Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".
5.1.1. Метод идентификации целевых генов,
неэкспрессируемых последовательностей и селективных
маркеров, а также подтверждение видовой
принадлежности штамма при помощи ПЦР
5.1.1.1. Создание электронной базы данных
Для полной и надежной идентификации конкретного ГММ необходимо
создать электронную базу данных о целевых, селективных и маркерных
генах, мигрирующих элементах, неэкспрессируемых последовательностях и
регуляторных элементах, а также векторных конструкциях класса
food-grade, которые используются при создании ГММ. В такую базу данных
должна быть включена информация о видоспецифических генах, которые
могут быть использованы для подтверждения таксономической
принадлежности штамма. Также в базу данных должны быть включены
сведения о наличии в коллекциях штаммов ГММ, принадлежащих к 1, 2 и 3
классу безопасности, в различных странах.
Особое внимание при создании электронной базы данных следует
уделить информации о так называемых GRAS (generally recognized as
safe) микроорганизмах, которые чаще всего используются как доноры
генетической информации при конструировании ГММ.
5.1.1.2. Выбор праймеров
Для проведения экспертизы ГММ выбор праймеров должен проводиться
по следующим позициям:
1) для идентификации таксономической принадлежности
микроорганизма (гены 16S/23S рРНК или другие специфические
последовательности);
2) для идентификации целевых генов генетической вставки (гены,
кодирующие продукцию технологически важных ферментов, например таких,
как химозин; гены устойчивости к бактериофагам; гены - регуляторы
уровня кислотности; гены устойчивости к этанолу и другим стрессовым
факторам);
3) для идентификации генов селективных маркеров (гены
устойчивости к антибиотикам, бактериоцинам, ауксотрофным селективным
маркерам);
4) для идентификации маркерных (screenable) векторных генов (гены
Е. coli, кодирующие бета-галактозидазу или бета-глюкоронидазу, или
гены бактериофага Т7, кодирующие РНК полимеразу);
5) для идентификации неэкспрессируемых последовательностей
(полилинкеры, промоторы и терминаторы);
6) для идентификации мигрирующих элементов, используемых для
создания транспозируемых векторов (например, Ту-элементы).
Выбор праймеров должен осуществляться в соответствии с правилами
молекулярного дизайна. Для выбора праймеров должны быть использованы
программы Primer, Oligo или другие аналогичные программы, позволяющие
осуществлять многофакторный анализ выбранных последовательностей.
Должен быть произведен сравнительный анализ выбранных олигонуклеотидов
с помощью программы Blast для исключения наличия областей гомологии с
ДНК родственных и неродственных видов.
Конкретный набор тех или иных праймеров для проведения экспертизы
должен определяться таксономической принадлежностью штамма;
информацией о его генетическом статусе и характере генетических
модификаций, предоставленной заявителем; а также характера и места
использования ГММ в технологии получения пищевых продуктов и
вероятности попадания живых ГММ в организм человека (см. п. 3.4
настоящих МУ). Выбор, синтез и очистка праймеров производится в Центре
по микробиологической и молекулярно-биологической экспертизе ГММ при
ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
5.1.1.3. Выбор условий проведения ПЦР
Условия проведения реакции определяют степень точности и
воспроизводимости результатов, и их отработка должна производиться для
каждой конкретной пары праймеров. Выбор условий проведения ПЦР
включает подбор оптимального соотношения компонентов реакционной
смеси, структуры программы амплификации (временных и температурных
характеристик каждого этапа амплификации) и адекватного метода
детекции результатов. Выбор оптимальных условий проведения ПЦР
обеспечивает высокий уровень чувствительности и специфичности
прохождения реакции, исключающий наличие перекрестных реакций с
неспецифическими ДНК. Выбор оптимальных условий проведения ПЦР
осуществляется сотрудниками Центра по микробиологической и
молекулярно-биологической экспертизе ГММ при ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи
РАМН.
5.1.1.4. Выделение ДНК из культур ГММ и проведение ПЦР
5.1.1.4.1. Аппаратура и инструментарий
НД (ГОСТ, ТУ)
Программируемый термостат (ДНК-амплификатор)
типа "Терцик МС2" или аналоги
Термостат, поддерживающий температуру 45 град. С,
для пробирок объемом 1,5 мл
Центрифуга со скоростью вращения ротора
8000 - 12000 об./мин. для пробирок
вместимостью 1,5 и 0,5 мл типа "Эппендорф"
Прибор для горизонтального электрофореза
Встряхиватель вибрационный (типа "Вортекс")
Водяная баня с подогревом ГОСТ 12026-76
Ультрафиолетовый трансиллюминатор
Холодильная камера на -20 град. С
Пипетки полуавтоматические одноканальные
со сменяемыми наконечниками на 1 - 10,
5 - 40, 40 - 200, 200 - 1000 мкл типа
"Ленпипет"
5.1.1.4.2. Лабораторная посуда и материалы
Пробирки типа "Эппедорф" вместимостью
1,5 мл, совместимые с центрифугой
Пробирки типа "Эппедорф" вместимостью
0,5 мл, совместимые с амплификатором
Наконечники пластиковые на 1 - 200 мкл к
пипеткам полуавтоматическим
Наконечники пластиковые на 200 - 1000 мкл к
пипеткам полуавтоматическим
Перчатки резиновые ГОСТ 3-88
Колбы плоскодонные конические разной
вместимости ГОСТ 1770-74
Штативы для пробирок
5.1.1.4.3. Реактивы
Допускаются к использованию реактивы производства различных
отечественных и зарубежных фирм, прошедшие государственную регистрацию
и разрешенные для использования в установленном порядке.
Трис аминометан
ЭДТА
Хлористый натрий
Бычий сывороточный альбумин
Ацетат калия
Едкий натр
бета-меркаптоэтанол
Водный раствор дезоксинуклетидтрифосфатов
(0,1 М)
Термостабильная ДНК-полимераза
AMV-ревертаза (обратная траснскриптаза)
Бромфеноловый синий
Агароза для электрофореза
Бромистый этидий
Ледяная уксусная кислота
Вода деионизованная ГОСТ 6709-72
Масло вазелиновое ГОСТ 3164-78
5.1.1.4.4. Приготовление основных растворов
1 М Трис рН-7,5. Растворить 121,1 г Трис в 800 мл воды. Довести
рН до необходимого значения добавлением концентрированной HCl и
довести объем до 1 л. Раствор простерилизовать.
0,5 М ЭДТА рН-8,0. К 186,1 г ЭДТА добавить 800 мл воды. Довести
рН до 8,0 NaOH.
5 M NaCl (хч или чда). 29,22 г NaCl растворить в 80 мл воды,
довести объем до 100 мл, простерилизовать.
10%-ный SDS. 10 г SDS растворить в 90 мл воды, чтобы ускорить
растворение можно нагреть раствор до 60 град. С. Довести рН до 7,2
добавлением нескольких капель концентрированной НСl и довести до 100
мл. Внимание! При взвешивании SDS наденьте на лицо маску, т.к. при
попадании на слизистую оболочку носоглотки этот летучий порошок
вызывает сильное раздражение.
5 М Ацетат калия. 49,1 г ацетата калия растворить в 80 мл воды и
довести объем до 100 мл.
70%-ный этанол. Для приготовления 100 мл раствора требуется 73 мл
96% этанола и 27 мл воды.
5.1.1.4.5. Выделение ДНК из штамма ГММ
Для выделения ДНК из штамма ГММ может применяться
фенол-хлороформный или другой адекватный метод. Однако наиболее
надежные результаты в ПЦР дает ДНК, выделенная непосредственно перед
постановкой реакции из замороженной бактериальной пасты по методу
Бирнобойма и Доли:
20 - 40 мкл оттаявшей бактериальной массы суспендируют в 100 мкл
буфера I (50 mМ Трис-HCl, рН 8,0, 5 mМ ЭДТА, 50 мкг/мл РНКазы). К
суспензии добавляют 120 мкл лизирующего буфера (0,2 М NaOH, 1% SDS) и
ожидают лизиса бактерий, видимого по возрастанию вязкости суспензии.
После этого комплекс бактериальных белков и обломков клеточной стенки
осаждают добавлением 100 мкл 2,55 М ацетата калия при энергичном
встряхивании на вортексе в течение 5 мин. Затем смесь центрифугируют в
течение 5 - 10 мин. Надосадочную жидкость переносят в пробирку объемом
1,5 мл, содержащую 0,75 мл смолы марки Wizzard. Смесь тщательно
перемешивают и фильтруют через мини-колонку; промывают осадок смолы в
миниколонке 2 мл 80% изопропанола и центрифугируют 1 мин. при 12000g
для удаления остатков жидкости. Мини-колонку помещают в стерильную
пробирку объемом 1,5 мл, наносят в миниколонку 50 мкл стерильной
бидистиллированной или деионизованной воды и прогревают пробирку с
колонкой 5 мин. при плюс 70 град. С. Затем мини-колонку в пробирке
помещают в центрифугу и центрифугируют 1 мин. при максимальной
скорости для переноса раствора ДНК в пробирку. Описанным способом
получают порядка 5 мкг ДНК размером от 3 до 15 т.п.н. Полученные
препараты ДНК сохраняются при минус 70 град. С и используются для
анализа методом ПЦР. При условии использования стерильных растворов и
посуды получаемая ДНК может храниться при плюс 4 град. С в течение
полугода. Срок хранения препаратов ДНК при минус 20 град. С превышает
2 года.
5.1.1.4.6. Проведение ПЦР
ПЦР осуществляют с помощью ДНК-амплификаторов (термоциклеров).
Для проведения ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза,
соответствующий ей десятикратный ПЦР-буфер, растворы четырех
дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и выбранной пары праймеров. В типичных
экспериментах реакционную смесь объемом 50 мкл составляют так, чтобы
она содержала 350 нг геномной ДНК, 1,5 мМ каждого из четырех
дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, 1 ед. Taq-полимеразы. Затем к
реакционной смеси добавляют 30 пкМ пары олигонуклеотидных праймеров в
буферном растворе следующего состава: 67 мМ Трис-HCl буфер (рН 8,0 при
25 град. С), содержащий 16,6 мМ сульфат аммония, 15 мМ MgCl2, 10 мМ
2-меркаптоэтанол, 6,7 мкМ ЭДТА и бычий сывороточный альбумин в
концентрации 170 мкг/мл. Далее на каждую пробу наслаивают по 50 мкл
минерального масла и реакцию проводят по специально подобранным
программам в многоканальном амплификаторе ДНК.
При необходимости возможно проведение мультиплексной ПЦР для
анализа нескольких важных фрагментов вставки, а также второго раунда
ПЦР с внутренней парой праймеров (nested PCR) для повышения
специфичности реакции.
Продукты амплификации анализируют с помощью электрофореза в
пластине 6%-ного полиакриламидного геля (2,5 ч при 200 В).
ДНК-маркерами служит стандартный набор фрагментов ДНК плазмиды pBR322,
полученный под действием рестриктазы Alu 1. Окрашивание фрагментов ДНК
осуществляется этидиум бромидом. Анализ результатов и фотографирование
электрофореграммы осуществляют в условиях ультрафиолетовой подсветки
на трансиллюминаторе. Допустимо анализ продуктов ПЦР производить путем
электрофореза в 2% агарозном геле с последующей видео- или
фотодетекцией полученной на трансиллюминаторе картины. Фотоотпечатки
или оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее
600 точек на дюйм, должны быть приложены к протоколу проведения
испытаний.
|
Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".