МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ (ГМО) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧ. Методика. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 17.10.05 МУК 4.2.2008-05

6. Проведение анализа. Выделение ДНК

     6.1. В одноразовые центрифужные пробирки типа  eppendorf  на  1,5
куб.  см  внести  300 мг бисера и 70 - 80 мг анализируемого материала.
Добавить 0,5 мл 5 мМ Na2-cоль ЭДТА и термостатировать при 65 град.С  в
течение  30  -  60  мин.  Время  инкубации  составляет  30  минут  для
процессированных продуктов (мука,  чипсы,  детское питание и др.) и до
60 мин.  для зерна.  Через каждые 10 - 15 минут гомогенизировать пробу
срезанным наконечником (для каждой пробы  использовать  индивидуальный
наконечник).
     6.2. К содержимому пробирки  добавить  400  куб.  мм  лизирующего
реагента  из  набора реагентов и перемешать на вортексе до максимально
однородного состояния.  Пробу термостатировать при 65 град.С 60 -  120
мин.
     6.3.  После  термостатирования  пробу, при необходимости, еще раз
гомогенизировать,  добавить  500  куб.  мм  бидистиллированной  воды и
перемешать на вортексе.
     6.4.  Центрифугировать  пробу 1 мин. при 5000 g (12000 об./мин.).
Прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку.
     6.5.  Добавить  20  куб.  мм  сорбента из набора реагентов (перед
использованием  сорбент  следует  интенсивно  встряхнуть на вортексе).
Пробирку  поместить на ротатор и перемешивать на вортексе 10 минут (10
- 20 об./мин.).
     6.6. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.
     6.7.  Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант. К осадку
добавить  200  куб.  мм  лизирующего  реагента  из  набора реагентов и
перемешать  на  вортексе  до  однородного  состояния. Центрифугировать
пробу 10 секунд при 5000 g.
     6.8.  Удалить  супернатант.  К осадку добавить 1 куб. см рабочего
раствора  солевого  буфера  из набора реагентов, перемешать содержимое
пробирки переворачиванием 5 - 10 раз. Центрифугировать пробу 10 секунд
при 5000 g.
     6.9. Удалить супернатант не задевая осадка.
     6.10.  К  осадку  добавить  1  куб. см рабочего раствора солевого
буфера,  перемешать  на вортексе, центрифугировать пробу 10 секунд при
5000 g и осторожно удалить супернатант.
     6.11. Повторить предыдущий пункт еще раз.
     6.12. Подсушить осадок при 65 град.С в течение 4 - 5 минут.
     6.13.  К  осадку  добавить 50 куб. мм экстракционного раствора из
набора  реагентов.  Отбор  раствора из исходного флакона проводить при
постоянном   помешивании,   не  допуская  выпадения  в  осадок  гранул
ионообменной смолы.
     6.14.  Суспендировать  содержимое  пробирки  на  вортексе  5 - 10
секунд  до  гомогенного состояния, затем термостатировать 10 минут при
65 град.С.
     6.15.  Еще раз суспендировать пробу на вортексе, центрифугировать
1 мин. при 5000 g.
     6.16. Супернатант,  содержащий очищенную ДНК,  перенести в чистую
пробирку и хранить при -20  град.С  до  проведения  ПЦР  анализа.  При
отборе  раствора  ДНК необходимо избегать захвата осадка,  содержащего
сорбент.
     Примечание:  Кроме  описанного выше сорбционного метода выделения
ДНК,   возможно   использование   метода   выделения  с  помощью  СТАВ
(гексадецилтриметиламмониум   бромид),   описанного   в   методических
указаниях  по  определению  генетически  модифицированных источников в
продуктах  питания  растительного  происхождения  методом полимеразной
цепной    реакции    (МУК    4.2.1902-04    "Определение   генетически
модифицированных  источников (ГМИ) растительного происхождения методом
полимеразной цепной реакции").