Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".
4.2.2. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды, используемые для определения патогенных свойств ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма вида, к которому относится ГММ 4.2.2.1. Аппаратура и инструментарий НД (ГОСТ, ТУ) Анализатор потенциометрический, погрешность измерений РН +/- 0,01 ГОСТ 19881-74 Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) град. С ТУ 64-1-28-70-76 Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 28 - 37 град. С с отклонением от заданной +/- 1 град. С ТУ 64-1-1382-72 Баня водяная с подогревом ГОСТ 12026-76 Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104-88 Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные ГОСТ 19569-89Е Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды ГОСТ 6709-72 Холодильник бытовой электрический Микроцентрифуга типа "Эппендорф" Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89 Ножницы медицинские ГОСТ 21239-89 Скальпель хирургический, 15 см ГОСТ 21240-89 Штативы для пробирок 4.2.2.2. Лабораторная посуда и материалы Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76 Бутыли стеклянные для химических реактивов Марля медицинская ГОСТ 9412-77 Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости ГОСТ 1770-74 Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82 Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81 Полистироловые планшеты U-образные Пробирки типов П1, П2 ГОСТ 25336-82 Ступка фарфоровая с пестиком ГОСТ 9147-80 Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932-90 Микробиологические петли Фломастеры-маркеры 4.2.2.3. Реактивы и питательные среды НД (ФС, ТУ) Агар микробиологический ГОСТ 17206-84 Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72 D-глюкоза, ч ГОСТ 6038-79 D-манноза, хч ТУ 6-09-22-98-79 Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, ч ГОСТ 4198-75 Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный, хч ГОСТ 2493-75 Кислота соляная, хч ГОСТ 3118-77 Натрий хлористый, хч ГОСТ 4328-77 Спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962-67 Экстракт дрожжевой Триптон Селективные питательные среды для конкретного ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма: мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов ТУ 9229-083-00419785-97 для определения энтеробактерий ТУ 9229-072-00419785-97 для определения дрожжей и микроскопических ТУ 9229-083-00419785-97 грибов (агар Сабуро, сывороточный и др.) ГОСТ 10444.12-88 для определения S. aureus (типа Байд-Паркера, солевой агар) ГОСТ 10444.1, п. 5.1, п. 5.4 для выращивания бифидобактерий, молочнокислых и пропионово-кислых бактерий (ГМС, M17, MRS) ТУ 10-02-02-789-192-95 Дезинфицирующий раствор Микробиологические петли стандарт мутности по McFarland 5% взвесь эритроцитов человека, барана, кролика, морской свинки Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, утвержденной в установленном порядке. 4.2.2.4. Проведение анализа Взвесь эритроцитов человека, барана или другого вида млекопитающего добавляют к охлажденной до 50 - 55 град. С плотной питательной среде с таким расчетом, чтобы взвесь эритроцитов составляла в агаре 5%. Смесь аккуратно перемешивают и разливают в чашки Петри. После застывания агара и подсушивания чашек на поверхность 5%-ного кровяного агара высевают в разведениях культуру ГММ или штамма-реципиента для формирования отдельных колоний. После посева чашки инкубируют в зависимости от вида микроорганизма в течение 24 - 48 часов при оптимальной для него температуре развития. Затем чашки Петри вынимают из термостата и осуществляют учет результатов. При продукции ГММ и штаммом-реципиентом гемолизина вокруг колоний формируются зоны гемолиза и тем большие, чем больше гемолизина продуцируют ГММ и штамм-реципиент. При выявлении феномена продукции гемолизина ГММ и штаммом-реципиентом с колонии петлей осуществляют взятие материала, который высевают в пробирку с 3 мл обогащенной жидкой питательной среды (например, содержащую триптон, дрожжевой экстракт, аминокислоты). Пробирки инкубируют в течение 24 - 48 часов при оптимальной для ГММ температуре, после чего выращенные бактериальные клетки центрифугируют в центрифуге при 6000 об./мин. в течение 15 минут. Супернатант аккуратно отбирают наконечником микропипетки и переносят в чистую пробирку. Затем готовят 1%-ную взвесь эритроцитов барана или человека и разливают в пробирки по 1 куб. см (макрометод) или в U-лунки планшет по 0,1 куб. см (микрометод). Добавляют равный объем супернатанта исследуемого ГММ и штаммареципиента. Инкубируют в течение 1 часа при 35 - 37 град. С и производят предварительный учет результатов. Окончательный учет результатов осуществляют через 18 - 24 часа инкубации смеси эритроцитов и супернатанта при температуре 18 - 20 град. С. При положительном результате наблюдается гемолиз эритроцитов, представляющий визуально окрашенный прозрачный бульон. Последняя пробирка или лунка, в которой наблюдается гемолиз, отражает титр (количество) гемолизина, продуцируемого ГММ или штаммом-реципиентом. При отрицательном результате на дне пробирки или лунки формируется "пуговка" эритроцитов без изменения цвета бульона. Контроли: отрицательный - вместо супернатанта добавляется равный объем стерильного бульона, в котором проводилось выращивание культур; положительный - штамм гемолизпродуцирующей кишечной палочки, выращиваемый в тех же условиях, что и ГММ и штамм-реципиент. |
Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".