МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ
МЕТОДИКА
ГЛАВНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНИТАРНЫЙ ВРАЧ РФ
15 января 2002 года
N МУ 4.2.1097-02
(Д)
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
15 января 2002 года
Дата введения -
1 апреля 2002 года
1. Разработаны сотрудниками Министерства здравоохранения
Российской Федерации Ю.М. Федоровым, Н.Я. Жилиной; Ростовского-на-Дону
научно-исследовательского противочумного института Ю.М. Ломовым, Б.Н.
Мишанькиным, Л.С. Подосинниковой, Л.Г. Воронежской, И.Я. Черепахиной,
Т.А. Кудряковой, Б.Л. Мазрухо, Л.М. Смоликовой, И.В. Рыжко, Р.И.
Цураевой, Э.А. Москвитиной, Б.П. Голубевым; Противочумного Центра
Минздрава России А.А. Кюрегяном, С.М. Ивановой, Ю.С. Королевым;
Российского научно-исследовательского противочумного института
"Микроб" А.К. Адамовым, З.В. Малыхиной, Т.В. Бугорковой, Н.И.
Смирновой, Л.Ф. Ливановой; Иркутского научно-исследовательского
противочумного института А.С. Марамовичем, В.С. Ганиным, Л.Я.
Урбанович, В.И. Погореловым; Ставропольского научно-исследовательского
противочумного института В.Н. Савельевым; Причерноморской
противочумной станции Г.В. Гальцевой; Государственного Центра по
антибиотикам С.В. Сидоренко; Российской медицинской академии
последипломного образования Е.А. Ведьминой; ГИСК им. Л.А. Тарасевича
Минздрава России Т.И. Анисимовой, Л.В. Саяпиной.
2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом
Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения
Российской Федерации Г.Г. Онищенко 15 января 2002 г.
3. Введены взамен "Инструкции по организации и проведению
противохолерных мероприятий", утвержденной МЗ и МП РФ от 09.06.95 N
01-19/50-11.
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие Методические указания разработаны для внедрения и
применения санитарно-эпидемиологических правил СП 3.1.1086-02
"Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору"
в части, касающейся организации и проведения лабораторной диагностики
холеры.
1.2. Настоящие Методические указания предназначены для
специалистов бактериологических лабораторий центров госсанэпиднадзора,
лечебно-профилактических и противочумных учреждений.
2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
2.1. Санитарные правила по безопасности работ с микроорганизмами
СП 1.2.006-93. Ч. I: Порядок выдачи разрешения на работу с
микроорганизмами I - IV групп патогенности и рекомбинантными
молекулами ДНК.
2.2. Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп
патогенности: СП 1.2.011-94.
2.3. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования
микроорганизмов I - IV групп патогенности: СП 1.2.036-95.
2.4. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп
патогенности и гельминтами: СП 1.2.731-99.
2.5. Условия транспортирования и хранения медицинских
иммунобиологических препаратов: СП 3.3.2.028-95.
2.6. Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому
надзору: СП 3.1.1086-02.
2.7. Профилактика холеры. Организационные мероприятия. Оценка
противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению
мероприятий на случай возникновения очага холеры: МУ 3.1.1096-02.
3. ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ
Холера - острая инфекционная болезнь из группы карантинных
инфекций, с диарейным синдромом, фекально-оральным механизмом передачи
возбудителя, водным, пищевым и контактно-бытовым путями
распространения инфекции.
Холерные вибрионы относятся к виду V. cholerae, который включает
как патогенные, способные вызывать заболевания, склонные к
эпидемическому и пандемическому распространению, так и свободноживущие
в воде вибрионы, безопасные для человека или обусловливающие
спорадические случаи диарей и инфекций с внекишечной локализацией
возбудителя. Известно около 200 О-серологических групп холерных
вибрионов, из которых лишь холерные вибрионы O1 серогруппы до
последнего десятилетия являлись возбудителями грозной инфекции. С 1993
г. по решению ВОЗ как холеру регистрируют заболевания, вызываемые
холерными вибрионами O139 серогруппы. Таким образом, к настоящему
времени известны три варианта возбудителя холеры: холерные вибрионы O1
серологической группы - классические и эльтор (варианты Огава, Инаба,
Гикошима) и холерные вибрионы новой O139 серогруппы.
Наличие гена холерного токсина (ctx AB), независимо от его
экспрессии, отличает токсигенные (эпидемические) от свободноживущих
холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп; кроме того, в геноме
токсигенных эпидемически значимых вариантов присутствует ряд генов,
кодирующих синтез белка ТОХ Т, передающего сигналы запуска синтеза
холерного токсина (СТ), токсинкорегулируемых пилей адгезии (TCP) и
фактора колонизации (ACF). Известно, что свободноживущие атоксигенные
холерные вибрионы O1 чрезвычайно редко имеют tcp ген в своей
хромосоме.
Характеристика генома выделенных штаммов
молекулярно-биологическими методами может быть использована для
эпидемиологического анализа и решения вопросов заноса, распространения
и укоренения инфекции.
Известно многообразие фенотипических изменений атоксигенных
холерных вибрионов, выделенных на свободных от холеры территориях, а
также распространение эпидемически значимых фагорезистентных вариантов
холерных вибрионов и штаммов с множественной лекарственной
устойчивостью.
4. ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Диагностические исследования на холеру в регламентированном
объеме могут проводить:
- бактериологические лаборатории территориальных центров
госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических учреждений и ведомственных
служб, имеющие разрешение на работу с микроорганизмами III группы
патогенности;
- лаборатории особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора в
субъектах Федерации (республиканских, краевых, областных, городских),
ведомственных учреждений, имеющие разрешение на проведение
диагностических исследований на холеру;
- лаборатории противочумных учреждений, имеющие разрешение на
проведение диагностических исследований на холеру и на работу с
возбудителем холеры.
Организация и выполнение диагностических исследований на холеру в
лабораториях должны осуществляться в соответствии с требованиями,
регламентирующими:
- безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп
патогенности и гельминтами - для бактериологических лабораторий
центров госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических учреждений и
ведомственных служб;
- безопасность работы с микроорганизмами I - II групп
патогенности - для лабораторий особо опасных инфекций центров
госсанэпиднадзора ведомственных и противочумных учреждений;
- порядок учета, хранения, передачи и транспортирования
микроорганизмов I - IV групп патогенности.
Порядок получения лабораториями разрешения на работу с
микроорганизмами I - IV групп патогенности определяется действующими
нормативными документами о порядке выдачи разрешений на эти виды
работ.
Все диагностические лаборатории, выполняющие работы с
микроорганизмами I - IV групп патогенности, должны иметь лицензию на
деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных
заболеваний.
В условиях осложнения эпидемиологической обстановки временное
разрешение на проведение диагностических исследований на холеру
бактериологическим лабораториям центров госсанэпиднадзора, включенным
в состав лабораторной службы очага, в случае расширения их
функциональных обязанностей, предоставляется решением медицинского
штаба очага.
4.1. При осуществлении эпидемиологического надзора
4.1.1. Бактериологические лаборатории центров госсанэпиднадзора в
городах и районах, учреждений лечебно-профилактических и ведомственных
служб:
- проводят плановые диагностические исследования на холеру
материала от больных острыми кишечными инфекциями, определенного
контингента здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды в объеме,
предусмотренном для соответствующего типа территорий по
эпидпроявлениям холеры. Исследования ведут до установления
отрицательного результата анализа или до выделения культуры с
характерным для вибрионов ростом на агаровой и полиуглеводной средах и
положительной реакцией на оксидазу. Культуры проверяют на чистоту в
мазке, окрашенном по Граму, на подвижность и в реакции агглютинации на
стекле (далее - слайд-агглютинации) с холерными сыворотками O1, Огава,
Инаба, РО и O139.
При положительном результате слайд-агглютинации немедленно
сообщают в территориальный центр госсанэпиднадзора, культуру для
окончательной идентификации немедленно доставляют в специализированную
лабораторию в установленном порядке.
При отрицательном результате слайд-агглютинации:
- культуру, выделенную от людей, направляют для дальнейшей
идентификации в специализированную лабораторию;
- неагглютинирующиеся культуры, выделенные из объектов окружающей
среды, идентифицируют на месте или по согласованию передают в
территориальный центр госсанэпиднадзора.
4.1.2. Лаборатории особо опасных инфекций центров
госсанэпиднадзора в республиках, краях, областях, городах и
ведомственных учреждений:
- выполняют диагностическое исследование материала от больных и
умерших с подозрением на холеру и проб из объектов окружающей среды;
- идентифицируют культуры вибрионов, выделенных в территориальных
и ведомственных лабораториях, определяя их таксономическую
принадлежность, а также определяют эпидемическую значимость
(токсигенность) и антибиотикочувствительность холерных вибрионов O1 и
O139 серогрупп по регламентированным для лабораторий тестам;
- осуществляют (или организуют) бактериологический контроль
качества питательных сред и других диагностических препаратов,
используемых в территориальных лабораториях;
- представляют оперативную информацию о выделении культур
холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп;
- в установленном порядке немедленно передают в территориальное
противочумное учреждение культуры холерных вибрионов, таксономическая
принадлежность или токсигенность которых имеющимися средствами
диагностики не определяется;
- в течение 5 дней после окончания идентификации передают в
территориальное противочумное учреждение или головной по проблеме
"Холера" противочумный институт все культуры холерных вибрионов O1,
O139, независимо от объекта обследования, и других серогрупп при
выделении от больных;
- контролируют деятельность территориальных лабораторий,
оказывают им методическую помощь по всем вопросам лабораторного
обеспечения эпидемиологического надзора за холерой.
4.1.3. Лаборатории противочумных учреждений:
- проводят исследования материала от больных и умерших с
подозрением на заболевание холерой, а также проб из объектов
окружающей среды;
- подтверждают таксономическую принадлежность культур холерных
вибрионов, выделенных на курируемой территории;
- идентифицируют все атипичные культуры холерных вибрионов с
использованием дополнительных методов серологической, биохимической и
других видов идентификации с целью уточнения таксономической
принадлежности;
- определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и
антибиотикочувствительность культур;
- осуществляют методическое руководство по всем вопросам
лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой на
курируемой территории;
- в установленном порядке передают с паспортами выделенные
культуры холерных вибрионов в территориальный противочумный институт,
в головной по проблеме "Холера" - Ростовский-на-Дону
научно-исследовательский противочумный институт. Кроме того, паспорта
на эти же культуры направляют в Противочумный центр Минздрава России.
Лабораторное обеспечение эпидемиологического надзора за холерой
осуществляют в соответствии с планом противохолерных мероприятий,
действующими нормативными и методическими документами.
Профилактические исследования на холеру проводят в пределах рабочего
дня с использованием соответствующих питательных сред, диагностические
исследования материала от подозрительных на холеру больных (трупов) -
в условиях круглосуточного режима работы лаборатории.
4.2. При проведении противоэпидемических мероприятий
Организация и регламентирование деятельности лабораторий, а также
формирование лабораторной службы в очаге холеры осуществляется в
соответствии с действующими методическими указаниями по вопросам
профилактики холеры, организации мероприятий и оценки
противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению
мероприятий на случай возникновения очага холеры.
5. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
В системе противохолерных мероприятий значительное место занимает
бактериологический анализ, от правильности и своевременности
проведения которого зависит характер и объем профилактических и
противоэпидемических мероприятий.
Исследования проводят с целью:
- выявления больных холерой и вибриононосителей;
- установления окончательного диагноза при вскрытии трупов лиц,
умерших от подозрительного на холеру заболевания;
- обоснования выбора средств этиотропной терапии холеры;
- бактериологического контроля эффективности лечения больных
холерой и вибриононосителей;
- бактериологического контроля объектов окружающей среды, в т.ч.
поверхностных водоемов;
- бактериологического контроля эффективности обеззараживания в
очаге инфекции.
5.1. Отбор и доставка материала на исследование
Материалом для бактериологического анализа могут служить
испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки тонкого
кишечника и желчный пузырь); предметы, загрязненные испражнениями
(постельное и нательное белье и др.); вода, ил, гидробионты, сточные
воды, содержимое выгребных туалетов; смывы с объектов окружающей
среды, пищевые продукты, мухи и др.
Материал от больного забирает медицинский персонал лечебного
учреждения немедленно после выявления больного и до начала лечения
антибиотиками. Руководитель несет ответственность за правильность
отбора, хранения и доставки проб в лабораторию.
Необходимо учитывать высокую чувствительность холерных вибрионов
к дезинфицирующим средствам и кислотам, возможность антагонистического
действия сопутствующей микрофлоры и предполагаемую концентрацию
возбудителя в исследуемом материале. Если в материале от больных
6 9
алгидной формой холеры концентрация возбудителя достигает 10 - 10
м.к./мл, то в испражнениях больных легкой формой и леченных
антибиотиками, реконвалесцентов и носителей количество холерных
2 4
вибрионов обычно не превышает 10 - 10 м.к./г.
Для отбора проб используют чистую стерильную посуду, не
содержащую следов дезинфицирующих растворов. Стерилизацию посуды и
других средств забора материала проводят автоклавированием, сухим
жаром или кипячением в 2-процентном растворе пищевой соды.
Материал для исследования должен быть доставлен не позже чем
через 2 ч после его взятия. В случае удлинения сроков доставки
используют транспортные среды. Наиболее удобной и достаточно
эффективной является 1-процентная пептонная вода (рН 8,4 +/- 0,1).
В пептонную воду в качестве ингибитора сопутствующей флоры может
быть добавлен теллурит калия из расчета 1:100000 - 1:200000 или моющее
средство "Прогресс" в концентрации 0,1 - 0,2%. В отдельных случаях для
транспортирования материала могут быть использованы солевые
консерванты (см. раздел 7).
На флаконах (пробирках) с пептонной водой, передаваемых в
стационары для отбора проб, должна быть этикетка или надпись с
указанием названия среды и даты ее приготовления.
Среды во флаконах или пробирках, закрытых ватно-марлевыми
пробками, рекомендуется хранить не более 2 суток при температуре не
выше (10,0 +/- 0,2) ёC при условии сохранения их стерильности.
Целесообразно обеспечение стационаров и групп забора проб средами в
закатанных флаконах.
При наличии у больного диареи материал забирают до начала
этиотропной терапии в количестве 10 - 20 мл, у больных легкими формами
- 1 - 2 г испражнений. От больных тяжелой формой материал направляют в
лабораторию нативным и в 1-процентной пептонной воде. В транспортную
среду вносят 1 - 2 мл или 1 - 2 г материала на 5 - 6 мл среды.
При вынужденном удлинении сроков доставки материала в лабораторию
(длительное плавание, круиз и т.п.) можно использовать полоски
фильтровальной (промокательной) бумаги. Жидкими испражнениями
пропитывают полоску обычной плотной промокательной бумаги или другого
гигроскопичного материала и герметично упаковывают в пластиковый пакет
для предохранения от высыхания при транспортировании в лабораторию. На
таких полосках холерные вибрионы выживают до четырех-пяти или более
недель, пока сохраняется влага.
При обследовании на вибриононосительство материал забирает
медицинский персонал лечебно-профилактических учреждений, в очаге -
создают специальные группы по отбору проб, работающие под руководством
эпидемиологов.
Материал в количестве 1 - 2 г может быть доставлен на
исследование нативным, в 1-процентной пептонной воде или другой
транспортной среде.
5.1.1. Способы отбора проб от больных холерой, вибриононосителей
и контактных с ними лиц, секционного материала.
Испражнения и рвотные массы в количестве 10 - 20 мл собирают в
стерильную посуду стерильными ложками или стеклянными трубками с
резиновой грушей из индивидуального судна, на дно которого помещают
меньший по размеру сосуд (лоток), удобный для обеззараживания
кипячением.
Для взятия материала у больных с обильным водянистым стулом можно
использовать резиновый катетер, один конец которого вводят в прямую
кишку, а другой опускают в банку. Жидкие испражнения стекают в сосуд
свободно или при легком массаже брюшной стенки.
Стерильный ректальный ватный тампон из гигроскопической ваты
вводят в прямую кишку на глубину 5 - 6 см и собирают им содержимое со
стенок кишечника. Тампон опускают во флакон или пробирку с
1-процентной пептонной водой, обломив часть деревянного стержня.
Стандартную стерильную петлю из алюминиевой проволоки перед
забором материала смачивают стерильным 0,9-процентным раствором натрия
хлорида и вводят в прямую кишку на 8 - 10 см. Взятый материал
переносят во флакон или пробирку с 1-процентной пептонной водой.
Желчь берут при дуоденальном зондировании в лечебном учреждении.
В отдельные пробирки собирают две порции: из желчного пузыря и желчных
протоков (В и С). Материал доставляют нативным.
От умерших с подозрением на холеру берут отрезки (длиной около 10
см) верхней, средней и нижней частей тонкой кишки, разрез производят
между двойными лигатурами, предварительно наложенными на оба конца
изымаемого участка кишечника. Желчный пузырь после перевязки протока
извлекают целиком. Содержимое кишечника и желчь от трупа можно взять
стерильным шприцем с толстой иглой в объеме до 10 мл и перенести в
емкость с 1-процентной пептонной водой. Взятые образцы органов трупа
укладывают раздельно в стерильные банки.
Банки, пробирки с материалом закрывают непромокаемыми пробками и
пергаментной бумагой, тщательно обрабатывают снаружи салфеткой,
смоченной дезинфицирующим раствором, избегая затекания его внутрь. Все
пробы этикетируют, укладывают в специально подготовленную для
транспортирования металлическую тару и перевозят на служебном
транспорте с сопровождающим. Форма направления дана в Приложении 1.
5.1.2. Отбор проб из объектов окружающей среды.
Воду (питьевую, из поверхностных водоемов и др.) для исследования
берут в количестве 1 л на одну пробу в двух объемах по 500 мл в
стерильную посуду с непромокаемой пробкой.
Из водопроводных кранов пробы воды берут после предварительного
обжигания их спиртовым факелом и спуска воды в течение 10 мин. при
полном открытии крана.
Хозяйственно-бытовые сточные воды отбирают для исследования двумя
способами: в объеме 1 л также в двух емкостях по 500 мл или тампонами,
приготовленными из марлевых салфеток размером 10 x 10 см, сложенных в
10 - 15 слоев. Последние закрепляют у места забора воды, через сутки
помещают в стерильную банку и доставляют в лабораторию.
Гидробионтов (рыб, лягушек и др.) отлавливают из водоемов любым
способом и в закрытых банках, ведрах и других сосудах доставляют в
лабораторию.
Исследовать зоопланктон (дафнии, циклопы и др.) можно групповым
методом, объединяя в один посев 10 - 30 образцов, отловленных на одном
участке водоема. В этом случае они могут быть доставлены в одном
сосуде. При исследовании рыб берут содержимое желудка и жабры.
Смывы с различных объектов окружающей среды берут ватным или
марлевым тампоном, смоченным 0,9-процентным раствором натрия хлорида,
с поверхности площадью 10 x 10 см. Тампон опускают во флакон или
пробирку с 1-процентной пептонной водой.
Для сбора мух расставляют мухоловки, в которые наливают
1-процентную пептонную воду с 1% сахара.
Остатки пищи в очаге и по показаниям пищевые продукты отбирают по
200 г плотных и 0,5 л жидких, помещают в стеклянную посуду и
закрывают. При необходимости в жидкие продукты добавляют основной
пептон до 1-процентной концентрации.
Пробы объектов окружающей среды этикетируют, заполняют
направление (Приложение 2) и отправляют в лабораторию с нарочным
согласно действующим СП.
Перечень предметов, входящих в укладки для отбора проб, см. в
Приложениях 3, 4.
5.2. Порядок исследования
При бактериологическом исследовании на холеру используют
различные питательные среды: жидкие среды обогащения, щелочной агар,
элективные дифференциально-диагностические среды и набор сред для
идентификации.
Применяют сухие среды производственного выпуска, имеющие номера
госрегистрации и лицензии, или среды, консерванты, приготовленные по
рецептуре и технологии, изложенной в разделе 7. Перечень
производственных питательных сред и диагностических препаратов для
выделения и идентификации возбудителя холеры приведен в Приложении 5.
При транспортировании и хранении медицинских иммунобиологических
препаратов следует руководствоваться СП 3.3.2.028-95. Используемые для
диагностики холеры питательные среды подлежат бактериологическому
контролю в установленном порядке.
Агаровые среды перед использованием должны быть тщательно
подсушены. Посев делают так, чтобы получить рост в виде изолированных
колоний. Все посевы инкубируют при температуре (37,0 +/- 0,5) ёC.
Посевы исследуемого материала на всех этапах выращивают в
1-процентной пептонной воде 6 - 8 ч, в пептонной воде с теллуритом
калия - 12 - 18 ч, на щелочном агаре - не менее 14 - 16 ч, а на
плотных элективных средах - 18 - 24 ч. Теллурит калия следует
добавлять в 1-процентную пептонную воду с рН не ниже 8,3 +/- 0,1, до
внесения исследуемого материала. Продолжительность хранения рабочего
раствора теллурита калия (1:1000) - 7 дней, а питательных сред с
теллуритом калия - не более 2 суток при условии содержания их в
холодильнике.
5.2.1. Исследование проб от больных и вибриононосителей,
секционного материала (рис. 1).
------------------------------------------------------------------
| Исследуемый материал |
------------------------------------------------------------------
| | |
| | |
\/ \/ \/
-------- ----------------------------->---------------------
|ЩА, ЭС| | I | ------ |Ускоренные методы: |
-------- ------------>| II |---------->|- МФА |
| | ------ |- РИВ |
| \/ | |- РНГА |
| -------- \/ |- ПЦР |
| |ЩА, ЭС| ------ ---------------------
| -------- | ЩА |
| | ------
| | |
\/ \/ \/
---------------------------------------
|- отбор колоний |
|- высев подозрительных колоний на ЩА |
|и ПУС |
---------------------------------------
|
\/
----------------------------
|Отбор культур по ПУС и ОП |
----------------------------
|
\/
-------------------------------------------------------------
| | | | | |
\/ \/ \/ \/ \/ \/
------ ------- ------- ------ ------ ------
|ПУС+| |ПУС+*| |ОП+* | |ПУС-| |ПУС-| |ПУС+|
|ОП+ | ------- ------- |ОП+ | |ОП- | |ОП- |
------ ------ ------ ------
| | | |
----------------------------------- \/ \/
| ----------- -----------
\/ |Не | |Исследуют|
------------------------------- |исследуют| |на |
---| ОРА с сыворотками O1 и O139 |---------¬ ----------- |кишечную |
|+ ------------------------------- - | |группу |
| | -----------
| |
| |
\/ \/
--------------------------------------- ------------------------
|Сокращенная схема идентификации: | |Определение |
|- морфология и подвижность микробных | |принадлежности к роду |
|клеток | |Vibrio, виду |
|- ОП | |V. cholerae или другим|
|- O/F тест и отношение к отдельным | |видам патогенных |
|углеводам (табл. 4) | |вибрионов |
|- МФА | ------------------------
|- РИВ | ------------------------
|- РА с сыворотками O1, Инаба, Огава, | |Условные обозначения: |
|РО или слайд-агглютинация с O139 | |I и II - среда |
|- чувствительность к фагам холерным | |накопления; ЩА - |
|классическому и эльтор | |щелочной агар; ЭС - |
|Дополнительные признаки биовара | |элективная среда для |
|V. cholerae: | |выделения холерных |
|- гемагглютинация | |вибрионов; ПУС - |
|- чувствительность к полимиксину В | |полиуглеводная среда; |
|50 ед./мл | |ОП - оксидазная проба;|
|- реакция Фогес - Проскауэра | |ОРА - ориентировочная |
|Определение антибиотикограммы | |реакция агглютинации; |
|Оценка эпидемической значимости: | |РА - развернутая |
|- гемолитическая активность по Грейгу| |реакция агглютинации; |
|- чувствительность к фагам холерным | |МФА - метод |
|эльтор ctх+ и ctx- | |флюоресцирующих |
|- ПЦР, ДНК-зондирование | |антител; РИВ - реакция|
|- токсигенность на кроликах-сосунках | |иммобилизации |
|Уточнение родовой и видовой | |вибрионов; РНГА - |
|принадлежности атипичных культур по | |реакция непрямой |
|расширенному набору признаков | |гемагглютинации; ПЦР -|
|(табл. 2, 3) | |полимеразная цепная |
--------------------------------------- |реакция; |
|* - в случае отбора |
|колоний только на ПУС |
|или ЩА. |
------------------------
Рис. 1. Схема лабораторного исследования на холеру
I этап
Испражнения, рвотные массы больных, а также содержимое кишечника,
желчного пузыря и суспензию кусочков слизистой тонкого кишечника трупа
в объеме 0,5 - 1,0 мл засевают пипеткой в 50 - 100 мл накопительной
среды, петлей - на щелочной агар и одну из элективных сред (СЭДХ,
TCBS).
При исследовании материала от больных с подозрением на
заболевание холерой не допускается использование 1-процентной
пептонной воды с теллуритом калия в качестве накопительной среды.
В случае поступления материала от больных с подозрением на холеру
целесообразно применять ускоренные методы исследования:
иммунолюминесцентный, иммобилизацию и ПЦР со специфическими праймерами
(см. раздел 6).
Материал от подозреваемых на вибриононосительство засевают в 50
мл среды накопления при индивидуальных анализах и в 100 мл - при
групповых, объединяя в один флакон по 0,5 - 1,0 мл пробы не более чем
от 5 человек. К групповым посевам прибегают в редких случаях при
проведении массовых обследований на вибриононосительство.
Материал, доставленный в 5 мл 1-процентной пептонной воды,
полностью используют для посева в 50 мл среды накопления. В случае
поступления в лабораторию материала, забранного в 50 мл 1-процентной
пептонной воды во флаконе, и доставки его не позже 2 ч после забора
пробы флакон помещают в термостат на 6 ч для накопления возбудителя.
При доставке материала в более поздние сроки 5 мл его засевают в 50 мл
1-процентной пептонной воды.
В отдельных случаях, при бактериологическом исследовании
материала от лиц, принимавших антибиотики, активные по отношению к
возбудителю холеры, его засевают в 200 - 300 мл 1-процентной пептонной
воды (предпочтительно в широкогорлые колбы) и на 2 чашки щелочного
агара так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Посевы
инкубируют при 37 ёC в течение 24 ч, производя последовательные высевы
через 8 - 10 ч инкубации с поверхностного слоя среды на пластинки
щелочного агара. Использование второй среды обогащения в этом варианте
исследования нецелесообразно.
II этап (через 6 - 8 ч от начала исследования)
С первой среды накопления делают высев на щелочной агар и одну из
элективных сред и в 5 - 8 мл второй среды накопления. Пересевы в
жидкие и на плотные среды делают с поверхности жидкой среды большой
бактериологической петлей диаметром 5 мм.
При отрицательных результатах исследования нативного материала
ускоренными методами их повторяют после 6 ч инкубации первой среды
накопления.
III этап (через 12 - 16 ч от начала исследования)
Высев со второй среды накопления на щелочной агар.
В случае необходимости ускорения хода анализа материала от
больного или подозрительного на заболевание холерой отбор колоний со
щелочного агара, засеянного в начале исследования, можно начинать уже
на этом этапе, в остальных случаях - на следующем.
IV этап (через 18 - 24 ч от начала исследования)
Отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на
плотные среды нативного материала, а также в высевах из 1-й и 2-й
накопительных сред.
Чашки с посевами просматривают в проходящем свете невооруженным
глазом или с помощью лупы, а также (особенно в вечернее и ночное
время) под стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете и
отбирают подозрительные на вибрионы колонии для выделения и
идентификации культуры.
На щелочном агаре колонии холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп
в типичной S-форме - круглые, гладкие, плоские, голубоватые,
гомогенные, с ровными краями, прозрачные в проходящем свете и
светло-серые с голубым или зеленоватым оттенком под стереоскопическим
микроскопом в косо проходящем свете (Приложение 6).
Колонии холерных вибрионов на элективных средах TCBS и СЭДХ имеют
ярко-желтую окраску на зеленом или синем фоне среды, полупрозрачные.
Размеры колоний на щелочном агаре через 10 - 12 ч инкубации обычно не
превышают 1 мм, а к 18 - 24 ч достигают 2 - 3 мм в диаметре. Темпы
формирования колоний холерных вибрионов на элективных средах несколько
замедлены, поэтому просмотр посевов на СЭДХ или TCBS следует проводить
не ранее чем через 18 - 20 ч инкубации, когда размеры их становятся
близки к колониям, вырастающим на щелочном агаре.
В отдельных случаях в посевах могут также встречаться атипичные
колонии: мутные с плотным центром, пигментированные (коричневые или
светло-желтые), мельчайшие коккоподобные, шероховатые.
Следует иметь в виду, что состав и качество питательных сред
оказывают влияние на величину и плотность колоний холерных вибрионов,
а также на морфологию клеток.
При отборе колоний можно использовать пробу на индофенолоксидазу
с однокомпонентным реактивом (без альфа-нафтола) или с индикаторными
бумажками из набора СИБ-1 для идентификации вибрионов. С колониями,
обнаруженными на элективных средах, пробу на оксидазу ставить не
рекомендуется.
Подозрительные колонии проверяют в слайд-агглютинации с
сывороткой холерной O1 в разведении 1:50 - 1:100. При положительной
реакции и достаточном количестве подозрительных колоний ставят
слайд-агглютинацию с варианто-специфическими сыворотками Инаба и Огава
в том же разведении, приготавливают мазки для окраски по Граму и
обработки флюоресцирующими иммуноглобулинами. При отрицательных
результатах колонии, обнаруженные в посевах материала от больных,
проверяют в слайд-агглютинации с холерными сыворотками O139 и РО.
Положительная ориентировочная реакция агглютинации с холерной O1
сывороткой в разведении 1:100 и варианто-специфической в разведении
1:50 или положительная реакция с флюоресцирующими иммуноглобулинами в
сочетании с морфологическими, культуральными признаками и
специфической иммобилизацией позволяют выдать на соответствующем этапе
предварительный ответ об обнаружении в исследуемом материале холерного
вибриона O1, а в случае положительной реакции с сывороткой O139 -
холерного вибриона O139 серогруппы.
Подозрительные на вибрионы колонии, агглютинирующиеся и не
агглютинирующиеся холерными O1 и O139 сыворотками, отсевают на одну из
полиуглеводных сред (лактозосахарозная, Ресселя, Клиглера,
маннозосахарозная или др.) и (или) на сектор пластинки щелочного агара
для выделения чистой культуры, ее идентификации и определения
чувствительности к антибиотикам.
V этап (через 24 - 36 ч от начала исследования)
Отбор культур для идентификации.
На полиуглеводных средах отбирают культуры с типичными для
вибрионов характером роста и изменениями:
- на двууглеводных средах (лактозосахарозная, глюкозолактозная и
Клиглер) наблюдается характерное для кислой реакции изменение цвета
столбика при сохранении цвета скошенной части без образования газа, а
также сероводорода, улавливаемого в среде Клиглера;
- в маннозосахарозной среде за счет ферментации обоих углеводов
окрашиваются и столбик, и скошенная часть, а также улавливается
образование сероводорода.
Культуры, выросшие на щелочном агаре, проверяют на наличие
индофенолоксидазы.
Определяют морфологию микроорганизмов и чистоту отобранных
культур, выросших на щелочном агаре и полиуглеводных средах, с помощью
окрашенных по Граму мазков.
Культуры, дающие характерные изменения на полиуглеводных средах и
положительные в пробе на оксидазу, проверяют в ориентировочной
слайд-агглютинации с холерными сыворотками O1 в разведении 1:100, РО,
Инаба и Огава - в разведении 1:50. При отрицательных результатах с
этими сыворотками ставят слайд-агглютинацию с холерной сывороткой O139
серогруппы, используя ее в соответствии с инструкцией по применению.
На основании положительных результатов агглютинации с сыворотками
O1, Инаба или/и Огава выдают предварительный положительный ответ о
выделении из исследуемого материала культуры холерного вибриона O1
соответствующего серовара.
Если выделенная культура реагирует с холерной сывороткой O139 при
отрицательных результатах с сыворотками O1 серогруппы, выдают ответ о
выделении холерного вибриона O139 серогруппы.
Проводят идентификацию выделенных на полиуглеводных средах или на
щелочном агаре агглютинирующихся и не агглютинирующихся сыворотками
O1, РО или O139 серогрупп оксидазопозитивных культур по сокращенной
или полной схеме.
VI этап (через 36 - 48 ч от начала исследования)
Учитывают результаты идентификации и выдают окончательный ответ о
выделении культуры холерного вибриона соответствующей серогруппы и
биовара.
Для холерных вибрионов O1 эпидемическую значимость оценивают по
тестам гемолитической активности и чувствительности к фагам эльтор
ctx+ и ctx-, а в специализированных учреждениях - по результатам ПЦР
или генетического зондирования на присутствие в геноме выделенной
культуры ctx AB гена, а также токсигенности на модели
кроликов-сосунков. Эпидемическую значимость холерных вибрионов O139
серогруппы определяют по тем же тестам, кроме чувствительности к фагам
эльтор ctx+ и ctx-. К окончанию этого этапа исследования должна быть
определена антибиотикочувствительность выделенной культуры.
При выделении от больного или вибриононосителя культуры холерного
вибриона, не агглютинирующейся холерными сыворотками O1 и O139, выдают
ответ о выделении холерных вибрионов не O1 и не O139. При наличии
вибрионных агглютинирующих диагностических сывороток определяют
принадлежность к другим серогруппам (О2 - О83).
Идентификацию культур, агглютинирующихся РО-сывороткой, см. в
разделе 5.3.
5.2.2. Исследование объектов окружающей среды.
Схема анализа объектов окружающей среды отличается от схемы
исследования материала от больных только на I этапе, II - VI этапы
изложены выше.
Вода поверхностных водоемов и водопроводная
В зависимости от времени доставки пробы возможны следующие
варианты посевов с целью первичного накопления вибрионов:
- к исследуемой воде добавляют раствор основного пептона до
1-процентной концентрации, определяют рН, в случае необходимости
подщелачивают 10-процентным раствором едкого натрия до рН 8,4 +/- 0,1.
Время инкубации в 1-й среде накопления - 8 - 10 ч. Объем 2 среды
накопления - 10 мл; время инкубации в среде без теллурита калия 6 ч, а
с теллуритом калия - 18 - 20 ч;
- в исследуемую воду добавляют раствор основного пептона до
1-процентной концентрации и теллурит калия из рабочего разведения
1:1000 до концентрации 1:100000 или 1:200000 в соответствии с данными
проверки. Устанавливают рН - 8,4 +/- 0,1. Время инкубации 18 - 24 ч;
вторая среда накопления - 10 мл среды без теллурита калия, время
инкубации 6 - 8 ч;
- исследование проб воды можно также проводить с использованием в
качестве ингибитора посторонней флоры моющего средства "Прогресс" в
концентрации 0,1 - 0,2%;
- после добавления основного раствора пептона до 1-процентной
концентрации и установления щелочной реакции пробы сохраняют при
комнатной температуре (не выше 25 ёC) до утра (первая среда
накопления). В начале следующего дня засевают 5 мл поверхностного слоя
в 100 мл 1-процентной пептонной воды (вторая среда накопления) и
делают высев на щелочной агар; высев со второй среды накопления
производят через 6 - 8 ч инкубации;
- воду фильтруют через мембранные фильтры N 2 или 3, смыв с
которых сеют в накопительную среду и на агаровые пластинки. Из смыва с
фильтра можно делать мазки для окраски флюоресцирующими холерными
иммуноглобулинами, а также ставить РНГА, ПЦР со специфическими
праймерами.
При интенсивном бактериальном загрязнении проб можно использовать
3 среду накопления.
Хозяйственно-бытовые сточные воды
Сточные воды, доставленные в объеме 1 л, фильтруют через бумажный
или матерчатый фильтр для освобождения от механических примесей (при
необходимости).
После добавления к пробам основного раствора пептона до
1-процентной концентрации устанавливают рН 8,4 +/- 0,1 и инкубируют в
объемах по 500 мл 8 - 10 ч (1 среда накопления) или с добавлением
теллурита калия 1:100000 (1:200000) - 18 - 24 ч.
При заборе сточных вод марлевыми тампонами последние помещают в
широкогорлые колбы или банки с накопительной средой (500 мл) и далее
исследуют, как указано выше.
Гидробионты
Лягушку непосредственно перед исследованием обездвиживают уколом
иглы в спинной мозг и фиксируют на препаровальной доске брюшком вверх.
Поверхность брюшка обрабатывают спиртом и ножницами делают медиальный
разрез. Желчный пузырь отсекают от печени, разрезают и делают
отпечаток на пластинке щелочного агара. Остатки желчи вместе с желчным
пузырем помещают во флаконы с 50 - 100 мл 1-процентной пептонной воды.
Содержимое желудка засевают в 1-процентную пептонную воду, а
внутренней поверхностью стенки делают отпечатки на агаровые пластинки.
Посев кишечника делают таким же образом, отсекая несколько петель в
верхнем, среднем и нижнем отделах кишечника.
У крупных рыб в том же порядке засевают в накопительную среду
содержимое желчного пузыря, желудка, кишечника и жабры. Мелких рыб
(мальков) измельчают ножницами по 10 - 20 экз. в одной пробе и делают
посев суспензии петлей на чашку с агаром и в 1-процентную пептонную
воду.
Дафний, циклопов и др. рачков растирают в ступке и засевают
петлей в 1-процентную пептонную воду.
У раков исследуют кишечник и жабры, делая посев содержимого в
среду накопления, и слизистой стенки - отпечатком на агаровую среду.
Пищевые продукты
Безалкогольные напитки исследуют тем же методом, что и воду.
Молоко в количестве 5 мл сеют в 50 - 100 мл среды накопления или
к 0,5 л молока добавляют основной раствор пептона до 1-процентной
концентрации его в молоке. Другие молочные продукты (кефир, сметану,
творог, мороженое и т.д.) в количестве 5 - 10 мл засевают в
1-процентную пептонную воду.
Твердые пищевые продукты измельчают, растирают в ступке с
физиологическим раствором и засевают в количестве 10 г в 100 мл
накопительной среды и петлей на агаровые среды.
Масло засевают в жидкую среду накопления в количестве 5 - 10 г,
размягчив его в термостате, или делают посев смыва с поверхности его
кусков.
После посева продукта устанавливают рН среды 8,4 +/- 0,1.
Смывы с объектов внешней среды и мух засевают в 1-процентную
пептонную воду и исследуют по обычной схеме.
5.2.3. Порядок исследования в условиях односменной работы
лаборатории.
При осуществлении эпиднадзора за холерой исследование материала
от обследуемых контингентов может выполняться в следующих вариантах.
В качестве 1-й или 2-й среды накопления используют 1-процентную
пептонную воду (рН 8,4 +/- 0,1) с теллуритом калия в конечной
концентрации 1:100000 - 1:200000 в соответствии с результатами его
контроля.
Вопрос выбора транспортной среды и порядка исследования решают в
зависимости от разницы времени с момента взятия пробы до поступления
ее в лабораторию. Примерная схема забора материала от больных в
1-процентную пептонную воду и порядок дальнейшего его исследования на
холеру с учетом различного времени доставки в лабораторию представлены
в табл. 1. В течение рабочей недели для отбора проб используют
1-процентную пептонную воду без теллурита калия в объеме 5 - 10 мл, во
флаконах или пробирках (транспортная среда).
Таблица 1
ПОРЯДОК ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВРЕМЕНИ
ОТБОРА И ДОСТАВКИ ЕГО В ЛАБОРАТОРИЮ В 1% ПВ
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|N |Время |Время |Среда |Назначение |1-я среда |2-я среда |Высев со |
|вариантов|взятия |доставки в |для |среды |накопления |накопления. |2-й среды |
| |материала |лабораторию|взятия | | |Высев с 1-й среды |накопления |
| | | |проб | | |накопления | |
|---------|------------|-----------|---------|-------------|-------------|---------------------|------------|
|1 |6.00 - |До 10.00 |а) 1% ПВ |Среда |Среда с |Через 6 ч инкубации |В начале |
| |10.00 | |50 мл |накопления |доставленны |пересев в 1% ПВ с |следующего |
| | | |б) 1% ПВ | |м |ТК |рабочего |
| | | |5 - 10 |Транспортная |материалом |и высев на щелочной |дня |
| | | |мл |среда |Посев в |агар и (или) ЭС | |
| | | | | |50 мл 1% ПВ | | |
|---------|------------|-----------|---------|-------------|-------------|---------------------|------------|
|2 |10.00 - |После |1% ПВ |Транспортная |Посев 5 - |9.00 следующего дня |Через 6 |
| |до конца |10.00 |5 - 10 |среда |10 |пересев в 1% ПВ, |часов |
| |рабочего |в течение |мл | |мл среды с |высев на щелочной |инкубации |
| |дня |рабочего | | |материалом |агар и (или) ЭС | |
| |лаборатории |дня | | |в | | |
| | |лаборатори | | |50 мл 1% ПВ | | |
| | |и | | |с ТК | | |
|---------|------------|-----------|---------|-------------|-------------|---------------------|------------|
|3 |По |До 10.00 |1% ПВ |Транспортная |Посев 5 - |Через 6 ч инкубации |В начале |
| |окончании |следующего |5 - 10 |среда |10 |пересев в 1% ПВ с |следующего |
| |рабочего |дня |мл | |мл среды с |ТК, |рабочего |
| |дня | | | |материалом |высев на щелочной |дня |
| |лаборатории | | | |в |агар и (или) ЭС | |
| | | | | |50 мл 1% ПВ | | |
|---------|------------|-----------|---------|-------------|-------------|---------------------|------------|
|4 |Выходные |До 10.00 |1% ПВ с |Транспортная |Посев 5 - |Через 6 ч инкубации |В начале |
| |дни |рабочего |ТК 50 мл |среда |10 |пересев в 1% ПВ с |следующего |
| |лаборатории |дня | | |мл среды с |ТК, |рабочего |
| | | | | |материалом |высев на щелочной |дня |
| | | | | |в 50 мл 1% |агар и (или) ЭС | |
| | | | | |ПВ | | |
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Обозначения: ТК - теллурит калия; ПВ - пептонная вода;
ЭС - элективная среда для выделения холерного вибриона
Пробы до отправки в лабораторию сохраняют при комнатной
температуре (24,0 +/- 1,0) ёC в биксах, ящике, шкафу и т.д. в
специально выделенной комнате, закрывающейся на замок.
Продолжительность сохранения проб в указанных условиях - до 24 ч.
В случаях, когда температура в помещении превышает 25 ёC,
материал следует брать в 1-процентную пептонную воду с теллуритом
калия.
В лаборатории в пробы во флаконах доливают соответствующую среду
накопления в количестве до 50 мл, а из пробирок все 5 - 10 мл
транспортной среды с материалом переносят пипеткой в 50 мл среды
накопления.
На период выходного дня лаборатории в порядке исключения
допускается следующий вариант: забор материала в 50 мл 1-процентной
пептонной воды с теллуритом калия (транспортная среда); допускаемое
время сохранения проб до начала исследования при температуре (20,0 +/-
1,0) ёC - 60 ч, (27,0 +/- 3,0) ёC - 48 ч. В лаборатории 5 - 10 мл
поверхностного слоя среды с материалом переносят в 50 мл 1-процентной
пептонной воды без теллурита калия (1 среда накопления) и делают высев
на чашку щелочного агара с дальнейшим исследованием по изложенной
схеме.
Пептонную воду повышенной щелочности в качестве накопительной
среды рекомендуется использовать только на первом этапе исследования с
удлинением срока инкубации ее до 18 - 24 ч. Основной раствор пептона и
1-процентную пептонную воду с рН 9,5 +/- 0,5 можно готовить впрок по
общепринятой методике с подщелачиванием до необходимого уровня и
последующей стерилизацией при температуре 120 ёC - 20 мин.
Для подщелачивания пептонной воды используют 10 - 20% NaOH.
5.3. Идентификация культур холерных вибрионов
Культуры, выделенные на различных этапах, идентифицируют с целью
определения их принадлежности к виду Vibrio cholerae соответствующей
серогруппы (O1, O139 или др.).
К виду V. cholerae относят грамотрицательные, аспорогенные,
полиморфные палочки, слегка изогнутые или прямые, активно подвижные, с
одним полярно расположенным жгутиком, образующие индофенолоксидазу,
ферментирующие глюкозу в аэробных и анаэробных условиях до кислоты
(без газа), расщепляющие маннит, маннозу, сахарозу, но не активные в
отношении к арабинозе, инозиту, салицину и некоторым другим
субстратам. Холерные вибрионы декарбоксилируют лизин и орнитин, но не
обладают дигидролазой аргинина, образуют индол, обладают
нитратредуктазой, не продуцируют сероводород. Таксономическое
положение холерных вибрионов и признаки, дифференцирующие их от
родственных микроорганизмов, приведены на рис. 2 и в табл. 2, 3, 4.
------------------------
|Семейство Vibrionaceae|
|Shewan and Veron, 1965|
------------------------
|---------------------
\/ |
------------------------ |
| Типовой род Vibrio | |
| Pacini, 1854 | |
------------------------ \/
--------------------- | | ----------------------
|36 видов вибрионов,|<------ | |Другие роды: |
|в т.ч. патогенных | \/ |Aeromonas Kluyver et|
|для человека: | ----------------- |Van Niel, 1936; |
|V. alginolyticus | | Типовой вид | |Enhydrobacter Staley|
|V. cincinnatiensis | |Vibrio cholerae| |et al, l987; |
|V. damsela <**> | ----------------- |Photobacterium |
|V. fluvialis | | |Beijerinc, 1889; |
|V. furnissii | | |Plesiomonas Habs et |
|V. harveyi | \/ |Schubert, 1962 |
|V. hollisae | ----------------- L---------------------
|V. metschnikovii | | Серогруппы |
|V. mimicus | -----------------
|V. parahaemolyticus| | | |
|V. vulnificus | | | |
--------------------- | | |
--------------- \/ ---------
--------- | --------- | ---------
| O1 |<- | O139 | ->| non |
| |--------------| | |O1/O139|
--------- | --------- ---------
| \/ |
| Возбудители холеры Возбудители | гастроэнтеритов
| и системных | инфекций
\/ \/
------------------ ------------------------
| Биовары | |V. cholerae O2 - O138,|
------------------ |O140 - O190... |
----- ------------ |(по международной |
| | |классификации) |
\/ \/ |V. cholerae O2 - O83 |
V. cholerae V. cholerae |(по отечественной |
cholerae eltor |классификации) <***> |
| | ------------------------
---- ------
\/ \/
------------------
| Серовары: |
| Inaba |
| Ogava |
| Hikojima |
------------------
Рис. 2. Классификация вибрионов <*>
------------------------------------
<*> Таксономия вибрионов представлена по Bergeys manual of
Determinative Bacteriology, 1994.
<**> Предложено McDonell & Colwell (1985) отнести к новому роду
Listonella.
<***> Типовые штаммы О2 - О39 соответствуют Sakazaki (1970); О40
- О83, а также O12; О23 и О26 не изучены в сравнении с международной
коллекцией типовых штаммов.
Таблица 2
ОСНОВНЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ РОДА VIBRIO
И НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|Признаки |Роды сем. Vibrionaceae |Enterobacteriaceae|Pseudomonadaceae|
| |-------------------------------------------------------------------| | |
| |Vibrio |Aeromonas|Enhydrobacter|Plesiomonas|Photobacterium| | |
| |----------------| | | | | | |
| |V. |другие | | | | | | |
| |cholerae|виды | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|1 |2 |3 |4 |5 |6 |7 |8 |9 |
|----------------------|-------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|Окраска по |Грамотрицательные |
|Граму, |полиморфные прямые или слегка изогнутые палочки |
|морфология | |
|----------------------|-------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|Подвижность |+ |+(-) |+(-) |- |+ |+ |+(-) |+ |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Оксидаза |+ |+(-) |+ |+ |+ |+(-) |- |+(-) |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Рост на средах |+ |-(+) |+ |+ |+ |- |- |- |
|без NaCl | | | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Чувствительность |+ |+(-) |- |- |+ |+ |- |- |
|к О129 <*> | | | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|О/Ф глюкозы |+/+ |+/+ |+/+ |+/+ |+/+ |+/+ |+/+ |+/- |
|в среде | | | | | | | | |
|Хью - Лейфсона | | | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Газ из глюкозы |- |-(+) |+(-) |- |- |+ |+/- |- |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Лизиндекарбоксилаза |+ |+(-) |-(+) |+ |+ |+ |+/- |-(+) |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Орнитиндекарбоксилаза |+ |+/- |-(+) |+ |+ |+ |+/- |-(+) |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Аргининдигидролаза |- |-(+) |+ |+ |+ |+ |-/+ |+/- |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Ферментация: | | | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|лактозы |- |-(+) |-(+) |- |+ |X |+/- |-(+) |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|маннита |+ |+(-) |+(-) |X |- |- |+(-) |+(-) |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|арабинозы |- |-(+) |+(-) |X |- |- |+(-) |-(+) |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|сахарозы |+ |+(-) |+ |X |- |-(+) |+/- |- |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|инозита |- |-(+) |- |X |+ |- |-(+) |X |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Образование: | | | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|ацетилметилкарбинола |+(-) |-(+) |+(-) |- |- |+ |-(+) |X |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|индола |+ |+(-) |+(-) |- |- |- |+(-) |+/- |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|нитратредуктазы |+ |+(-) |+ |+ |+ |+(-) |+ |+/- |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|бета-галактозидазы |+ |+(-) |+ |X |+ |+ |-(+) |X |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|желатиназы |+ |+(-) |+ |X |- |+ |-(+) |+/- |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Биолюминесценц |-(+) |-(+) |- |X |- |+ |- |- |
|ия | | | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Мол. % G + C |38 |51 |57 - |66 |51 |40 - |39 - |58 - |
|в ДНК | | |63 | | |44 |59 |70 |
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------
<*> Бактериостатический агент 2,4-диамино-6,7-диизопропилптериоидин.
Условные обозначения:
Х - нет данных;
+ - положительный результат в 90%;
- - отрицательный результат в 90%;
+/- - положительный и отрицательный результаты встречаются в
равной степени;
+(-) или -(+) - в скобках редко наблюдаемый результат.
Таблица 3
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИДОВ
РОДА VIBRIO
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|Признаки |V. |V. |V. |V. |V. |V. |V. |V. |V. |V. |V. |V. |
| |cholerae|alginolyticus|cicinnatiensis|damsela|fluvialis|furnissii|harveyi|hollisae|metschnikovii|mimicus|parahaemolyticus|vulnificus|
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|1 |2 |3 |4 |5 |6 |7 |8 |9 |10 |11 |12 |13 |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Морфология | | | | | | | | | | | | |
|<*> |+ |+ |+ |d |d |+ |- |+/- |d |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Подвижность | | | | | | | | | | | | |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Роение на |- |+ |- |- |- |- |d |- |- |- |d |- |
|агаре | | | | | | | | | | | | |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Индофенолоксидаза |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Образование: | | | | | | | | | | | | |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|газа из глюкозы |- |- |- |- |- |+ |- |- |- |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|индола |+ |+ |- |- |- |+(-) |+ |+ |+(-) |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|ацетилметилкарбинола |+(-) |+ |+/- |+ |- |- |d |- |+ |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Ферментация: | | | | | | | | | | | | |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|лактозы |- |- |- |- |- |- |- |- |+(-) |-(+) |- |d |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|арабинозы |- |- |+ |- |+ |+ |- |+ |- |-(+) |+/- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|сахарозы |+ |+ |+ |- |+ |+ |d |- |+ |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|целлобиозы |- |- |+ |- |- (+) |- (+) |d |- |- |- |- |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|маннита |+ |+ |- |- |+ |+ |d |- |+ |+ |+ |+(-) |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|салицина |- |- |+ |- |+/- |- |- |- |- |- |- |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Аргининдигидролаза |- |- |- |+ |+ |+ |- |- |-(+) |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Лизиндекарбосилаза |+ |+ |+ |+(-) |- |- |+ |- |+(-) |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Орнитиндекарбоксилаза|+ |d |- |- |- |- |- |- |- |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|бета-галактозидаза |+ |- |+/- |- |d |d |- |- |d |+ |- |d |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Нитратредуктаза |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Амилаза |+ |+ |+ |X |+ |d |+ |X |+ |- |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Желатиназа |d |+ |- |- |+/- |d |- |- |d |d |+ |d |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Рост в 1%-ной | | | | | | | | | | | | |
|пептонной | | | | | | | | | | | | |
|воде | | | | | | | | | | | | |
|с NaCL: |+ |- |- |- |- (+) |- (+) |- |- |-(+) |+ |- |- |
|0% | | | | | | | | | | | | |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|3% |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |-(+) |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|6% |d |+ |+ |+ |+ |+ |+ |d |d |d |+ |d |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|10% |- |+ |- |- |- (+) |- |- |- |- |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Рост при: | | | | | | | | | | | | |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|4 ёC |- |- |- |- |- |- |- |X |- |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|20 ёC |+ |+ |- |- |+ |+ |+ |X |+ |X |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|35 ёC |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |X |+ |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|42 ёC |+ |+ |- |- |d |- |d |X |d |d |d |d |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|45 ёC |- |- |- |- |d |- |- |X |d |X |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Биолюминесценция |-(+) |- |- |- |- |- |d |- |- |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Чувствительность |+ |-(+) |-(+) |+ |d |- |+ |d |+ |+ |-(+) |+ |
|к О129 | | | | | | | | | | | | |
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> Грамотрицательные прямые или изогнутые палочки.
Условные обозначения: см. обозначения табл. 2;
d - различный результат.
Таблица 4
ОТНОШЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ ВИБРИОНОВ К ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИМ УГЛЕВОДАМ
----------------------------------------------------------------
|Виды |Ферментация |
|вибрионов |------------------------------------------|
| |арабинозы |маннозы |сахарозы |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. cholerae |- |+(-) |+ |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. mimicus |- |+ |- |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. metschnikovii |- |+/- |+ |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. fluvialis |+ |+ |+ |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. vulnificus |- |+(-) |-(+) |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. alginolyticus |- |+ |+ |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. |+(-) |+ |-(+) |
|parahaemolyticus | | | |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. hollisae |+ |-(+) |- |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. furnissii |+ |+(-) |+ |
| |с образованием газа |
|-------------------|------------------------------------------|
|V. damsela |- |+ |- |
| |с образованием газа у некоторых штаммов |
|-------------------|------------------------------------------|
|V. |+ |X |+ |
|cincinnatiensis | | | |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. harveyi |- |X |+(-) |
----------------------------------------------------------------
Условные обозначения:
() - в скобках указан редко встречающийся вариант;
+/- - приблизительно 50% штаммов не обладают этими признаками;
X - нет данных.
Возбудителями холеры являются V. cholerae O1 (биоваров
классического и эльтор; сероваров Инаба, Огава или Гикошима) и O139
серогрупп.
Токсигенные, эпидемически значимые варианты холерных вибрионов O1
и O139 серогрупп, содержащие гены холерного токсина (ctx АВ) и
токсинкорегулируемых пилей (tcp А), вызывают заболевания холерой,
склонные к широкому эпидемическому распространению.
Нетоксигенные (не содержащие гена холерного токсина),
эпидемически не опасные варианты холерных вибрионов O1 и других
серогрупп могут вызывать спорадические или групповые (при общем
источнике инфицирования) заболевания, не склонные к широкому
эпидемическому распространению.
Предварительную идентификацию проводят по комплексу признаков,
включая морфологию колоний, морфологию и подвижность микробных клеток,
пробу на оксидазу и слайд-агглютинацию с сыворотками O1 (1:50 -
1:100), РО (1:50) и O139 (в разведении, соответствующем обозначению на
этикетке). Для культур, положительно реагирующих с сывороткой O1,
устанавливают принадлежность к серологическим вариантам (Инаба и
Огава) также в слайд-агглютинации.
Окончательную идентификацию выделенных на полиуглеводной среде
или щелочном агаре агглютинирующихся на стекле культур проводят по
сокращенной или полной схеме.
Сокращенная схема предусматривает изучение культуры в развернутой
реакции агглютинации с холерными сыворотками O1, Инаба, Огава и РО,
определение чувствительности к диагностическим бактериофагам
классическому и эльтор, отношения к глюкозе в среде Хью - Лейфсона,
сахарозе, маннозе, манниту и арабинозе в средах Гисса. Культуры
оксидазопозитивных, активно подвижных вибрионов, расщепляющие глюкозу
в среде Хью - Лейфсона до кислоты без газа, ферментирующие сахарозу,
маннозу, маннит в средах Гисса и инактивные по отношению к арабинозе,
агглютинирующиеся не менее чем до 1/2 титра сыворотками O1 и одной из
варианто-специфических сывороток, относят к V. cholerae O1 серовара
Огава или Инаба. Культуры, агглютинирующиеся обеими
варианто-специфическими сыворотками не менее чем до 1/2 титра, относят
к серовару Гикошима. В случае агглютинабельности выделенной культуры
обеими варианто-специфическими сыворотками целесообразно повторить
исследование с использованием различных серий коммерческих препаратов.
Для подтверждения выделенной культуры холерных вибрионов к O139
серогруппе достаточно положительного результата в слайд-агглютинации с
соответствующей сывороткой.
Полная схема идентификации культур, агглютинирующихся холерными
сыворотками O1 серогруппы, предусматривает изучение их по
дополнительным тестам, определяющим принадлежность к биовару
(гемагглютинация, чувствительность к полимиксину, биовароспецифическим
фагам, реакция Фогес - Проскауэра), определение антибиотикограммы и
эпидемической значимости по чувствительности к ctx+ и ctx- фагам в
сочетании с тестом Грейга на гемолиз, а в специализированных
учреждениях кроме того - по результатам исследования в ПЦР, методом
молекулярного зондирования на наличие гена холерного токсина и
определения холерогенности на модели кроликов-сосунков.
В случае выделения культур холерных вибрионов O139 серогруппы их
также изучают по чувствительности к антибиотикам, определяют
эпидемическую значимость ориентировочно по гемолитической активности в
пробе Грейга, окончательно - указанными выше специальными методами.
На культуры, имеющие характерные для вибрионов морфологические,
культуральные и биохимические признаки, агглютинирующиеся O1 и одной
из варианто-специфических сывороток не менее чем до 1/2 титра,
лизирующиеся и не лизирующиеся холерным и эльтор фагами, а также на
культуры, агглютинирующиеся сывороткой O139, выдают окончательный
ответ, указывая чувствительность их к антибиотикам и определяя
эпидемическую значимость по результатам ориентировочных или
специальных исследований.
Токсигенные штаммы холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп, как
правило, не лизируют эритроциты барана, в отличие от нетоксигенных
штаммов.
Кроме того, для холерных вибрионов O1 серогруппы указывают биовар
на основании чувствительности к одному из диагностических фагов
(эльтор или классическому) и (или) по дополнительным признакам для
фагорезистентных культур (табл. 5).
Таблица 5
ПРИЗНАКИ, ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИЕ БИОВАРЫ V. CHOLERAE O1
---------------------------------------------------------------
|