Фрагмент документа "О НАДЗОРЕ ЗА ОБОРОТОМ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГМО".
VIII. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
8.1. Метод количественного определения генетически
модифицированной сои:
- метод позволяет количественно определить рекомбинантную ДНК,
характерную для генетически модифицированных линий сои в пищевых
продуктах методом ПЦР в реальном времени;
- анализ проводится по гену лектина, который присутствует в
геноме всех линий сои, и универсальной последовательности 35 S
промотора вируса мозаики цветной капусты, который присутствует в
геноме всех генетически модифицированных линий сои;
- праймеры на ген лектина:
1) 5` TCC ACC CCC ATC CAC ATT T 3`;
2) 5` GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA 3`;
3) 5`-FAM-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA-3`;
длина ампликона 81 пара нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` GCC TCT GCC GAC AGT GGT 3`;
5) 5` AAG ACG TGG TTG GAA CGT CTT C 3`;
6) 5`-FAM-CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G-TAMRA-3`;
длина ампликона 82 пары нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК сои:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |10,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) | 5,00 |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|MgCl2 (25 ммоль/л) | 5 ммоль/л |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 |900 нмоль/л каждого |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|dUTP |400 ммоль/л |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200 ммоль/л каждого |
|(2,5 ммоль/л каждого) | |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Праймер 3 |100 нмоль/л |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Деионизированная вода |Довести до 50,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |10,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) | 5,00 |
|----------------------------------|--------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|MgCl2 (25 ммоль/л) | 5 ммоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 |900 нмоль/л каждого |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|dUTP |400 ммоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP|200 ммоль/л каждого |
|(2,5 ммоль/л каждого) | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Праймер 6 |100 нмоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Деионизированная вода |Довести до 50,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- при проведении исследования использовали стандартные образцы
состава генетически модифицированной сои;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|---------------------|---------------------------------------------------|
|Доамплификационный |2 мин./50 град. C |
|период | |
|---------------------|---------------------------------------------------|
|Денатурация |10 мин./95 град. C |
|---------------------|---------------------------------------------------|
|Амплификация |15 сек./95 град. C, |
| |60 сек./60 град. C измерение |
|---------------------|---------------------------------------------------|
|Количество циклов |45 |
|амплификации | |
---------------------------------------------------------------------------
- результаты исследования, приложение 2.22.
8.2. Метод количественного определения генетически
модифицированной кукурузы:
- метод позволяет количественно определить рекомбинантную ДНК,
характерную для генетически модифицированных линий кукурузы, в пищевых
продуктах методом ПЦР в реальном времени;
- анализ проводится по гену инвертазы кукурузы, который
присутствует в геноме всех линий кукурузы, и универсальной
последовательности 35 S промотора вируса мозаики цветной капусты,
который присутствует в геноме всех генетически модифицированных линий,
за исключением GA 21;
- праймеры на ген инвертазы кукурузы:
1) 5` CAC TCC ATC GTG GAG AGC TT 3`;
2) 5` GGC GTT GTT GAA GAG GAA GA 3`;
3) 5`-FAM-TAC CCC ACA CGA GCC ATC TAC GAC T-TAMRA-3`;
длина ампликона 111 пар нуклеотидов;
- праймеры, на целевую последовательность ГМО:
4) 5` CGT CTT CAA AGC AAG TGG ATT G 3`;
5) 5` TCT TGC GAA GGA TAG TGG GAT T 3`;
6) 5`-FAM-TCT CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG CA-TAMRA-3`;
длина ампликона 79 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
--------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл | | Реактивы | Объем, мкл |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |10,00 | |Раствор целевой ДНК (максимальное |10,00 |
|количество ДНК 200 нг) | | |количество ДНК 200 нг) | |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 | |Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) | 5,00 | |Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) | 5,00 |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси | | |Концентрация в реакционной смеси |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|MgCl2 (25 ммоль/л) | 5 ммоль/л | |MgCl2 (25 ммоль/л) | 5 ммоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 |900 нмоль/л каждого | |Праймеры 1, 2 |900 нмоль/л каждого |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|dUTP |400 ммоль/л | |dUTP |400 ммоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, |200 ммоль/л каждого | |Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, |200 ммоль/л каждого |
|dGTP (2,5 ммоль/л каждого) | | |dGTP (2,5 ммоль/л каждого) | |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Праймер 3 |100 нмоль/л | |Праймер 3 |100 нмоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Деионизированная вода |Довести до 50,00 мкл | |Деионизированная вода |Довести до 50,00 мкл |
--------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |10,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) | 5,00 |
|----------------------------------|--------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|MgCl2 (25 ммоль/л) | 5 ммоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 |900 нмоль/л каждого |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|dUTP |400 ммоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, |200 ммоль/л каждого |
|dGTP (2,5 ммоль/л каждого) | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Праймер 6 |100 нмоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Деионизированная вода |Довести до 50,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- при проведении исследования использовали стандартные образцы
состава генетически модифицированной кукурузы;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 °C |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |10 мин./95 °C |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация |15 сек./95 °C, 30 сек./60 °C измерение|
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |50 |
---------------------------------------------------------------------------
- результат исследований, приложение 2.23.
8.3. Метрологические характеристики метода:
- границы интервала, в котором погрешность определения находится
с доверительной вероятностью Р = 0,95, составляют от 0,1% до 5%,
нижнюю и верхнюю границы погрешности определяют с использованием
сертифицированных стандартных образцов состава и свойств, стандартные
отклонения повторяемости результатов (дельта) составляют от 0,067 (для
стандарта 0,1%) до 0,540 (для стандарта 5%), что соответствует
погрешности сертифицированных стандартных образцов состава ГМО
растительного происхождения:
- результаты анализа образцов принимают, если коэффициент
корреляции калибровочной прямой, построенной по сертифицированным
стандартным образцам состава ГМО растительного происхождения, по
2
методу наименьших квадратов (R ) > 0,97.
8.4. Метод количественного определения сои линии 40-3-2:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена лектина и
генетической конструкции, характерной для сои линии 40-3-2;
- используются зонды, специфичные к трансгену и гену лектина,
меченные красителями FAM и VIC соответственно;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной сои: 5,0%, 2,0%, 1,0%,
0,5% и 0,00%;
- праймеры на ген лектина сои:
1) 5` TCC ACC CCC ATC CAC ATT T 3`;
2) 5` GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA 3`;
3) 5`-VIC-AAC GGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA-3`;
- на целевую последовательность ГМО:
4) 5` GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT 3`;
5) 5` GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C 3`;
6) 5`-FAM-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG-TAMRA-3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,00 |
|количество ДНК 50 - 200 нг) | |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |18,30 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (20 мкМ) | 0,10 каждого |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (20 мкМ) | 0,25 каждого |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймеры 3, 6 (10 мкМ) | 0,50 каждого |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,00 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР (10 X) |10,60 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,00 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,40 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Итого: |50,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.C |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.C |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.C |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град.C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.5. Метод количественного определения сои линии A2704-12:
- основан на ПЦР в реальном времени, с определением гена лектина
и области ДНК, специфичной трансформационному событию А2704-12;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной сои А2704-12: 0,1%, 0,4%,
0,9%, 2,0%; 3,3%;
- праймеры на ген лектина сои:
1) 5` CAC CTT TCT CGC ACC AAT TGA CA 3`;
2) 5` TCA AAC TCA ACA GCG ACG AC 3`;
3) 5` FAM-CCA CAA ACA CAT GCA GGT TAT CTT GG-TAMRA-3`;
длина ампликона 105 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` GCA AAA AAG CGG TTA GCT CCT 3`;
5) 5` ATT CAG GCT GCG CAA CTG TT 3`;
6) 5`-FAM-CGG TCC TCC GAT CGC CCT TCC-TAMRA-3`;
длина ампликона 64 пары нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК сои:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,0 |
|количество ДНК 50 - 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |18,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (20 мкМ) | 0,5 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (10 мкМ) | 1,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,6 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,4 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,0 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,0 |
|количество ДНК 50 - 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |17,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (20 мкМ) | 1,0 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (10 мкМ) | 1,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,6 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,4 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,0 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.6. Метод количественного определения кукурузы линии MON 810:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез группы белков, присущих для всех линий кукурузы
(hmg) и области ДНК, специфичной трансформационному событию MON 810,
на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции
промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты:
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной кукурузы: < 0,02%, 0,1%,
0,5%, 1,0%, 2,0%, 5,0%:
- праймеры на ген hmg:
1) 5` TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCC CA 3`;
2) 5` GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T 3`;
3) 5`-FAM-CAA TCC ACA CAA ACG CAC GCG TA-TAMRA-3`;
длина ампликона 79 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CGT 3`;
5) 5` GCC ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTT 3`;
6) 5`-FAM-AAC ATC CTT TGC CAT TGC CCA GC-TAMRA-3`;
длина ампликона 92 пары нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,0 |
|количество ДНК 50 - 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |19,3 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (20 мкМ) | 0,1 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (10 мкМ) | 0,5 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,6 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,4 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,0 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,0 |
|количество ДНК 50 - 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |19,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (20 мкМ) | 0,25 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (10 мкМ) | 0,5 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,6 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,4 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,0 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.7. Метод количественного определения кукурузы линии MON 863:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех
линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию
MON 863, на границе генома кукурузы и элемента генетической
конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,01%, 1,0%,
5,0%, 10,0%;
- праймеры на ген adhl 1:
1) 5` CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3`;
2) 5` CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3`;
3) 5`-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-3`;
длина ампликона 84 пары нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA C 3`;
5) 5` TGT TAC GGC CTA AAT GCT GAA CT 3`;
6) 5`-FAM-TGA ACA CCC ATC CGA ACA AGT AGG GTC A-TAMRA-3`;
длина ампликона 70 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 4,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |19,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (10 мкМ) | 0,75 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (5 мкМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,60 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,40 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 4,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |19,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (10 мкМ) | 0,75 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (5 мкМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,60 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,40 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.8. Метод количественного определения кукурузы линии NK 603:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех
линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию
NK 603, на границе генома кукурузы и элемента генетической
конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,49%,
0,98%, 1,96%, 4,91%;
- праймеры на ген adhl 1:
1) 5` CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3`;
2) 5` CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3`;
3) 5`-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-3;
длина ампликона 70 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` ATG AAT GAC CTC GAG TAA GCT TGT TAA 3`;
5) 5` AAG AGA TAA CAG GAT CCA CTC AAA CAC T 3`;
6) 5`-FAM-TGG TAC CAC GCG ACA CAC TC-TAMRA-3`;
длина ампликона 108 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 4,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |19,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (10 мкМ) | 0,75 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (5 мкМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,60 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,40 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 4,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |19,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (10 мкМ) | 0,75 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (5 мкМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,60 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,40 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.9. Метод количественного определения кукурузы линии Bt 11:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех
линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию
Bt 11, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,3%,
0,7%, 1,0%, 1,3%, 2,0%;
- праймеры на ген adhl 1:
1) 5` CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC 3`;
2) 5` CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3`;
3) 5`-FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3`;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` GCG GAA CCC CTA TTT GTT TA 3`;
5) 5` TCC AAG AAT CCC TCC ATG AG 3`;
6) 5`-FAM-AAA TAC ATT CAA ATA TGT ATC CGC TCA-TAMRA-3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 6,000 |
|количество ДНК 250 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода | 9,000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (20 мкМ) | 0,375 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (10 мкМ) | 0,500 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP | 0,500 каждого |
|(10 млМ) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP (20 млМ) | 0,500 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 2,500 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (25 млМ) | 4,000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,250 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |25,000 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 6,0000 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода | 7,7500 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (20 мкМ) | 0,9375 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (10 мкМ) | 0,6250 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP | 0,5000 каждого |
|(10 млМ) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP (20 млМ) | 0,5000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 2,5000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,0000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,2500 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |25,0000 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.10. Метод количественного определения кукурузы линии T 25:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех
линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию T
25, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,15%, 0,40%,
0,90%, 2,00%, 3,30%:
- праймеры на ген adhl 1:
1) 5` CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CCT 3`;
2) 5` CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3`;
3) 5`-FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3`;
длина ампликона 136 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` ACA AGC GTG TCG TGC TCC AC 3`;
5) 5` GAC ATG ATA CTC CTT CCA CCG 3`;
6) 5`-FAM-TCA TTG AGT CGT TCC GCC ATT GTC G-TAMRA-3`;
длина ампликона 102 пары нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода | 9,75 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (10 мкМ) | 0,50 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (10 мкМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP | 0,50 каждого |
|(10 млМ) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP (20 млМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 2,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (25 млМ) | 4,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |25,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода | 8,75 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (10 мкМ) | 1,00 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (10 мкМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP | 0,50 каждого |
|(10 млМ) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP (20 млМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 2,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |25,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.11. Метод количественного определения кукурузы линии GA 21:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех
линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию
GA 21, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,49%,
0,98%, 1,3%, 1,71%, 4,26%;
- праймеры на ген adhl 1:
1) 5` CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3`;
2) 5` CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3`;
3) 5`-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-TAMRA-3`;
длина ампликона 70 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` CTT ATC GTT ATG CTA TTT GCA ACT TTA GA 3`;
5) 5` TGG CTC GCG ATC CTC CT 3`;
6) 5`-FAM-CAT ATA CTA ACT CAT ATC TCT TTC TCA ACA GCA GGT GGG
T-TAMRA-3`;
длина ампликона 112 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,00 |
|количество ДНК 300 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 5,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор | 5,00 ммоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 |150,00 нмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP |400,00 мкмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200,00 мкмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 | 50,00 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |довести до 50,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,00 |
|количество ДНК 300 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 5,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор | 5,00 ммоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 |150,00 нмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP |400,00 мкмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200,00 мкмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 | 50,00 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |довести до 50,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.12. Метод количественного определения кукурузы линии MIR 604:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех
линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию
MIR 604, на границе генома кукурузы и элемента генетической
конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM и VIC;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава и свойств генетически модифицированной кукурузы: менее
0,09%, 0,1%, 0,98%, 9,85%;
- праймеры на ген adhl 1:
1) 5` CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC 3`;
2) 5` CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3`;
3) 5`-VIC-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3`;
длина ампликона 136 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` GCG CAC GCA ATT CAA CAG 3`;
5) 5` GGT CAT AAC GTG ACT CCC TTA ATT CT 3`;
6) 5`-FAM-AGG CGG GAA ACG ACA ATC TGA TCA TG-TAMRA-3`;
длина ампликона 76 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |5,00 |
|количество ДНК 250 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) |0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |5,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор |5,00 ммоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 |300 нмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP |400 мкмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200 мкмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 |200 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |довести до 25,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |5,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) |0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |5,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор |5,00 ммоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 4 |600 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 5 |300 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP |400 мкмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200 мкмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 |200 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |довести до 25,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
---------------------------------------------------------------------------
8.13. Метод количественного определения риса линии LL 62:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез фосфолипазы Д (PLD), присущей для всех линий риса и
области ДНК, специфичной трансформационному событию LL 62, на границе
генома риса и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAМ;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированного риса: менее 0,09%,
0,45%, 0,9%, 1,8%, 3,6%;
- праймеры на ген PLD;
1) 5` TGG TGA GCG TTT TGC AGT CT 3`;
2) 5` CTG ATC CAC TAG CAG GAG GTC C 3`;
3) 5`-FAM-TGT TGT GCT GCC AAT GTG GCC TG-TAMRA-3`;
длина ампликона 64 пары нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG G 3`;
5) 5` TGC TAA CGG GTG CAT CGT CTA 3`;
6) 5`-FAM-CGC ACC GAT TAT TTA TAC TTT TAG TCC ACC-TAMRA-3`;
длина ампликона 88 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК риса:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |5,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) |0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |5,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор |5 ммоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (10 мкМ) |200 нмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP |400 мкмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200 мкмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (10 мкМ) |200 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |довести до 25,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |5,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) |0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |5,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор |5 ммоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (10 мкМ) |400 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP |400 мкмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200 мкмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (10 мкМ) |200 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |довести до 25,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.14. Метод количественного определения сахарной свеклы линии
H7-1:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез глютамин синтетазы (GS), присущей для всех линий
сахарной свеклы и области ДНК, специфичной трансформационному событию
H7-1, на границе генома сахарной свеклы и элемента генетической
конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной сахарной свеклы: менее
0,1%, 0,5%, 0,9%, 2,0%, 5,0%;
- праймеры на ген GS:
1) 5` GAC CTC CAT ATT ACT GAA AGG AAG 3`;
2) 5` GAG TAA TTG CTC CAT CCT GTT CA 3`;
3) 5`-FAM-CTA CGA AGT TTA AAG TAT GTG CCG CTC-TAMRA-3`;
длина ампликона 121 пара нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` TGG GAT CTG GGT GGC TCT AAC T 3`;
5) 5` AAT GCT GCT AAA TCC TGA G 3`;
6) 5`-FAM-AAG GCG GGA AAC GAC AAT CT-TAMRA-3`;
длина ампликона 110 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК сахарной свеклы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,0000 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода | 9,2000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (100 мкМ) | 0,0375 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (100 мкМ) | 0,0250 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP (20 млМ) | 0,5000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP | 0,5000 каждого |
|(10 млМ) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 2,5000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (25 млМ) | 5,0000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,2000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Краситель ROX (25 мкМ) | 1,0000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |25,0000 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,0000 |
|количество ДНК 125 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода | 7,0750 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (100 мкМ) | 0,1000 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (100 мкМ) | 0,0250 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP (20 млМ) | 0,5000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP | 0,5000 каждого |
|(10 млМ) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 2,5000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (25 млМ) | 7,0000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,2000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Краситель ROX (25 мкМ) | 1,0000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |25,0000 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
|
Фрагмент документа "О НАДЗОРЕ ЗА ОБОРОТОМ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГМО".