       |        |             |       |                |          |
|<*>                  |+       |+            |+             |d      |d        |+        |-      |+/-     |d            |+      |+               |+         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Подвижность          |        |             |              |       |         |         |       |        |             |       |                |          |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Роение на            |-       |+            |-             |-      |-        |-        |d      |-       |-            |-      |d               |-         |
|агаре                |        |             |              |       |         |         |       |        |             |       |                |          |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Индофенолоксидаза    |+       |+            |+             |+      |+        |+        |+      |+       |-            |+      |+               |+         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Образование:         |        |             |              |       |         |         |       |        |             |       |                |          |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|газа из глюкозы      |-       |-            |-             |-      |-        |+        |-      |-       |-            |-      |-               |-         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|индола               |+       |+            |-             |-      |-        |+(-)     |+      |+       |+(-)         |+      |+               |+         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|ацетилметилкарбинола |+(-)    |+            |+/-           |+      |-        |-        |d      |-       |+            |-      |-               |-         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Ферментация:         |        |             |              |       |         |         |       |        |             |       |                |          |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|лактозы              |-       |-            |-             |-      |-        |-        |-      |-       |+(-)         |-(+)   |-               |d         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|арабинозы            |-       |-            |+             |-      |+        |+        |-      |+       |-            |-(+)   |+/-             |-         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|сахарозы             |+       |+            |+             |-      |+        |+        |d      |-       |+            |-      |-               |-         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|целлобиозы           |-       |-            |+             |-      |- (+)    |- (+)    |d      |-       |-            |-      |-               |+         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|маннита              |+       |+            |-             |-      |+        |+        |d      |-       |+            |+      |+               |+(-)      |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|салицина             |-       |-            |+             |-      |+/-      |-        |-      |-       |-            |-      |-               |+         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Аргининдигидролаза   |-       |-            |-             |+      |+        |+        |-      |-       |-(+)         |-      |-               |-         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Лизиндекарбосилаза   |+       |+            |+             |+(-)   |-        |-        |+      |-       |+(-)         |+      |+               |+         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Орнитиндекарбоксилаза|+       |d            |-             |-      |-        |-        |-      |-       |-            |+      |+               |+         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|бета-галактозидаза   |+       |-            |+/-           |-      |d        |d        |-      |-       |d            |+      |-               |d         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Нитратредуктаза      |+       |+            |+             |+      |+        |+        |+      |+       |-            |+      |+               |+         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Амилаза              |+       |+            |+             |X      |+        |d        |+      |X       |+            |-      |+               |+         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Желатиназа           |d       |+            |-             |-      |+/-      |d        |-      |-       |d            |d      |+               |d         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Рост в 1%-ной        |        |             |              |       |         |         |       |        |             |       |                |          |
|пептонной            |        |             |              |       |         |         |       |        |             |       |                |          |
|воде                 |        |             |              |       |         |         |       |        |             |       |                |          |
|с NaCL:              |+       |-            |-             |-      |- (+)    |- (+)    |-      |-       |-(+)         |+      |-               |-         |
|0%                   |        |             |              |       |         |         |       |        |             |       |                |          |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|3%                   |+       |+            |+             |+      |+        |+        |+      |+       |-(+)         |+      |+               |+         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|6%                   |d       |+            |+             |+      |+        |+        |+      |d       |d            |d      |+               |d         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|10%                  |-       |+            |-             |-      |- (+)    |-        |-      |-       |-            |-      |-               |-         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Рост при:            |        |             |              |       |         |         |       |        |             |       |                |          |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|4 ёC                 |-       |-            |-             |-      |-        |-        |-      |X       |-            |-      |-               |-         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|20 ёC                |+       |+            |-             |-      |+        |+        |+      |X       |+            |X      |+               |+         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|35 ёC                |+       |+            |+             |+      |+        |+        |+      |X       |+            |+      |+               |+         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|42 ёC                |+       |+            |-             |-      |d        |-        |d      |X       |d            |d      |d               |d         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|45 ёC                |-       |-            |-             |-      |d        |-        |-      |X       |d            |X      |-               |-         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Биолюминесценция     |-(+)    |-            |-             |-      |-        |-        |d      |-       |-            |-      |-               |-         |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Чувствительность     |+       |-(+)         |-(+)          |+      |d        |-        |+      |d       |+            |+      |-(+)            |+         |
|к О129               |        |             |              |       |         |         |       |        |             |       |                |          |
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

     ------------------------------------
     <*> Грамотрицательные прямые или изогнутые палочки.

     Условные обозначения: см. обозначения табл. 2;
     d - различный результат.
     
                                                             Таблица 4
     
     ОТНОШЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ ВИБРИОНОВ К ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИМ УГЛЕВОДАМ
     
----------------------------------------------------------------
|Виды               |Ферментация                               |
|вибрионов          |------------------------------------------|
|                   |арабинозы    |маннозы        |сахарозы    |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. cholerae        |-            |+(-)           |+           |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. mimicus         |-            |+              |-           |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. metschnikovii   |-            |+/-            |+           |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. fluvialis       |+            |+              |+           |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. vulnificus      |-            |+(-)           |-(+)        |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. alginolyticus   |-            |+              |+           |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V.                 |+(-)         |+              |-(+)        |
|parahaemolyticus   |             |               |            |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. hollisae        |+            |-(+)           |-           |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. furnissii       |+            |+(-)           |+           |
|                   |с образованием газа                       |
|-------------------|------------------------------------------|
|V. damsela         |-            |+              |-           |
|                   |с образованием газа у некоторых штаммов   |
|-------------------|------------------------------------------|
|V.                 |+            |X              |+           |
|cincinnatiensis    |             |               |            |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. harveyi         |-            |X              |+(-)        |
----------------------------------------------------------------

     Условные обозначения:
     () - в скобках указан редко встречающийся вариант;
     +/- - приблизительно 50% штаммов не обладают этими признаками;
     X - нет данных.
     
     Возбудителями холеры    являются   V.   cholerae   O1   (биоваров
классического и эльтор;  сероваров Инаба,  Огава или Гикошима) и  O139
серогрупп.
     Токсигенные, эпидемически значимые варианты холерных вибрионов O1
и  O139  серогрупп,  содержащие  гены  холерного  токсина  (ctx  АВ) и
токсинкорегулируемых пилей  (tcp  А),  вызывают  заболевания  холерой,
склонные к широкому эпидемическому распространению.
     Нетоксигенные (не    содержащие    гена    холерного    токсина),
эпидемически  не  опасные  варианты  холерных  вибрионов  O1  и других
серогрупп  могут  вызывать  спорадические  или  групповые  (при  общем
источнике   инфицирования)   заболевания,   не   склонные  к  широкому
эпидемическому распространению.
     Предварительную идентификацию  проводят  по  комплексу признаков,
включая морфологию колоний, морфологию и подвижность микробных клеток,
пробу  на  оксидазу  и  слайд-агглютинацию  с  сыворотками  O1 (1:50 -
1:100), РО (1:50) и O139 (в разведении, соответствующем обозначению на
этикетке).  Для  культур,  положительно  реагирующих  с сывороткой O1,
устанавливают  принадлежность  к  серологическим  вариантам  (Инаба  и
Огава) также в слайд-агглютинации.
     Окончательную идентификацию выделенных  на  полиуглеводной  среде
или  щелочном  агаре  агглютинирующихся  на стекле культур проводят по
сокращенной или полной схеме.
     Сокращенная схема предусматривает изучение культуры в развернутой
реакции агглютинации с холерными сыворотками O1,  Инаба,  Огава и  РО,
определение    чувствительности    к   диагностическим   бактериофагам
классическому и эльтор,  отношения к глюкозе в среде Хью  -  Лейфсона,
сахарозе,  маннозе,  манниту  и  арабинозе  в  средах Гисса.  Культуры
оксидазопозитивных,  активно подвижных вибрионов, расщепляющие глюкозу
в  среде Хью - Лейфсона до кислоты без газа,  ферментирующие сахарозу,
маннозу,  маннит в средах Гисса и инактивные по отношению к арабинозе,
агглютинирующиеся  не менее чем до 1/2 титра сыворотками O1 и одной из
варианто-специфических сывороток,  относят к V.  cholerae O1  серовара
Огава     или     Инаба.     Культуры,     агглютинирующиеся    обеими
варианто-специфическими сыворотками не менее чем до 1/2 титра, относят
к  серовару Гикошима.  В случае агглютинабельности выделенной культуры
обеими  варианто-специфическими  сыворотками  целесообразно  повторить
исследование с использованием различных серий коммерческих препаратов.
     Для подтверждения выделенной культуры холерных вибрионов  к  O139
серогруппе достаточно положительного результата в слайд-агглютинации с
соответствующей сывороткой.
     Полная схема  идентификации культур,  агглютинирующихся холерными
сыворотками   O1   серогруппы,   предусматривает   изучение   их    по
дополнительным   тестам,   определяющим   принадлежность   к   биовару
(гемагглютинация, чувствительность к полимиксину, биовароспецифическим
фагам,  реакция  Фогес - Проскауэра),  определение антибиотикограммы и
эпидемической значимости по чувствительности к ctx+  и  ctx-  фагам  в
сочетании   с   тестом  Грейга  на  гемолиз,  а  в  специализированных
учреждениях кроме того - по результатам исследования  в  ПЦР,  методом
молекулярного   зондирования  на  наличие  гена  холерного  токсина  и
определения холерогенности на модели кроликов-сосунков.
     В случае  выделения культур холерных вибрионов O139 серогруппы их
также  изучают  по   чувствительности   к   антибиотикам,   определяют
эпидемическую значимость ориентировочно по гемолитической активности в
пробе Грейга, окончательно - указанными выше специальными методами.
     На культуры,  имеющие  характерные для вибрионов морфологические,
культуральные и биохимические признаки,  агглютинирующиеся O1 и  одной
из  варианто-специфических  сывороток  не  менее  чем  до  1/2  титра,
лизирующиеся и не лизирующиеся холерным и эльтор фагами,  а  также  на
культуры,  агглютинирующиеся  сывороткой  O139,  выдают  окончательный
ответ,  указывая  чувствительность  их  к  антибиотикам  и   определяя
эпидемическую    значимость   по   результатам   ориентировочных   или
специальных исследований.
     Токсигенные штаммы  холерных  вибрионов O1 и O139 серогрупп,  как
правило,  не лизируют эритроциты барана,  в отличие  от  нетоксигенных
штаммов.
     Кроме того, для холерных вибрионов O1 серогруппы указывают биовар
на  основании  чувствительности  к  одному  из  диагностических  фагов
(эльтор или классическому) и (или)  по  дополнительным  признакам  для
фагорезистентных культур (табл. 5).
     
                                                             Таблица 5
     
          ПРИЗНАКИ, ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИЕ БИОВАРЫ V. CHOLERAE O1
     
---------------------------------------------------------------

Страницы: 1  2  3  


Оглавление