Фрагмент документа "О НАДЗОРЕ ЗА ОБОРОТОМ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГМО".
VII. ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТНОГО
АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
7.1. Используются следующие праймеры:
- на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты:
5` CGG CTA CTC CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT TTC AGA AGA (39 н.о.),
5` CCA TTT TCC TTT TTT ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG A (40
н.о.);
- на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:
5` ACC GTA CCT CGC ATT ACC CTT ACG CTG AAG AGA (33 н.о.),
5` TGC CCG CTT CGA AAC CAA TGC CTA AAG AGA (30 н.о.);
- на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:
5` GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG ACA GA (32 н.о.),
5` GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35 н.о.);
- на маркерный ген nptII из транспазона Tn5 бактериального
происхождения:
5` GTG ACC CAT GGC GAT GCC TGC TTG C (25 н.о.),
5` ACC CAG CCG GCC ACA GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.):
- на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:
5` AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC CTA AAA GA (32 н.о.),
5` CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA (32 н.о.).
7.2. Набор реактивов для асимметричной мультиплексной ПЦР (амПЦР)
включает:
- сухие смеси, включающие Taq ДНК полимеразу,
дезоксинуклеозидтрифосфаты, хлорид магния с конечными концентрациями,
соответственно, 1 ед. 200 мкМ и 2,5 млМ, оптимизированную буферную
систему для проведения одной стандартной ПЦР:
- растворитель;
- минеральное масло;
- "+" контроль амплификации - 1 пробирка, 0,5 мл.
7.3. Проведение реакции:
- необходимое количество микропробирок с сухими реактивами
промаркировать соответствующим образом: "-" контроль", "исследуемые
пробы", "+" контроль";
- добавить во все пробирки по 5 мкл праймеров, 10 мкл
растворителя;
- в пробирку, которая служит отрицательным контролем, добавить 5
мкл деионизированной воды, в опытные пробирки - по 5 мкл раствора
исследуемой ДНК, в пробирку с положительным контролем - 5 мкл раствора
контрольной ДНК;
- добавить во все пробирки по 20 мкл минерального масла;
- пробы готовы для проведения амплификации;
- запустить программу амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
|Шаг программы| Температура, |Время инкубации, сек| Количество циклов |
| | град.С | | |
|-------------|------------------|--------------------|-------------------|
| 1) | 94 | 180 | 1 |
|-------------|------------------|--------------------|-------------------|
| 2) | 94 | 30 | 42 |
|-------------|------------------|--------------------| |
| 3) | 62,5 | 30 | |
|-------------|------------------|--------------------|-------------------|
| 4) | 72 | 180 | 1 |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для осуществления
гибридизации.
7.4. Гибридизация ДНК, ферментный анализ на биологическом
микрочипе и сканирование результатов:
- набор реактивов для ДНК гибридизации и ферментного анализа
содержит 20 x SSC - 50 мл, диаминобензидин (ДАБ) - 100 таблеток,
конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином - 0,1 мл с концентрацией
1 мг/мл, 1 пробирка;
- приготовить рабочие разведения раствора 20 x SSC (3 М NaCl, 0,3
М цитрат натрия, pH 7,4): 2 x SSC, 0,1% SDS; 0,1 x SSC; 0,1 x SSC,
0,1% SDS; 0,01 x SSC;
- схема приготовления 100 мл раствора:
---------------------------------------------------------------------------
| Раствор | 20 x SSC, мл | 10%-ный SDS, мл | H2O дист., мл |
|----------------------|---------------|-----------------|----------------|
| 2 x SSC, 0,1% SDS | 10,00 | 1 | 89,00 |
|----------------------|---------------|-----------------|----------------|
| 0,1 x SSC | 0,50 | - | 99,50 |
|----------------------|---------------|-----------------|----------------|
| 0,1 x SSC, 0,1% SDS | 0,50 | 1 | 98,50 |
|----------------------|---------------|-----------------|----------------|
| 0,01 x SSC | 0,05 | - | 99,95 |
---------------------------------------------------------------------------
- микропробирки с продуктами амплификации ДНК центрифугировать 1
- 2 секунды для сбора пробы на дне пробирки, добавить в каждую
микропробирку 5 мкл 20 x SSC и 0,2 мкл 10% SDS, перемешать,
центрифугировать 1 - 2 секунды при 3000 об/мин, распределить
полученную смесь по поверхности микрочипа, содержащей зоны
иммобилизованных олигонуклеотидов;
- поместить микрочип во влажную камеру, поставить на 1 час в
воздушный термостат с температурой 42 °C;
- по окончании реакции капли смыть буфером 2 x SSC, 0,1% SDS,
тщательно промыть чип растворами 2 x SSC, 0,1% SDS - 1 раз 5 минут,
0,1 x SSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 минут, 0,1 x SSC - 5 раз по 1
минуте, 0,01 x SSC - в течение 10 секунд.
7.5. Проведение ферментного анализа:
- исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200
раз буфером 1 x SSC, содержащим 1% БСА (бычий сывороточный альбумин),
из расчета 25 мкл на микрочип;
- нанести 25 - 30 мкл разведенного конъюгата на рабочую зону
микрочипа и поместить его на 30 минут во влажную камеру при комнатной
температуре;
- смыть конъюгат раствором 1 x SSC;
- залить микрочип раствором 2 x SSC, промыть 5 минут;
- промыть микрочип раствором 1 x SSC;
- непосредственно перед применением приготовить раствор субстрата
- диаминобензидина (ДАБ), для этого растворить таблетку ДАБ в 1 см3
буфера 0,1 x SSC, добавить 30 мм3 3%-ного раствора пероксида водорода
и перемешать, раствор использовать немедленно;
- залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата, выдержать от
2 до 10 минут при комнатной температуре;
- в случае положительной реакции появляются коричневые пятна
окисленного субстрата;
- промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли воды
и поместить в термостат 42 °C на 5 - 10 минут, после сушки микрочип с
окрашенными зонами хранить в темном месте.
7.6. Сканирование биологических микрочипов:
- осуществлять с применением аппаратно-программного комплекса для
анализа биологических микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001" и компьютерной
программы для анализа изображений;
- в соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым в
комплекте с аппаратно-программным комплексом, подготовить сканер
микрочипов к работе;
- поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать его
и закрыть рамку;
- запустить программу сканирования, функционирующую в диалоговом
режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к сканированию и
только после этого вставить рамку с микрочипом в приемное окно
детектора;
- после завершения сканирования микрочипа сохранить изображение,
присвоив файлу соответствующее имя.
7.7. Анализ изображений биочипов:
- запустить программу обработки изображения микрочипа, ввести
оцифрованное изображение в программу, для этого выбрать опцию "Файл",
открыть изображение, в появившемся диалоговом окне выбрать формат, в
котором представлены изображения, и выбрать в списке нужный файл,
изображение появится в основном окне программы;
- провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры
измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого
выбрать опцию "Анализ", "Разметка матрицы";
- разметка начинается с рисования прямоугольника, боковые стороны
которого проходят через центры узлов крайних столбцов, для этого нужно
щелкнуть левой кнопкой мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки,
затем, держа кнопку нажатой, переместить правую нижнюю вершину
появившегося прямоугольника в центр нижнего правого узла;
- в результате предварительной разметки на экране появится
четырехугольник с внутренними линиями, расположенными равномерно, в
соответствии с заданным числом столбцов матрицы, чтобы завершить
разметку и закрыть диалоговое окно, нужно нажать клавишу "Принять";
- после завершения базовой разметки провести автоматическую
коррекцию положения зондов, для этого в меню выбрать опцию
"Настройки/Автоматическая подстройка";
- для анализа результатов нужно выбрать опцию меню "Анализ" -
"Показать результаты", по окончании измерений программа предоставляет
возможность подготовки и распечатки протокола испытаний, для этого
нужно выбрать опцию меню "Файл" и затем "Заполнить протокол", после
этого появится окно с формой для заполнения, после того как она будет
заполнена, нажать кнопку "Выход".
7.8. Интерпретация результатов:
- появление регистрируемого компьютерной программой оптического
сигнала в одной, нескольких или во всех пяти зонах гибридизации,
содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на присутствие
рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о наличии ГМО растительного
происхождения в анализируемом образце;
- отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех пяти
гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды,
указывает на отсутствие рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о том,
что анализируемый образец не имеет ГМО растительного происхождения;
- появление оптического сигнала в зоне гибридизации при
использовании отрицательного контроля амплификации свидетельствует о
получении ложноположительного результата, причиной может быть
загрязнение реактивов и/или оборудования, в этом случае необходимо
обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором 1H
соляной кислоты, заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить
анализ;
- отсутствие оптического сигнала при использовании положительного
контроля амплификации свидетельствует о получении ложноотрицательного
результата, причиной могут быть потеря активности одного из
компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с
применением ферментного анализа на биологическом микрочипе, в этом
случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить
анализ.
|
Фрагмент документа "О НАДЗОРЕ ЗА ОБОРОТОМ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГМО".