Примечание. Данные приведены для методов серийных разведений в
бульоне.
Таблица 11
ЗНАЧЕНИЯ ВЕЛИЧИН ДИАМЕТРОВ ЗОН ИНГИБИЦИИ РОСТА (ММ)
ДЛЯ РЕФЕРЕНТНЫХ ШТАММОВ
----------------------------------------------------------------
|Антибиотики |Содержание|Е. |S. |P. |
| |в диске, |coli |aureus |aeruginosa|
| |мкг |АТСС |АТСС |АТСС 27853|
| | |25922 |25923 | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Ампициллин |10 |16 - |27 - 35 |- |
| | |22 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Цефтибутен |30 |27 - |- |- |
| | |35 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Цефотаксим |30 |29 - |25 - 31 |- |
| | |35 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Цефтриаксон |30 |29 - |22 - 28 |17 - 23 |
| | |35 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Налидиксовая к-та |30 |22 - |- |- |
| | |28 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Норфлоксацин |10 |28 - |17 - 28 |22 - 29 |
| | |35 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Ципрофлоксацин |5 |30 - |22 - 30 |25 - 33 |
| | |40 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Офлоксацин |5 |29 - |24 - 28 |17 - 21 |
| | |33 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Ломефлоксацин |10 |27 - |23 - 29 |22 - 28 |
| | |33 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Амикацин |30 |19 - |20 - 26 |18 - 26 |
| | |26 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Гентамицин |10 |19 - |19 - 27 |16 - 21 |
| | |26 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Нетилмицин |30 |22 - |22 - 31 |17 - 23 |
| | |30 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Тобрамицин |10 |18 - |19 - 29 |19 - 25 |
| | |26 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Канамицин |30 |17 - |19 - 26 |- |
| | |25 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Хлорамфеникол |30 |21 - |19 - 26 |- |
| | |27 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Тетрациклин |30 |18 - |24 - 30 |- |
| | |25 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Доксициклин |30 |18 - |23 - 29 |- |
| | |24 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Рифампин |5 |8 - 10 |26 - 34 |- |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Нитрофурантоин |300 |20 - |18 - 22 |- |
| | |25 | | |
|---------------------|----------|-------|----------|----------|
|Ко-тримоксазол |1,25/23,7 |24 - |24 - 32 |- |
|(1/19) |5 |32 | | |
----------------------------------------------------------------
7. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, РЕАКТИВЫ, КОНСЕРВАНТЫ.
ПОРЯДОК КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
7.1. Питательные среды
Транспортные среды:
- 1-процентная пептонная вода, рН 8,5 +/- 0,1, без ингибиторов
роста сопутствующей флоры и с теллуритом калия (см. среды обогащения);
- 2-процентный раствор поваренной соли: 20 г хлорида натрия и 0,1
г едкого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды; жидкость
фильтруют через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в пробирки и
стерилизуют в автоклаве 20 мин. при 0,7 атм.
Среды обогащения
а) Основной раствор пептона готовят по следующей прописи:
Пептон сухой - 100,0
Натрия хлорид - 50,0
Калия нитрат - 10,0
Натрия карбонат - 25,0
Дистиллированная вода - 1 л
рН 8,4 +/- 0,1.
В холодную дистиллированную воду погружают пептон, хлорид и
карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного
растворения пептона, не допуская его пригорания, затем добавляют
нитрат калия. Проверяют реакцию среды, если нужно, рН доводят до 8,5
+/- 0,1. Раствор фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр,
разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве 20 мин. при 1 атм.
Основной раствор пептона сохраняется до 2 лет.
б) 1-процентная пептонная вода
Для получения 1-процентной пептонной воды концентрированный
раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой. После установления
рН 8,5 +/- 0,1 разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют 20
мин. при давлении 0,7 атм.
1-процентную пептонную воду можно готовить и непосредственно из
отдельных компонентов, взяв навески в 10 раз меньше указанных в
рецепте основного пептона. Технология приготовления такая же, как и
основного пептона.
в) Пептонная вода с теллуритом калия
В 1-процентную пентонную воду (рН 8,5 +/- 0,1) после
автоклавирования добавляют теллурит калия в конечном разведении
1:100000 или 1:200000. Предварительно готовят рабочий 0,1-процентный
раствор теллурита калия (1:1000). Срок хранения рабочих растворов 7
дней.
Плотные среды для выделения холерных вибрионов.
Щелочной мясопептонный агар:
Мясная вода - 1 л
Пептон - 10,0
Натрия хлорид - 5,0
Агар-агар - 20,0
рН 8,0 +/- 0,2.
В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и
подщелачивают 20-процентным раствором едкого натра до рН 8,3 +/- 0,1.
Затем добавляют агар-агар и содержимое помещают в автоклав для варки
среды в начале текучим паром в течение 30 - 40 мин., а затем при 1
атм. 20 мин. Если мясопептонный агар варят на плите, среду кипятят до
полного расплавления агар-агара при постоянном помешивании.
Для получения прозрачной агаровой среды ее после варки с целью
отстоя на 2 - 3 ч оставляют в автоклаве или помещают в термостатную
комнату при температуре 43 +/- 2 ёC, время отстоя лучше продлить до 18
- 20 ч. Отстоявшийся агар осторожно, не взбалтывая, сливают с осадка
на плотный ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют реакцию среды,
если требуется, подкисляют ее, но подщелачивать агар на данном этапе
не рекомендуется во избежание выпадения осадка при стерилизации
готовой среды. Профильтрованный агар разливают в посуду и стерилизуют
при 1,0 атм. 20 мин.
Элективные среды.
Рекомендуется использовать питательную среду - для выделения
холерных вибрионов элективно-дифференциальную, сухую, СЭДХ.
Среда обладает выраженными элективными свойствами, обеспечивая
ингибицию сопутствующей микрофлоры (энтеробактерий, протея, кокков и
др.) и практически не влияет на рост вибрионов. Холерные вибрионы O1 и
не O1 групп через 12 - 18 ч формируют на этих средах плоские
прозрачные колонии желтого цвета за счет ферментации сахарозы,
диаметром 1,0 - 2,0 мм; V. parahaemolyticus - мелкие, голубоватые
(цвета среды) с уплотненным центром; V. alqinolyticus - крупные,
желтые; колонии Pseudomonas, Aeromonas - голубые; Enterobacteriaceae -
очень мелкие плотные или полупрозрачные, иногда окрашены в желтый
цвет; колонии протея, как правило, не роятся.
Среды для идентификации вибрионов.
Среды с углеводами для отбора колоний:
Среда Ресселя:
Пептон - 5,0
Натрия хлорид - 5,0
Лактоза - 10,0
Глюкоза - 1,0
Агар-агар - 10,0
Индикатор Андреде - 40 мл
Вода дистиллированная - 1 л
рН 7,3 +/- 0,1.
Среду варят, фильтруют, разливают по 5 - 7 мл в стерильные
пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Готовую среду
после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк.
Среда светлая.
Среду можно готовить на 1 - 1,3-процентном питательном агаре,
добавляя к нему в соответствующих концентрациях углеводы и индикатор
Андреде.
Лактозосахарозная среда.
Готовится, как и среда Ресселя, но вместо глюкозы берут сахарозу
в том же количестве.
Среда Клиглера:
1,5 - 1,7-процентный мясопептонный агар или другой слабощелочной
питательный агар - 1 л
Лактоза - 10,0
Глюкоза - 1,0
2-процентный раствор серно-кислого закисного железа - 10,0 мл
0,8-процентный раствор тиосульфата натрия - 10,0 мл
0,4-процентный раствор сульфата натрия - 10,0 мл
1-процентный раствор фенолового красного - 24,0 мл
рН 7,3 +/- 0,1.
Вначале в расплавленном питательном агаре (рН 7,7 +/- 0,1)
растворяют углеводы, затем к нему добавляют свежеприготовленные
растворы железа и солей натрия согласно прописи среды (индикатор на
сероводород). Кроме того, для регистрации кислотообразования добавляют
индикатор феноловый красный. Среду варят, фильтруют, разливают по 5 -
7 мл в стерильные пробирки, стерилизуют 20 мин. при давлении 0,5 атм.
и скашивают по типу среды Ресселя. рН готовой среды 7,3 +/- 0,1, цвет
красный.
Маннозосахарозная среда:
1,5% питательный агар - 1 л
Манноза - 1,0
Сахароза - 10,0
Серно-кислое железо (FeSO4) - 0,2
Гипосульфит натрия (Na2SO3 x 5H2O) - 0,08
Сульфит натрия (Na2SO3) - 0,4
0,2% феноловый красный - 10,0.
После расплавления рН среды довести до 8,0, разлить в пробирки по
5 - 7 мл и стерилизовать при 0,7 атм. 15 мин. Готовую среду после
стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк.
Среды для идентификации.
Среды Гисса.
К 100 мл 1% пептонной воды (рН 7,3 +/- 0,1) без селитры добавляют
0,5 - 1% необходимого углевода или спирта (L-арабиноза, D-манноза,
D-сахароза, D-маннит, L-инозит, D-глюкоза, растворимый крахмал и др.)
и 1% индикатора Андреде или 0,1 мл 1,6% раствора бромтимолового
синего. Среды разливают в стерильные пробирки с поплавками и
стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин.; среду с L-арабинозой следует
стерилизовать в течение 20 мин. при 0,1 - 0,2 атм. Для приготовления
сред Гисса можно применять только перечисленные изомеры углеводов.
Готовые среды Гисса с индикатором Андреде светлые, при
кислотообразовании краснеют. Среды с бромтимоловым синим зеленого
цвета с травянистым оттенком, при кислой реакции - желтого цвета, при
щелочной - синего.
Среда Хью - Лейфсона:
Пептон - 2,0
Натрия хлорид - 5,0
Двузамещенный фосфат калия - 0,3
Глюкоза - 10,0
Бромтимоловый синий - 0,03
Агар-агар - 3,0
Дистиллированная вода - 1 л
рН 7,1 +/- 0,1.
К воде добавляют пептон, натрия хлорид и агар-агар. Смесь
подогревают до расплавления агара, затем вносят фосфат калия и
глюкозу, продолжают кипятить 2 - 3 мин. Смесь подщелачивают
20-процентным раствором едкого натрия до рН 7,4 +/- 0,1, доводят объем
среды до первоначального и добавляют 3 мл 1-процентного водного
раствора бромтимолового синего. Затем среду фильтруют через
ватно-марлевый фильтр, разливают по 4 - 5 мл в стерильные пробирки и
стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Цвет среды до стерилизации
синий, а после автоклавирования травянисто-зеленый, рН 7,1 +/- 0,1.
При кислой реакции среда желтеет.
Бульон Кларка:
Пептон - 5,0
Глюкоза - 5,0
Двузамещенный фосфат калия - 5,0
Дистиллированная вода - 1 л.
Смесь ингредиентов нагревают до полного их растворения, затем
фильтруют через бумажный фильтр и разливают по 5 мл в стерильные
пробирки. Бульон стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин.
Среда Кодама.
В 1-процентную пептонную воду добавляют 0,5% растворимого
крахмала. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин.
под давлением 0,5 атм. Для оценки результатов расщепления крахмала
используют реактив Люголя.
Среда с желатиной.
К мясопептонному бульону или бульону Хоттингера прибавляют мелко
нарезанную желатину из расчета 10,0 - 15,0 г на 100 мл (летом
концентрацию желатины увеличивают до 20%). Желатине дают набухать в
течение 30 мин. и затем растворяют при медленном нагревании в водяной
бане при температуре (45,0 +/- 5,0) ёC. Устанавливают рН 7,1 +/- 0,1,
прибавляя к расплавленной желатине 10-процентный раствор
двууглекислого натрия. При более щелочной реакции желатина застывает
плохо, а иногда и совсем не застывает. В 1 л растворенной желатины
вносят для просветления два взбитых с небольшим количеством
дистиллированной воды яичных белка. Смесь перемешивают и прогревают
текучим паром в течение 20 мин. до полного свертывания белка и
просветления среды. Затем среду фильтруют в горячем состоянии через
бумажный или ватно-марлевый фильтр с большой поверхностью. Среду,
разлитую по 5 - 8 мл в пробирки, стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20
мин. После стерилизации среду охлаждают путем погружения пробирок в
холодную воду в строго вертикальном положении, чтобы верхняя часть
столбика при застывании оставалась совершенно ровной.
Среда для определения декарбоксилаз и дигидролаз аминокислот:
Пептон - 5,0
Дрожжевой экстракт - 25,0 (сухой 3,0)
Глюкоза - 1,0
Натрия хлорид - 5,0
Натрия карбонат - 0,1
Бромтимоловый синий (0,1-процентный р-р в 20-процентном спирте) -
45,0 (0,045 г сухого)
Аминокислота - 10 - 20,0
Дистиллированная вода - 1 л
рН 6,4 +/- 0,1.
Все ингредиенты по прописи вышеуказанной среды растворяют при
нагревании, устанавливают рН 6,4 +/- 0,1, затем добавляют
соответствующий индикатор и делят среду на 4 равные части. В одну
часть аминокислоты не добавляют, эта порция служит контролем. В
остальные порции вносят соответственно: в первую - 1% лизина, во
вторую - 1% орнитина, в третью - 1% аргинина. Аминокислоты должны быть
в L-форме, если имеются D-аминокислоты, то добавляют 2%, т.к.
микроорганизмы активны только в отношении L-форм. После добавления
аминокислот перед стерилизацией, в случае необходимости, реакцию среды
исправляют 0,1-процентным раствором соляной кислоты. Среду разливают
по 1 - 2 мл в химически чистые стерильные пробирки и стерилизуют при
давлении 0,1 - 0,2 атм. 20 мин. Небольшое количество флокулята в
средах не имеет значения. Пептонно-дрожжевая среда имеет
травянисто-зеленый цвет, при кислой реакции среда желтеет, при
щелочной - синеет.
Среды для определения гемолитической активности.
Сердечно-мозговой настой:
Сердечный настой - 500,0 мл
Мозговой настой - 500,0 мл
Пептон - 10,0 г
Натрия хлорид - 5,0 г
рН 7,3 +/- 0,1.
Смесь кипятят до полного растворения пептона и соли,
устанавливают необходимую реакцию, разливают в пробирки по 4,0 - 5,0
мл, стерилизуют при 0,7 атм. 20 мин.
Мясопептонный бульон:
Мясная вода с 1-процентным сухим пептоном и 0,85-процентной
поваренной соли. Способ приготовления, стерилизации тот же, что для
сердечно-мозгового настоя.
7.2. Реактивы
а) Для определения образования индола
Реактив Эрлиха:
Парадиметиламинобензальдегид - 1,0 г
Этиловый спирт - 95,0 мл
Концентрированная соляная кислота - 20,0 мл.
Альдегид растворяют в спирте, затем добавляют кислоту, смешивают,
хранят в темном месте.
Полоски фильтрованной бумаги пропитывают насыщенным раствором
щавелевой кислоты и высушивают в термостате.
б) Для выявления образования сероводорода
Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором
уксусно-кислого свинца. Подсушивают на воздухе.
Полоски индикаторных бумажек на индол и сероводород помещают под
пробку пробирки с засеянной культурой. В случае образования индола
полоска краснеет, а при образовании сероводорода полоска чернеет.
в) Для определения нитратредуктазы:
Готовят отдельно два раствора. Первый - путем растворения при
нагревании в фарфоровой ступке в 20 мл дистиллированной воды 0,2 мг
альфа-нафтиламина (C10H7NH2). Жидкость осторожно вливают в 150 мл
12-процентного раствора уксусной кислоты. Второй - 0,5 г сульфаниловой
кислоты (C6H4NH2SO3H) растворяют в 150 мл 12-процентной уксусной
кислоты.
Затем оба раствора сливают в темную склянку с хорошо притертой
пробкой. Реактив Грисса должен быть бесцветным, если он розовеет, то
им не пользуются.
Сложность приготовления реактива Грисса, дефицитность и
токсичность входящих в него компонентов (в частности,
альфа-нафтиламина) ограничивают возможности его применения. Этих
недостатков лишен метод с использованием риванолового реактива,
представляющего собой смесь равных объемов 0,1-процентного раствора
риванола в дистиллированной воде и 12-процентного раствора соляной
кислоты. В случае положительной реакции культура испытуемого штамма,
выращенная в бульоне или 1-процентной пептонной воде с 0,1% KNO3,
окрашивается в красный цвет.
г) Для определения бета-галактозидазной активности приготавливают
М/75 раствор орто-нитрафенил-бета-Д-галактопиранозида (ОНФГ):
ОНФГ - 80 мг
Дистиллированная вода - 75 мл
Фосфатный буфер - 5 мл.
ОНФГ растворяют в дистиллированной воде при 37 ёC, затем
добавляют раствор однозамещенного фосфорно-кислого натрия (NaH2PO4 х
H2O). рН доводят до 7,0. Раствор должен быть бесцветным, хранят при
температуре 4 ёC. Перед использованием раствор выдерживают в течение
нескольких минут до растворения фосфата, который на холоде
кристаллизируется.
7.3. Консерванты для сохранения дефибринированной крови
Консервант с борной кислотой:
Борная кислота - 40,0 г
Глюкоза - 50,0 г
0,9-процентный раствор натрия хлорида - до 1 л.
Стерилизуют на водяной бане или текучим паром при 100 ёC по 20
мин. в течение 3 дней.
100 мл дефибринированной крови барана соединяют с 15 мл
консерванта с борной кислотой.
Консервант Алсевера:
Сахароза (или глюкоза) - 20,5
Хлористый натрий - 8,0
Цитрат натрия - 4,2
Дистиллированная вода - до 1,0 л
рН - 6,1 доводится 10-процентным раствором лимонной кислоты.
Стерилизуют на водяной бане или текучим паром при температуре 100
ёC по 20 мин. в течение 3 дней.
Консервант Алсевера и дефибринированную кровь соединяют поровну.
Консервированную кровь хранят при температуре 4 +/- 1 ёC.
7.4. Порядок контроля качества питательных сред
Питательные среды, консерванты, ингибиторы посторонней
микрофлоры, используемые в диагностике холеры, подлежат обязательной
проверке.
Бактериологический контроль качества плотных и жидких питательных
сред могут проводить лаборатории противочумных и других учреждений,
имеющие разрешение на работу с возбудителем холеры, применяя для
контроля тест-штаммы Vibrio cholerae P-1(145) и Vibrio cholerae eltor
M-878, а также лаборатории особо опасных инфекций центров
госсанэпиднадзора и ведомственных учреждений с использованием
тест-штамма авирулентного холерного вибриона не O1 серогруппы Р-9741 в
порядке, определяемом действующими методическими указаниями по
контролю питательных сред.
Бактериологическому контролю подлежит каждая серия сухой среды
производственного выпуска, имеющая номер государственной регистрации,
лицензии на ее производство и соответствующий срок годности, а также
среды лабораторного изготовления.
На контроль направляют часть общего объема среды,
предназначенного для проведения исследований, в количестве 200 мл
агара и 100 мл основного раствора пептона производственного выпуска и
в двойном объеме для серий лабораторного изготовления. В направлении
следует указать название среды, предприятие-изготовитель, номер серии
и срок годности сухой среды, дату контролируемой варки.
Транспортируемые образцы должны быть надежно упакованы, флаконы с
жидкой средой закрыты резиновыми пробками.
Оптимальный срок проверки питательной среды - 10 - 14 дней после
приготовления.
При положительном результате контроля пробы соответствующая серия
сухой среды считается пригодной к использованию. Последующий контроль
этой серии среды осуществляется ежегодно, а также при изменении
условий приготовления сухой среды, независимо от времени предыдущей
проверки.
Если при первом контроле среда оказалась непригодной, необходим
повторный бактериологический контроль этой же серии сухой среды, при
этом на контроль необходимо направлять образец новой варки и навеску
сухой среды этой же серии.
При получении отрицательного результата повторного контроля
среды, приготовленной на месте, и положительного бактериологического
контроля образца этой же серии сухой среды, сваренного в лаборатории
контролирующего учреждения, следует считать пригодной данную серию
сухой питательной среды и принять меры к выяснению и устранению ошибки
в технологии местного изготовления.
При получении отрицательного результата на образец сухой среды
данной серии направляют рекламацию в адрес учреждения-изготовителя и
ГИСК им. Тарасевича.
Срок хранения щелочного агара и основного раствора пептона
производственного выпуска (сухая среда и приготовленные из нее
образцы) указаны в инструкции предприятия-изготовителя по применению
среды.
Для сред лабораторного изготовления определены следующие сроки
хранения:
- для щелочного агара - 6 месяцев с момента изготовления и
первичного контроля, по истечении этого срока допускается переконтроль
и продление срока годности еще на 3 месяца;
- для основного раствора пептона - 2 года с контролем качества
среды после приготовления, затем спустя 1 - 1,5 года хранения.
Срок хранения 1-процентной пептонной воды при герметичной
упаковке (резиновые пробки и металлические колпачки) - 2 месяца, а
после переконтроля возможно продление срока хранения на 1 месяц.
Питательные среды, готовые к употреблению, хранят в темном
прохладном месте (6 - 20 ёC), не допуская перепада температур больше
чем на 5 ёC. Подъем и снижение температур губительно действуют на
биологические свойства сред.
Щелочной агар и основной пептон, контролируемые авирулентным
тест-штаммом холерного вибриона, подлежат периодической перепроверке
по согласованию с территориальными центрами госсанэпиднадзора и
противочумными учреждениями на базе последних вирулентными
тест-штаммами. Ежегодному контролю в территориальном противочумном
учреждении подлежит также теллурит калия.
8. МЕТОДЫ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРЫ
Серологические методы исследования, как правило, имеют
дополнительное значение и лишь в отдельных случаях, при проведении
оперативного и ретроспективного эпидемиологического анализа, их
результаты могут быть решающими.
Для серологической диагностики холеры используют иммунологические
реакции, выявляющие в сыворотке крови больных, переболевших и
вибриононосителей, а также вакцинированных специфические антитела:
агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела.
У больных холерой на 5 - 7 день от начала заболевания появляются
агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела в высоких титрах.
Титры антитоксинов нарастают более медленно.
Необходимо исследовать парные сыворотки с интервалом в 7 - 10
дней. Первая проба должна быть взята на 2 - 3 день болезни, а вторая -
через 5 - 7 дней для оперативной диагностики и через 7 - 10 дней и
более - для ретроспективной.
Кровь для серологических исследований берут из вены, а при
отсутствии такой возможности из пальца. Из вены берут 1 - 5 мл крови,
после свертывания сгусток отслаивают от стенки пробирки стерильной
стеклянной палочкой или платиновой петлей. Пробирки сохраняют в
холодильнике и транспортируют в лабораторию охлажденными (в термосе,
сумке-холодильнике и др.). В лаборатории сыворотку инактивируют при
температуре (56,0 +/- 0,5) ёC 30 минут.
Если кровь забирают в день постановки реакции, пробирки со
свернувшейся кровью необходимо центрифугировать 10 - 15 минут при 3000
об./мин. При отсутствии возможности исследовать сыворотку немедленно
ее сохраняют в ампулах при температуре (4,0 +/- 0,5) ёC. Кровь из
пальца берут в объеме 0,4 мл и вносят в стерильный пенициллиновый
флакон или пробирку с 1,6 мл 0,9% раствора хлорида натрия (1:5).
8.1. Определение агглютининов в сыворотке крови
Обнаружение противохолерных антител методом развернутой реакции
агглютинации.
Исследуемую сыворотку разводят 1-процентной пептонной водой рН
7,5 +/- 0,1 в объеме 1 мл от 1:10 до 1:640. В качестве антигена
используют 3-часовую бульонную культуру, выделенную в данном очаге,
или исследуют в 3 рядах с культурами холерных вибрионов (сероваров
Огава, Инаба и O139 серогруппы). В пробирку с раститрованной
сывороткой вносят по 1 капле культуры-антигена и ставят на 1 ч в
термостат, затем до утра в холодильник при температуре (4,0 +/- 0,5)
ёC, после чего отмечают результаты. Реакция сопровождается контролями
антигена и сыворотки.
При определении титра реакции учитывают разведения с
агглютинацией на 3 - 4 креста.
Результат исследования сыворотки больного при реакции
агглютинации в разведении 1:40 и выше считается ориентировочно
положительным.
Диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание
титров антител.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с диагностикумом
эритроцитарным холерным антигенным.
РНГА предназначена для выявления полных антител в сыворотке
крови. Это достаточно специфичная и чувствительная двухкомпонентная
реакция. По чувствительности значительно превосходит реакцию
агглютинации. Необходимые ингредиенты, методика постановки в макро- и
микрообъемах изложены в наставлении к диагностикуму эритроцитарному
холерному антигенному.
Результат исследования сыворотки больного в разведении 1:40 и
выше считается ориентировочно положительным.
Диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание
титров антител.
Реакция нейтрализации антигена (РНАг).
РНАг служит для выявления антител в сыворотке крови с
использованием диагностикума эритроцитарного холерного
иммуноглобулинового. РНАг - высокоспецифическая трехкомпонентная
реакция. Ее принцип заключается в специфической нейтрализации
добавляемого антигена полными и неполными антителами, содержащимися в
сыворотке. Необходимые ингредиенты, методика постановки в макро- и
микрообъемах изложены в инструкциях по применению к диагностикуму
эритроцитарному холерному иммуноглобулиновому.
При использовании системы реакций РНГА и РНАг отпадает
необходимость в постановке контроля специфичности с каждой исследуемой
сывороткой, т.к. эти две реакции взаимно контролируют полученные
результаты.
Результат исследования сыворотки больного в РНАг в разведении
1:50 (1:80) и выше считается ориентировочно положительным.
Диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание
титров антител при исследовании парных сывороток в РНГА и РНАг.
8.2. Определение вибриоцидных антител в сыворотке
крови (РВА)
Вибриоцидные антитела в крови больных обнаруживаются с 1 - 3
-1 -3
дня болезни в титрах 10 - 10 и достигают максимальных значений
-4 -8
10 - 10 к 10 - 12 дню. Принцип метода во всех его вариантах
заключается в том, что в присутствии вибриоцидных антител не
происходит размножения холерных вибрионов.
При проведении серологических исследований в очаге, обусловленном
возбудителем холеры определенного серовара, в реакции используют один
штамм соответствующего серовара, при отсутствии этих данных - два
штамма обоих сероваров.
Материалы и оборудование:
- исследуемые сыворотки, инактивированные прогреванием 30 мин.
при температуре (56,0 +/- 0,5) ёC;
- сухой комплемент или свежеполученная сыворотка морской свинки в
разведении 1:20;
- 0,9-процентный раствор хлорида натрия рН 7,2 +/- 0,1;
- штаммы холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба, типичные в
S-форме, не чувствительные к комплементу;
- чашки Петри со щелочным агаром;
- лоток со льдом;
- термостат на (37,0 +/- 1,0) ёC.
Методика постановки реакции.
Комплемент, разведенный 0,9-процентным раствором хлорида натрия
1:20, разливают в два ряда пробирок по 0,9 мл. В первую пробирку
вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и после тщательного перемешивания
-10
последовательно переносят по 0,1 мл до разведения 10 , получая
десятикратные разведения сыворотки в объеме 0,9 мл. Титрацию сыворотки
проводят на льду, который помещают в любую емкость.
Из односуточной агаровой культуры холерного вибриона готовят
взвесь в 0,9-процентном растворе хлорида натрия, содержащего в 1 мл
10000 - 20000 м.к. Стерильной градуированной пипеткой полученную
взвесь по 0,1 мл вносят в опытные пробирки с раститрованной
сывороткой.
Необходимы следующие контроли: а) контроль комплемента (0,9 мл
комплемента и 0,1 мл культуры); б) контроль сыворотки (0,8 мл
0,9-процентного раствора хлорида натрия, 0,1 мл сыворотки и 0,1 мл
культуры); в) контроль культуры (0,9 мл 0,9-процентного раствора
хлорида натрия и 0,1 мл культуры).
Штатив с пробирками на 1 ч помещают в водяную баню или термостат
при температуре (37,0 +/- 0,5) ёC, сделав предварительно высев из
пробирки контроля культуры на 2 пластинки щелочного агара для
определения фактической концентрации живых вибрионов в опытной
суспензии (контроль разведения).
Через 1 ч штатив вновь ставят на лед и из каждой пробирки
отдельной стерильной пипеткой 0,1 мл культуры высевают на чашку со
щелочным агаром рН 7,0 +/- 0,1. Посев равномерно распределяют по
поверхности чашки покачиванием или шпателем. Чашки помещают на 18 - 24
ч в термостат при температуре (37,0 +/- 0,5) ёC, после чего
подсчитывают количество выросших колоний.
В посевах из контрольных пробирок с культурой должно вырастать
количество колоний, близкое к контролю разведения.
Вибриоцидным титром считают максимальное разведение сыворотки,
которое вызывает гибель не менее чем 50% клеток холерного вибриона,
что выявляется при посеве на агаровые пластинки в чашки Петри, по
сравнению с количеством выросших колоний из пробирки контроля
комплемента.
Пример вычисления: при посеве из опытных пробирок с
-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7
разведением сыворотки 10 ; 10 ; 10 ; 10 ; 10 ; 10 ; 10 и т.д. на
чашках соответственно выросло 0; 0; 5; 10; 15; 30; 38 и т.д. колоний.
При высеве из пробирки контроля комплемента также после часовой
инкубации при температуре (37,0 +/- 0,5) град. С выросло 36 колоний,
50% от этого числа будет составлять 18. Из 5-й пробирки выросло 15
колоний, т.е. меньше 50% от количества колоний в контроле (18), в
следующей - 30, т.е. более 50% этого же показателя. Разведение
-5
сыворотки в 5-й пробирке составляет 10 , следовательно, вибриоцидный
-5
титр в данном примере будет составлять 10 .
Определение вибриоцидных антител (ВА) в сыворотке крови на основе
ферментации углеводов.
Об отсутствии или наличии ВА судят по ферментации сахарозы,
регистрируемой с помощью индикатора.
Материалы и оборудование:
- инактивированная сыворотка крови;
- штаммы холерного вибриона серовара Огава и Инаба;
- комплемент, разведенный 1:20 1-процентной пептонной водой,
содержащей 1% сахарозы и 1% индикатора Андреде;
- термостат на (37,0 +/- 1) ёC.
Методика постановки реакции.
Комплемент, разведенный 1:20 1-процентной пептонной водой с
сахарозой и индикатором Андреде, разливают в пробирки по 0,45 мл. В
первую пробирку добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки и после
тщательного перемешивания переносят 0,05 мл смеси во вторую пробирку,
-5 -9
из второй в третью и т.д. (до разведения 10 - 10 ). Готовят
суспензию 18 - 20-часовой агаровой культуры холерного вибриона и
3
разводят 1-процентной пептонной водой до концентрации 10 м.к./мл в 1
мл. Во все пробирки вносят по 0,45 мл суспензии и помещают в
термостат.
Постановку реакции сопровождают следующими контролями:
- 0,45 мл 1-процентной пептонной воды, содержащей 1% сахарозы и
1% индикатора Андреде + 0,05 мл исследуемой сыворотки + 0,45 мл взвеси
культуры, - контроль сыворотки;
- 0,45 мл комплемента с сахарозой и индикатором + 0,45 мл
культуры - контроль комплемента;
- 0,45 мл 1-процентной пептонной воды с сахарозой и индикатором +
0,45 мл культуры - контроль культуры;
- 0,45 мл 1-процентной пептонной воды с сахарозой и индикатором +
0,05 мл исследуемой сыворотки - контроль стерильности сыворотки.
Через 5 - 6 ч проводят учет реакции. При этом в контроле (кроме
контроля стерильности сыворотки) цвет содержимого пробирок должен
перейти в красный или розовый. Изменение цвета индикатора в пробирках
рабочего ряда, связанное с ферментацией сахарозы размножившимися
вибрионами, свидетельствует об отсутствии вибриоцидных антител в
исследуемой сыворотке. За вибриоцидный титр принимают то наибольшее
разведение сыворотки, при котором цвет содержимого пробирок остается
неизмененным или интенсивность его значительно отличается от окраски
контрольных проб. Результат выражают в виде десятичного логарифма
разведения сыворотки, взятого с обратным знаком.
Примечание. Для постановки РВА при холере, обусловленной холерным
вибрионом O139 серогруппы, не может быть использован выделенный в
очаге штамм в связи с возможной чувствительностью его к комплементу. В
этих случаях рекомендуется предложенный специалистами Ростовского
НИПЧИ ctx- клон холерного вибриона O139, направленный на депонирование
в Государственную коллекцию патогенных бактерий "Микроб" (РосНИПЧИ
"Микроб").
8.3. Определение токсиннейтрализующих антител
в сыворотке крови
РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом
(ЭХЭД) предназначена для выявления токсиннейтрализующих антител в
сыворотке крови больных холерой и вибриононосителей, у которых
инфицирование обусловлено холерными вибрионами O1 и O130 серогрупп.
Токсиннейтрализующие антитела появляются на 5 - 7 день болезни,
достигая максимума на 14 - 21 день, затем их титр постепенно
снижается. Иммуноглобулины к холерному токсину, в сравнении с
вибриоцидными и другими специфическими холерными антителами, дольше
циркулируют в сыворотке крови после перенесенной инфекции (до 8 - 10 и
более месяцев). Условно положительным титром РНГА с ЭХЭД следует
считать 1:160 и выше. Целесообразно исследовать парные сыворотки.
Результат РНГА с ЭХЭД позволяет сделать заключение о токсигенности
(эпидемичности) циркулирующего в очаге штамма холерного вибриона, в
т.ч. и без выделения культуры.
Приложение 1
(рекомендуемое)
НАПРАВЛЕНИЕ ПРОБ ОТ ЛЮДЕЙ
в лабораторию ________________________________________________
для исследования на ___________ от "___" _____________ 200_ г.
-------------------------------------------------------------------------------------------------------
|N |N |Первичное|Характер |Ф.И.О. |Возраст|Диагноз|Адрес |Место |Время |Примечание|
|регистрационный|пробы|или |материала| | | |места |работы|отбора|<**> |
|<*> | |повторное| | | | |жительства| |пробы | |
|---------------|-----|---------|---------|-------|-------|-------|----------|------|------|----------|
|1 |2 |3 |4 |5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
|---------------|-----|---------|---------|-------|-------|-------|----------|------|------|----------|
| | | | | | | | | | | |
-------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> Регистрационный номер проставляют в лаборатории.
<**> Указать, принимал(а) ли антибиотики (если да - то какие,
когда и сколько).
Пробы отбирали: ______________________________________________
______________________________________________
(Ф.И.О., должность) (подписи)
Пробы доставил: ______________________________________________
______________________________________________
(Ф.И.О., должность) (подпись)
Время доставки проб __________________________________________
(дата, время - часы, минуты)
Приложение 2
(рекомендуемое)
НАПРАВЛЕНИЕ
ПРОБ ИЗ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
в лабораторию ________________________________________________
для исследования на ___________ от "___" _____________ 200_ г.
----------------------------------------------------------------------------
|N |N |Место |Объект для |Характер |Объем |Время |
|регистрационный|пробы |отбора |исследования|материала|(количество)|отбора |
|<*> | |проб | | | |пробы |
| | | | | | |(час., |
| | | | | | |мин.) |
|---------------|------|-------|------------|---------|------------|-------|
|1 |2 |3 |4 |5 |6 |7 |
----------------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> Регистрационный номер проставляют в лаборатории.
Пробы отбирали: ______________________________________________
______________________________________________
(Ф.И.О., должность) (подписи)
Пробы доставил: ______________________________________________
______________________________________________
(Ф.И.О., должность) (подпись)
Время доставки проб __________________________________________
(дата, время - часы, минуты)
Приложение 3
(обязательное)
УКЛАДКА ДЛЯ ЗАБОРА НАТИВНОГО МАТЕРИАЛА
ОТ БОЛЬНОГО С ПОДОЗРЕНИЕМ НА ЗАБОЛЕВАНИЕ ХОЛЕРОЙ
(ДЛЯ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ УЧРЕЖДЕНИЙ СПЕЦИАЛЬНОГО
НАЗНАЧЕНИЯ, СТАНЦИЙ СКОРОЙ И НЕОТЛОЖНОЙ МЕДИЦИНСКОЙ
ПОМОЩИ, АМБУЛАТОРНО-ПОЛИКЛИНИЧЕСКИХ УЧРЕЖДЕНИЙ,
СКП, СКО, ПСКП)
-----------------------------------------------------------------
|N |Наименование |Ед. |Кол-во |
|п/ | |изм. | |
|п | | | |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|1 |2 |3 |4 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|1 |Банки широкогорлые с крышками или |шт. |2 |
| |притертыми | | |
| |пробками, емкостью не менее 100 мл | | |
| |(стерильн.) | | |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|2 |Трубка стеклянная с резиновой грушей малого |шт. |2 |
| |калибра или ложки (стерильн.) | | |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|3 |Петли алюминиевые (стерильн.) |шт. |2 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|4 |Пробирки бактериологические (стерильн.) |шт. |5 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|5 |Тампоны ватные (стерильн.) |шт. |20 - |
| | | |30 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|6 |Шпатель деревянный (металлический) |шт. |1 |
| |(стерильн.) | | |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|7 |Штатив складной на 6 гнезд |шт. |1 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|8 |Пептонная вода 1-процентная во флаконах |шт. |2 |
| |по 50 мл (стерильн.) <*> | | |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|9 |Спирт-ректификат 96 град. |мл |250 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|10 |Салфетки марлевые |шт. |5 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|11 |Спиртовка |шт. |1 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|12 |Пинцет анатомический |шт. |1 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|13 |Шпагат |м |2 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|14 |Спички |кор. |1 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|15 |Клеенка медицинская подкладная |м |1 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|16 |Пакеты полиэтиленовые |шт. |5 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|17 |Бумага писчая |лист |20 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|18 |Бумага копировальная |лист |2 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|19 |Направление на анализ (бланк) |шт. |3 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|20 |Лейкопластырь |уп. |1 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|21 |Простой карандаш |шт. |1 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|22 |Карандаш по стеклу |шт. |1 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|23 |Бикс (металлический контейнер) для доставки |шт. |1 |
| |проб | | |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|24 |Инструкция по забору материала |шт. |1 |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|25 |Хлорамин в пакетах по 30 г, рассчитанный на |шт. |10 |
| |приготовление 1 л 3-процентного раствора | | |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|26 |Емкость на 1 л для приготовления 3% |шт. |1 |
| |хлорамина | | |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|27 |Сухая хлорная известь в пакете из расчета |шт. |1 |
| |200 г на 1 кг выделений | | |
|----|--------------------------------------------|-----|-------|
|28 |Перчатки резиновые |пар |2 |
-----------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> Под резиновыми пробками, завальцованными металлическими
колпачками.
Приложение 4
(обязательное)
УКЛАДКА ДЛЯ ЗАБОРА ПРОБ ИЗ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
НА ХОЛЕРУ (ДЛЯ ЦЕНТРОВ ГОССАНЭПИДНАДЗОРА)
----------------------------------------------------------------
|N |Наименование |Ед. |Кол- |
|п/ | |измер.|во |
|п | | | |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|1 |Ящик тарный на 20 гнезд |шт. |1 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|2 |Ящик металлический - укладка |шт. |1 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|3 |Бутылки 0,5 л с ватно-марлевыми (и |шт. |20 |
| |резиновыми) | | |
| |пробками, с пергаментными бумажными | | |
| |колпачками | | |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|4 |Спирт 96 град. |мл |100 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|5 |Вата |г |100 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|6 |Карандаш по стеклу |шт. |2 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|7 |Карандаш простой |шт. |1 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|8 |Бумага писчая |лист |10 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|9 |Направление на анализ (бланк) |шт. |10 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|10 |Бумага копировальная |лист |5 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|11 |Пинцет |шт. |1 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|12 |Банка 0,5 л с матерчатыми салфетками (15 |шт. |1 |
| |шт.) | | |
| |для отбора проб сточных вод | | |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|13 |Термометр до 50 град. |шт. |1 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|14 |Бумага индикаторная для определения рН |упак. |1 |
| |(1 - 12) | | |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|15 |Банка с притертой крышкой с ватными |шт. |1 |
| |тампонами | | |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|16 |Пробирки с тампонами для взятия смывов |шт. |20 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|17 |Штатив на 20 гнезд |шт. |1 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|18 |Батометр |шт. |1 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|19 |Шпагат - мотки по 5, 10 и 30 м |м |45 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|20 |Хлорамин в пакетах по 30 г, рассчитанный на |шт. |2 |
| |приготовление 1 л 3-процентного раствора | | |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|21 |Емкость на 1 л для приготовления 3% |шт. |1 |
| |хлорамина | | |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|22 |Пакеты полиэтиленовые |шт. |5 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|23 |Халат медицинский и шапочка |шт. |2 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|24 |Перчатки резиновые |пары |2 |
|----|--------------------------------------------|------|-----|
|25 |Фартук и нарукавники клеенчатые |шт. |1 |
----------------------------------------------------------------
Приложение 5
(справочное)
ПЕРЕЧЕНЬ
КОММЕРЧЕСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРЫ
----------------------------------------------------------------
|Наименование питательной |Предприятие-изготовитель |
|среды, | |
|микротест-системы | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|1 |2 |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Питательная среда для |АО "Биомед" им. И.И. |
|выделения |Мечникова, |
|и культивирования холерного |143422, Московская обл., |
|вибриона сухая (щелочной агар) |Красногорский р-он, п/о |
| |Петрово-Дальнее; |
| |НИПЧИ Сибири и Дальнего |
| |Востока, 664047, г. Иркутск, |
| |ул. Трилиссера, 78; |
| |ФГУП "Аллерген", 355004, |
| |г. Ставрополь, |
| |ул. Биологическая, 20 |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Пептон основной сухой |АО "Биомед" им. И.И. |
| |Мечникова, |
| |НПО "Питательные среды", |
| |367025, г. Махачкала, |
| |ул. Левоневского, 24 |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Питательная среда элективная |Ростовский НИПЧИ, 344007, |
|диагностическая для выделения |г. Ростов-на-Дону, |
|холерного вибриона сухая |ул. Горького, 117 |
|(СЭДХ) | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Питательная среда для |НПО "Питательные среды", |
|определения |г. Махачкала |
|чувствительности | |
|микроорганизмов | |
|к антибиотикам сухая (АГВ) | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Микротест-система для |НПО "Питательные среды", |
|идентификации вибрионов (МТС - |г. Махачкала |
|V) | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Микротест-система для |НПО "Питательные среды", |
|ускоренного определения групп |г. Махачкала |
|вибрионов по Хейбергу (МТС - | |
|X) | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Мультимикротест-система для |ФГУП "Аллерген", |
|биохимической идентификации |г. Ставрополь |
|Vibrionacae | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Системы индикаторные бумажные |Нижегородское предприятие по |
|для идентификации |производству бактерийных |
|микроорганизмов |препаратов, г. Н. Новгород, |
|(набор N 1 - для вибрионов; |803950, ул. Грузинская, 44 |
|набор N 2 - для межродовой | |
|дифференциации энтеробактерий) | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Бактериофаги диагностические |РосНИПЧИ "Микроб", 410005, |
|холерные классический и эльтор |г. Саратов, |
|сухие |ул. Университетская, 46 |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Фаг дифференциально- |РосНИПЧИ "Микроб", г. |
|диагностический (ДДФ) вида |Саратов |
|V. сholerae жидкий | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Среды Гисса с углеводами и |НПО "Питательные среды", |
|спиртами: глюкозой, лактозой, |г. Махачкала; |
|сахарозой, мальтозой, |АО "Биомед" им. И.И. |
|маннитом, |Мечникова |
|дульцитом; среда Клиглера; | |
|глюкозофосфатный бульон Кларка | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Тест-система диагностическая |РосНИПЧИ "Микроб", г. |
|для выявления V. cholerae ctx |Саратов |
|методом ПЦР | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Бактериофаги диагностические |РосНИПЧИ "Микроб", г. |
|холерные эльтор ctx+ и ctx- |Саратов |
|жидкие | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Сыворотка диагностическая |РосНИПЧИ "Микроб", г. |
|холерная O1 адсорбированная и |Саратов; |
|неадсорбированная сухая для РА |НИПЧИ Сибири и Дальнего |
| |Востока, г. Иркутск |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Сыворотка диагностическая |РосНИПЧИ "Микроб", г. |
|холерная Инаба адсорбированная |Саратов |
|сухая |(адрес см. выше); |
| |НИПЧИ Сибири и Дальнего |
| |Востока, г. Иркутск |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Сыворотка диагностическая |РосНИПЧИ "Микроб", г. |
|холерная Огава адсорбированная |Саратов; |
|сухая |НИПЧИ Сибири и Дальнего |
| |Востока, г. Иркутск |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Сыворотка диагностическая |РосНИПЧИ "Микроб", г. |
|холерная РО адсорбированная |Саратов |
|сухая | |
|для РА | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Иммуноглобулины |РосНИПЧИ "Микроб", г. |
|диагностические |Саратов |
|флюоресцирующие холерные | |
|адсорбированные лошадиные | |
|сухие | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Бактериофаги диагностические |РосНИПЧИ "Микроб", г. |
|холерные типирующие (1 - 7) |Саратов |
|жидкие ТЭПВ | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Диагностикум эритроцитарный |Казахский НИПЧИ, г. Алма- |
|холерный иммуноглобулиновый |Ата, |
|сухой |480074, Казахстан, г. |
| |Алма-Ата, ул. Копальская, 14 |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Диагностикум эритроцитарный |Казахский НИПЧИ, г. Алма-Ата |
|холерный энтеротоксический | |
|антигенный сухой | |
|--------------------------------|-----------------------------|
|Сыворотки диагностические |РосНИПЧИ "Микроб", г. |
|холерные не О1 группы |Саратов; |
|поливалентная О2 - О40, |Ростовский НИПЧИ, |
|групповые |г. Ростов-на-Дону |
|N 1 - 5, моноварные О2 - О83 | |
|кроличьи адсорбированные | |
|жидкие, | |
|О139 адсорбированная жидкая, | |
|О139 | |
|адсорбированная сухая для РА | |
----------------------------------------------------------------
Приложение 6
(рекомендуемое)
СПОСОБ ОТБОРА КОЛОНИЙ ВИБРИОНОВ С ПОМОЩЬЮ
СТЕРЕОСКОПИЧЕСКОГО МИКРОСКОПА В КОСО ПРОХОДЯЩЕМ СВЕТЕ
Принцип метода заключается в том, что при просмотре колоний
различных микробов под малым увеличением микроскопа или лупы при
освещении их пучком света, косо падающим на поверхность агара, колонии
приобретают способность светиться и кажутся окрашенными.
К стереоскопическому микроскопу МБС-2 или МБС-1 приспосабливают
устройство для получения узкого пучка света и зеркало от микроскопа на
подвижном шарнире для освещения чашки снизу под углом 45 - 50 ёC.
Чашки с посевами просматривают после 12 - 18 ч инкубации. При
величине угла падения луча света к поверхности агара в 40 - 50 ёC
колонии вибрионов по своей окраске заметно отличаются от других
микроорганизмов.
Цвет колоний, выросших на щелочном агаре, при косом освещении:
-----------------------------------------------------------------
|Микроорганизмы | Цвет колонии |
|---------------------|-----------------------------------------|
|Холерные вибрионы | Преобладает серо-голубой с оттенком |
| | зеленовато-серым, синевато-зеленым, |
| | реже - зеленый с верхним краем |
| | красно-бурого или коричневого оттенка |
|---------------------|-----------------------------------------|
|Сальмонеллы | Розовый оттенок |
|---------------------|-----------------------------------------|
|Шигеллы | Розовый с фиолетовым оттенком |
|---------------------|-----------------------------------------|
|Кишечная палочка | Ярко-красный |
|---------------------|-----------------------------------------|
|Протей | Красный с фиолетовым оттенком. |
-----------------------------------------------------------------
Приспособления для просмотра колоний в косо проходящем свете.
1. Столик стереоскопического микроскопа МБС-1 или МБС-2 заменяют
специальным приспособлением для освещения чашки снизу под углом 45 -
50 ёC. Источником света служит осветитель от микроскопа, на который
надевают кожух с отверстием диаметром 5 мм против спирали лампочки для
получения узкого пучка света. Узкий пучок света направляют в центр
вогнутого зеркала, которое перемещается на подвижном шарнире поворотом
винта в зависимости от необходимости угла падения света. Угол
вычисляют по соотношению расстояния от зеркала до чашки, которое
меняется произвольно, и расстояния от чашки до поверхности стола,
остающегося неизменным.
Для удобства исследования осветитель и зеркало можно вмонтировать
в ящик со стеклянной крышкой, на которую помещают чашку с посевом. Это
дает возможность быстро находить нужный угол падения света, передвигая
зеркало поворотом винта по вмонтированной шкале.
2. Приспособление, смонтированное из основных узлов
стереоскопического микроскопа БМС-1 и прибора для счета колоний.
Из раструба верхней крышки прибора для подсчета колоний удалить
оба стекла вместе с упорным кольцом и снять верхнюю крышку. Из скобы
передней панели вывинтить вертикальную ось, после чего убрать диск со
светофильтрами. Освободить два винта, прикрепляющие патрон лампочки
освещения к кронштейну на задней панели. В крышку снизу вставить
вертикальную штангу от узла лупы с таким расчетом, чтобы в рабочем
положении прибора муфта с прижимным винтом оказалась на дне под
кронштейном импульсного счетчика. В муфту зажать держатель с угловыми
губками (из комплекта лабораторного штатива), предварительно
укороченный до 110 мм. Держателем закрепить патрон с лампочкой в
вертикальном положении. Крышку фиксировать винтами на своем обычном
месте.
Штатив микроскопа МБС-1 вместе с бинокулярной насадкой
отсоединить от столика и установить непосредственно на корпус прибора
для счета колоний так, чтобы 3 сферических ножки основания штатива
охватили раструб крыши прибора, а окно основания было обращено к
наблюдателю. Подлежащие к просмотру чашки с посевами устанавливают над
открытым окном. Нужную освещенность и угол падения света находят
изменением положения лампы, которое достигается поворотом штанги,
после чего последнюю фиксируют цанговым зажимом.
Приложение 7
(рекомендуемое)
ЖУРНАЛ РЕГИСТРАЦИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
МАТЕРИАЛА ОТ БОЛЬНЫХ (ТРУПОВ) ЛЮДЕЙ С ПОДОЗРЕНИЕМ
НА ХОЛЕРУ И ДРУГИЕ КАРАНТИННЫЕ ИНФЕКЦИИ
----------------------------------------------------------------------------
|N |Ф.И.О. |Возраст|Пол |Место |Место |Клинический |
|регистрационный| | | |работы, |жительства|(патолого- |
| | | | |должность |(адрес) |анатомический) |
| | | | | | |диагноз |
|---------------|-------|-------|----|----------|----------|---------------|
|1 |2 |3 |4 |5 |6 |7 |
----------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|Учреждение, |Цель |N, дата |Применение |Дата и время |Исследуемый|Результаты |Дата |Подпись|
|направляющее|исследования|первичного|антибиотиков| |материал |исследования|направления|врача |
|пробу | |анализа | | | | |ответа | |
| | |(год, | |---------------| | |(месяц, | |
| | |месяц, | |взятия |приема | | |число) | |
| | |число) | |пробы |анализа| | | | |
| | | | |(год, |(месяц,| | | | |
| | | | |месяц, |число, | | | | |
| | | | |число, |час) | | | | |
| | | | |час) | | | | | |
|------------|------------|----------|------------|-------|-------|-----------|------------|-----------|-------|
|8 |9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 |
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Приложение 8
(рекомендуемое)
ЖУРНАЛ РЕГИСТРАЦИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРОБ
ИЗ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------
|N |Объект |Адрес, |Количество|Наименование|Дата и время |Результат |Подпись |
|регистрационный|исследования|место |(объем) |учреждения, | |исследования| |
| | |отбора |пробы |направившего| | | |
| | |проб | |пробы |----------------------| | |
| | | | | |отбора|приема |выдачи | | |
| | | | | |пробы |пробы |ответа | | |
| | | | | |(год, |(месяц,|(месяц,| | |
| | | | | |месяц,| число,| число,| | |
| | | | | |число,| час) | час) | | |
| | | | | |час) | | | | |
|---------------|------------|-------|----------|------------|------|-------|-------|------------|--------|
|1 |2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
|---------------|------------|-------|----------|------------|------|-------|-------|------------|--------|
| | | | | | | | | | |
|---------------|------------|-------|----------|------------|------|-------|-------|------------|--------|
| | | | | | | | | | |
|---------------|------------|-------|----------|------------|------|-------|-------|------------|--------|
| | | | | | | | | | |
|---------------|------------|-------|----------|------------|------|-------|-------|------------|--------|
| | | | | | | | | | |
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------
Приложение 9
(рекомендуемое)
ЖУРНАЛ ИДЕНТИФИКАЦИИ КУЛЬТУР ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|N |N |Вид |Дата |Объект |Морфология|Подвижность|Морфология|Индофенолоксидаза|Лизиндекарбоксилаза|Орнитиндекарбоксилаза|Аргининдигидролаза|Расщепление |Ферментация |
|регистрационный|штамма|микроба|выделения|исследования|клетки | |колоний | | | | |глюкозы в среде | |
| | | |(число, | | | | | | | | |Хью - Лейфсона | |
| | | |месяц, | | | | | | | | | | |
| | | |год) | | | | | | | | |-------------------|------------------------------------------|
| | | | | | | | | | | | |аэробное|анаэробное|сахарозы|арабинозы|маннозы|маннита|инозита|
|---------------|------|-------|---------|------------|----------|-----------|----------|-----------------|-------------------|---------------------|------------------|--------|----------|--------|---------|-------|-------|-------|
|1 |2 |3 |4 |5 |6 |7 |8 |9 |10 |11 |12 |13 |14 |15 |16 |17 |18 |19 |
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|Ферментация |Образование |Взаимодействие с холерными |Чувствительность к фагам |Реакция |Чувствительность|Гемолитическая|
| | |иммуноглобулинами в реакциях |холерным |гемагглютинации|к полимиксину В |активность в |
| | | | | |50 ед./мл |пробе Грейга |
|-------------------------|----------------------------------------|----------------------------------|--------------------------------------| | | |
|лактозы|крахмала|желатины|индола|сероводорода|ацетилметилкарбинола|агглютинации |РНГА |МФ |классическому|эльтор|ctx |ctx-|ТЭПВ | | | |
| | | | | | | |, |А | | |+ | |1 - | | | |
| | | | | | | |РТПГ | | | | | |7 | | | |
| | | | | | |----------------------|А | | | | | | | | | |
| | | | | | |O |Огава|Инаба|Р |O139| | | | | | | | | | |
| | | | | | |1 | | |О | | | | | | | | | | | |
|-------|--------|--------|------|------------|--------------------|--|-----|-----|--|----|------|----|-------------|------|-----|----|------|---------------|----------------|--------------|
|20 |21 |22 |23 | 24 |25 |26|27 |28 |29|30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|Токсигенность|ПЦР |Чувствительность к антибиотикам |Заключение|Подпись|
| | | |<*> |врача |
| | |-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------| | |
| | |дискодиффузионный метод |метод серийных разведений | | |
|-------------|--------------------|-----------------------------------------------------------------------------------------|-------------------------------------------------------------------------------| | |
|на кроликах- |сtx|tcp|ДНК- |тетрациклин|левомицетин|доксициклин|ципрофлоксацин|нитрофурантоин|котримоксазол|другие |тетрациклин|левомицетин|доксициклин|ципрофлоксацин|нитрофурантоин|котримоксазол| | |
|сосунках |AB |А |зондирование| | | | | | |(вписать)| | | | | | | | |
| | | |на ctx AB | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------|---|---|------------|-----------|-----------|-----------|--------------|--------------|-------------|---------|-----------|-----------|-----------|--------------|--------------|-------------|----------|-------|
|41 |42 |43 |44 |45 |46 |47 |48 |49 |50 |51 |52 |53 |54 |55 |56 |57 | 58 | 59 |
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> Таксономическое определение, токсигенность с указанием метода
определения, чувствительность к антибиотикам (значения МПК, мкг/мл);
при необходимости дифференциации от других видов патогенных вибрионов
добавляют тесты: рост без NaCl; расщепление салицина, дульцита,
целлобиозы, тест на бета-галактозидазу, наличие нитратредуктазы.
Приложение 10
(обязательное)
ЖУРНАЛ УЧЕТА ВЫДЕЛЕННЫХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
(ФОРМА N 513/У)
Хранить 3 года
до ------- -------- -------- начат ------- -------- --------
| | | | | | | | | | | | | | | | | |
------- -------- -------- ------- -------- --------
окончен ------- -------- --------
| | | | | | | | |
------- -------- --------
-----------------------------------------------------------------------------------------------
|N |N |Адрес |Наименование|N |Источник |Дата |Краткая |Судьба|Примечание|
|п/ |анализа|и дата |ПБА <*> |штамма |выделения|выделения|характеристика|ПБА | |
|п | |взятия | | | | |ПБА <**> |<***> | |
| | |пробы | | | | | | | |
|---|-------|-------|------------|-------|---------|---------|--------------|------|----------|
|1 |2 |3 |4 |5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
-----------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> Патогенный биологический агент.
<**> Типичность; при атипичности указать отличительные признаки.
<***> Уничтожен (дата, N акта); передан в коллекцию, центр и т.д.
(дата, N акта).
Приложение 11
(обязательное)
ПАСПОРТ ШТАММА
Вид микроба __________________________ Штамм N _______________
Ф.И.О. ______________________________ возраст ____________________
место жительства больного или вибриононосителя (подчеркнуть) _________
______________________________________________________________________
(республика, область, р-н, населенный пункт, улица, N дома
и квартиры)
Наименование объекта ___________________ (река, озеро и т.п.),
наименование стационарной точки _________ (зона сан. охраны, место
сброса сточных вод и т.п.), сточные воды _______________ (в очаге,
коллектор, очистные сооружения до или после очистки и т.п.), другие
объекты (указать) __________________ с указанием территории (респ.,
обл., р-н, нас. пункт) _______________________________________________
______________________________________________________________________
Дата забора материала _________ Дата выделения культуры _________
Культуру выделила (Ф.И.О. врача, учреждение) ____________________
______________________________________________________________________
Культуру подтвердил(а) (Ф.И.О. врача, учреждение) _______________
______________________________________________________________________
Характеристика штамма
1. Морфология клеток ____________________________________________
Тинкториальные свойства _____________ 2. Подвижность ____________
3. Культуральные свойства: на 1% п.в. ________________________ на
щелочном агаре __________
4. Проба на оксидазу _________ 5. Лизиндекарбоксилаза ________
орнитиндекарбоксилаза ___________ аргининдигидролаза _________________
6. Расщепление: глюкозы в среде Хью - Лейфсона (аэробн./
анаэробн.) _______, сахарозы ________, маннозы ________, арабинозы
________, маннита _________, инозита _________, лактозы _________,
крахмала _______.
7. Протеолитическая активность __________________________________
8. Агглютинабельность холерными сыворотками: (указать серии и
титр сывороток)
O1 _______________, Огава _____________, Инаба ___________, РО
_______________, O139 _____________
9. Реакция с холерными O1 люминесцирующими антителами ___________
10. Чувствительность к холерным фагам: классическому ________,
эльтор ___________, ctx+ __________, ctx-, ТЭПВ (1 - 7) ______________
11. Гемолитическая активность по Грейгу _________________________
12. Реакция гемагглютинации _____________________________________
13. Чувствительность к полимиксину В 50 (ед./мл) ________________
14. Токсигенность:
- комплексным методом (ctx фаги и гемолиз) ___________________
- на кроликах-сосунках _______________________________________
- ПЦР ________________________________________________________
- ДНК-зондирование ___________________________________________
15. Антибиотикограмма
----------------------------------------------------------------------------------
|N |Препарат |Значение |Результат |
|п/ | |--------------------|---------------------------------------|
|п | |МПК, |зона |чувствительный|промежуточный|устойчивый|
| | |мкг/мл |ингибиции | | | |
| | | |роста в | | | |
| | | |мм | | | |
|----|--------------|--------|-----------|--------------|-------------|----------|
|1 |Доксициклин | | | | | |
|----|--------------|--------|-----------|--------------|-------------|----------|
|2 |Тетрациклин | | | | | |
|----|--------------|--------|-----------|--------------|-------------|----------|
|3 |Левомицетин | | | | | |
|----|--------------|--------|-----------|--------------|-------------|----------|
|4 |Ципрофлоксацин| | | | | |
|----|--------------|--------|-----------|--------------|-------------|----------|
|5 |Рифампицин | | | | | |
|----|--------------|--------|-----------|--------------|-------------|----------|
|6 |Нитрофурантоин| | | | | |
|----|--------------|--------|-----------|--------------|-------------|----------|
|7 |Котримоксазол | | | | | |
|----|--------------|--------|-----------|--------------|-------------|----------|
|8 |Гентамицин | | | | | |
|----|--------------|--------|-----------|--------------|-------------|----------|
|9 |Ампициллин | | | | | |
|----|--------------|--------|-----------|--------------|-------------|----------|
|10 |Цефотаксим | | | | | |
| |Другие | | | | | |
| |(вписать) | | | | | |
----------------------------------------------------------------------------------
16. Другие свойства __________________________________________
17. Среда хранения ___________________________________________
Подпись врача ____________________________________________
Примечания. 1. В графе 8 указывать: отр. или до титра; 1/2 титра
и т.д.
2. В графе 10 указывать: до титра; 1/2 титра и т.д.
|