Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".
4.2.2. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда,
реактивы и питательные среды, используемые для
определения патогенных свойств ГММ, штамма-реципиента
и контрольного штамма вида, к которому относится ГММ
4.2.2.1. Аппаратура и инструментарий
НД (ГОСТ, ТУ)
Анализатор потенциометрический,
погрешность измерений РН +/- 0,01 ГОСТ 19881-74
Шкаф сушильный стерилизационный
ШСС-80П или других марок, позволяющий
поддерживать температуру (160 +/- 5) град. С ТУ 64-1-28-70-76
Термостат, позволяющий поддерживать
рабочую температуру 28 - 37 град. С
с отклонением от заданной +/- 1 град. С ТУ 64-1-1382-72
Баня водяная с подогревом ГОСТ 12026-76
Весы лабораторные общего назначения,
2 и 4 класса точности, с наибольшим
пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104-88
Стерилизаторы паровые медицинские
или аналогичные ГОСТ 19569-89Е
Дистиллятор, обеспечивающий качество
дистиллированной воды ГОСТ 6709-72
Холодильник бытовой электрический
Микроцентрифуга типа "Эппендорф"
Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89
Ножницы медицинские ГОСТ 21239-89
Скальпель хирургический, 15 см ГОСТ 21240-89
Штативы для пробирок
4.2.2.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76
Бутыли стеклянные для химических реактивов
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Колбы плоскодонные конические или круглые
разной вместимости ГОСТ 1770-74
Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81
Полистироловые планшеты U-образные
Пробирки типов П1, П2 ГОСТ 25336-82
Ступка фарфоровая с пестиком ГОСТ 9147-80
Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932-90
Микробиологические петли
Фломастеры-маркеры
4.2.2.3. Реактивы и питательные среды
НД (ФС, ТУ)
Агар микробиологический ГОСТ 17206-84
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
D-глюкоза, ч ГОСТ 6038-79
D-манноза, хч ТУ 6-09-22-98-79
Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, ч ГОСТ 4198-75
Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный, хч ГОСТ 2493-75
Кислота соляная, хч ГОСТ 3118-77
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4328-77
Спирт этиловый ректификованный
технический ГОСТ 18300-87
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962-67
Экстракт дрожжевой
Триптон
Селективные питательные среды для
конкретного ГММ, штамма-реципиента
и контрольного штамма: мезофильных
аэробных и факультативно-анаэробных
микроорганизмов ТУ 9229-083-00419785-97
для определения энтеробактерий ТУ 9229-072-00419785-97
для определения дрожжей и микроскопических ТУ 9229-083-00419785-97
грибов (агар Сабуро, сывороточный и др.) ГОСТ 10444.12-88
для определения S. aureus
(типа Байд-Паркера, солевой агар) ГОСТ 10444.1, п. 5.1,
п. 5.4
для выращивания бифидобактерий,
молочнокислых и пропионово-кислых бактерий
(ГМС, M17, MRS) ТУ 10-02-02-789-192-95
Дезинфицирующий раствор
Микробиологические петли
стандарт мутности по McFarland
5% взвесь эритроцитов человека, барана,
кролика, морской свинки
Питательные среды и биологические препараты импортного
производства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.
Питательные среды и препараты отечественного производства должны
соответствовать нормативной документации, утвержденной в установленном
порядке.
4.2.2.4. Проведение анализа
Взвесь эритроцитов человека, барана или другого вида
млекопитающего добавляют к охлажденной до 50 - 55 град. С плотной
питательной среде с таким расчетом, чтобы взвесь эритроцитов
составляла в агаре 5%. Смесь аккуратно перемешивают и разливают в
чашки Петри. После застывания агара и подсушивания чашек на
поверхность 5%-ного кровяного агара высевают в разведениях культуру
ГММ или штамма-реципиента для формирования отдельных колоний. После
посева чашки инкубируют в зависимости от вида микроорганизма в течение
24 - 48 часов при оптимальной для него температуре развития. Затем
чашки Петри вынимают из термостата и осуществляют учет результатов.
При продукции ГММ и штаммом-реципиентом гемолизина вокруг колоний
формируются зоны гемолиза и тем большие, чем больше гемолизина
продуцируют ГММ и штамм-реципиент.
При выявлении феномена продукции гемолизина ГММ и
штаммом-реципиентом с колонии петлей осуществляют взятие материала,
который высевают в пробирку с 3 мл обогащенной жидкой питательной
среды (например, содержащую триптон, дрожжевой экстракт,
аминокислоты). Пробирки инкубируют в течение 24 - 48 часов при
оптимальной для ГММ температуре, после чего выращенные бактериальные
клетки центрифугируют в центрифуге при 6000 об./мин. в течение 15
минут. Супернатант аккуратно отбирают наконечником микропипетки и
переносят в чистую пробирку. Затем готовят 1%-ную взвесь эритроцитов
барана или человека и разливают в пробирки по 1 куб. см (макрометод)
или в U-лунки планшет по 0,1 куб. см (микрометод). Добавляют равный
объем супернатанта исследуемого ГММ и штаммареципиента. Инкубируют в
течение 1 часа при 35 - 37 град. С и производят предварительный учет
результатов. Окончательный учет результатов осуществляют через 18 - 24
часа инкубации смеси эритроцитов и супернатанта при температуре 18 -
20 град. С.
При положительном результате наблюдается гемолиз эритроцитов,
представляющий визуально окрашенный прозрачный бульон. Последняя
пробирка или лунка, в которой наблюдается гемолиз, отражает титр
(количество) гемолизина, продуцируемого ГММ или штаммом-реципиентом.
При отрицательном результате на дне пробирки или лунки формируется
"пуговка" эритроцитов без изменения цвета бульона. Контроли:
отрицательный - вместо супернатанта добавляется равный объем
стерильного бульона, в котором проводилось выращивание культур;
положительный - штамм гемолизпродуцирующей кишечной палочки,
выращиваемый в тех же условиях, что и ГММ и штамм-реципиент.
|
Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".