Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".
5.1.2. Дополнительные методы идентификации
генетического материала ГММ
Дополнительными и уточняющими методами идентификации генетической
информации в штаммах ГММ являются рестрикционный анализ
амплифицированных фрагментов ДНК, а также метод определения их
нуклеотидной последовательности (секвенирование).
5.1.2.1. Аппаратура и инструментарий
Допускаются к использованию аппаратура и инструментарий
производства различных отечественных и зарубежных фирм, прошедшие
государственную регистрацию и разрешенные для использования в
установленном порядке.
1. Спектрофотометр.
2. Весы аналитические.
3. Планшетный ридер (rider).
4. Планшетный вошер (wosher).
5. Прибор для проведения электрофореза.
6. Прибор для проведения иммуноблоттинга.
7. Источник тока.
8. Термостатируемый шейкер.
9. Центрифуга настольная типа "Эппендорф".
10. Холодильник бытовой.
11. Компьютер, монитор, сканер, принтер.
12. Пипетки многоканальные и одноканальные с переменным объемом.
5.1.2.2. Методы оценки экспрессии целевого гена
Оценка экспрессии встроенного целевого гена осуществляется на
двух уровнях.
Первый уровень - транскрипционный. В этом случае определяется
наличие в клетке ГММ и РНК, синтезируемой под контролем целевого гена.
Второй уровень - трансляционный.
В этом случае определяется наличие белкового продукта
определенной молекулярной массы и/или определенной
иммуноспецифичности.
5.1.2.3. Определение иРНК, транскрибируемых с целевого гена
методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)
1 мкг РНК, выделенной из клеток культуры ГММ, предварительно
обработанной ДНКазой, отжигали с 10 пмоль одноцепочечного
олигонуклеотида: 20 мин. - 65 град. С и 10 мин. при комнатной
температуре. Затем проводили реакцию обратной транскрипции в общем
объеме 20 мкл. Состав реакционной смеси: 1 мкг РНК с отожженным
праймером, 50 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 50 мМ КСl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ ДТТ;
1 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата; 0,5 мМ спермидина; 1 Ед
AMV ревертазы. Реакцию проводили 30 мин. при 42 град. С. Далее эту
смесь анализировали с помощью полимеразной цепной реакции (методика
проведения ПЦР описана в разделе 5.1.1).
5.1.2.4. Определение белка, экспрессируемого целевым геном ГММ,
методом электрофоретического разделения в ПААГ-ДСН
Цель метода - сравнительный анализ белкового состава и
определение молекулярной массы полипептида, экспрессируемого целевым
геном.
Для проведения анализа используют следующие оборудование и
реактивы.
А. Электрофоретическая камера и источник питания (типа "Биорад"
или аналоги).
Б. Реактивы (производства фирм, прошедших государственную
регистрацию и разрешенных к использованию в установленном порядке):
1) раствор 40/0,8 (40% акриламида, 0,8% бис-акриламида);
2) раствор 20/0,3 (20% акриламида, 0,3% бис-акриламида);
3) буфер разделяющего геля (БРГ), рН 8,8;
4) буфер фокусирующего геля (БФГ), рН 6,8;
5) электродный буфер, рН 8,3;
6) буфер образца;
7) раствор ДСН (додецилсульфат натрия) 10%;
8) раствор персульфата аммония 10%;
9) раствор для окраски гелей ERZ Blue;
10) маркеры молекулярного веса.
Проведение электрофореза
I. Приготовление гелевой пластинки:
- вымыть части прибора в детергенте;
- промыть дистиллированной водой;
- смонтировать установку для заливки гелей;
- внести разделяющий гель, полимеризация 30 мин.;
- наслоить фокусирующий гель и вставить гребенку, полимеризация
10 мин.
После полимеризации (10 мин.) одномоментно удалить гребенку.
Гель можно хранить в полиэтилене, целлофане при температуре 4
град. С; использовать в течение 4 дней.
II. Пробоподготовка
К образцу, содержащему ~ 1 мг/мл белка (по поглощению при 280
нм), добавить буфер образца, прогреть при 100 град. С 5 минут.
III. Электрофорез:
- поместить гелевую пластину в камеру;
- заполнить камеры буфером;
- нанести образцы микрошприцем;
- включить источник питания;
- условия: сила тока - 20 мА на пластину;
- образцы концентрируются на анодном конце, затем разделяются по
молекулярной массе на основе эффекта молекулярного сита.
IV. Окраска геля
По окончании электрофореза гель вынуть из кассеты, поместить в
камеру для окраски. Окраска согласно протоколу, прилагаемому к
реагенту ERZ Blue.
V. Хранение
Для консервации применяют высушивание геля между целлофановыми
пленками.
Для сохранения данного изображения гель фотографируют в видимом
спектре или сканируют.
5.1.2.5. Определение специфичности белка, экспрессируемого
целевым геном ГММ, методом иммуноблоттинга
Цель метода - идентификация экспрессируемого полипептида с
помощью специфических моноклональных антител. Метод позволяет
определять идентичность синтезируемого белка продукту целевого гена,
указанного заявителем.
Для проведения анализа используют следующие оборудование и
реактивы.
А. Электрофоретическая камера, камера для переноса и источник
питания (типа "Биорад" или аналоги).
Б. Реактивы (производства фирм, прошедших государственную
регистрацию и разрешенных к использованию в установленном порядке).
Проведение иммуноблоттинга
I. Перенос белков
После электрофоретического разделения образца в ПААГ-ДСН
осуществляют перенос белков из пластин геля на нитроцеллюлозную
мембрану методом электропереноса в "полусухой" буферной системе.
Для этого на нижний угольный электрод (анод) ячейки для переноса
помещают 6 листов ватмана (N 3), пропитанного раствором "С" (0,03 М
Трис, 20% изопропилового спирта, рН 10,0). Следующим слоем помещают
PVDF-мембрану, затем накладывают пластину полиакриламидного геля с
разделенными белками и 6 листов бумаги, пропитанной раствором "А"
(0,025 М Трис, 0,04 М эпсилон-аминокапроновой кислоты, 20%
изопропилового спирта, 0,01% додецилсульфата лития, рН 9,4),
накладывают верхний электрод (катод) и плотно прижимают.
При сборке системы следят, чтобы между слоями не было пузырьков
воздуха. Размер листов фильтровальной бумаги и нитроцеллюлозных
фильтров должен соответствовать размеру геля. Перенос проводят при
постоянном токе 100 мА в течение 1,5 часов при комнатной температуре.
II. Обработка мембраны
Для блокирования несвязавшихся с белками участков нитроцеллюлозы
мембрану после переноса инкубируют в 0,1%-ном растворе Твин-20 в
течение 10 минут при 37 град. С, затем 30 мин. в растворе 3%-ного
казеина или сухого молока.
Последующие стадии обработки фильтров включают:
- инкубацию с моноклональными антителами;
- с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом;
- окрашивание мембраны.
Условия инкубации на каждой стадии: 1 час на шейкере при 37 град.
С. После окончания каждой стадии инкубации фильтр трижды отмывают
проточной водой и трижды 0,1%-ным раствором Твин-20 в течение 10 мин.
Проявление зон осуществляют субстратным раствором пероксидазы
(бета-хлорнафтол, диаминобензидин). Реакцию окрашивания останавливают
промыванием мембраны в воде.
После высушивания окрашенные реплики сканируют.
5.1.2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
Нуклеотидную последовательность ДНК определяют по методу Sanger.
Реакцию проводят по протоколу фирмы "Promega" в 3 стадии:
1. Радиомаркирование (кинирование) праймера
Реакция кинирования праймера проходит в объеме 10 мкл в следующих
условиях: 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5; 10 мМ MgCl2; 5 мМ DTT; 0,1 мМ
32
спермидина; 10 pmol праймера; 10 pM [гамма P]dATP; 5 ед.
Т4-полинуклеотидкиназы. Инкубировать 30 минут на 37 град. С, затем
активность фермента T4-Kinase останавливают повышением температуры до
90 град. С в течение 2 минут.
2. Синтез меченых цепей методом ПЦР
Кинированный праймер используется для синтеза методом ПЦР меченых
32
Р цепей ДНК разной длины, терминированных случайным включением ddNTP.
Реакция проводится в 17,5 мкл в условиях: 50 мМ Tris-HCl, рН 9,0; 10
мМ MgCl2; 1,5 pmol кинированного праймера; 40 fmol матричной ДНК; 5
ед. Taq-полимеразы. В заранее подготовленные 4 пробирки, содержащие
ddNTP, 50 мМ NaCl, раскапывают по 4 мкл реакционной смеси, сверху
наслаивают вазелиновое масло и проводят амплификацию. Реакция проходит
в следующих условиях: плавление цепей - 95 град. С - 0,5 мин.; отжиг
затравок - 42 град. С - 0,5 мин.; элонгация цепей ДНК - 70 град. С - 1
минута. Продолжительность амплификации составляет 30 циклов.
Останавливают реакцию добавлением 4 мкл буфера для нанесения (95%
формамид, 20 мМ ЭДТА; 0,05% бромфенолового синего и 0,05%
ксиленцианола FF).
3. Электрофорез
Полученные образцы прогревают 2 минуты при 70 град. С и наносят
на 6% полиакриламидный денатурирующий гель. В каждый слой геля наносят
по 3 мкл соответствующего образца. Электрофорез проводят при
постоянном напряжении (25 - 30 V/cm) при температуре 55 град. С. По
окончании электрофореза проводят фиксирование геля в 10%-ной уксусной
кислоте, затем гель сушат 30 минут на стекле при температуре 60 град.
С. Экспонирование с рентгеновской пленкой "Кодак" проводят в течение
15 - 48 часов при комнатной температуре.
5.1.2.7. Рестрикционный анализ ампликонов
Рестрикционный анализ проводят с помощью гидролиза ДНК
специфическими эндодезоксирибонуклеазами (рестриктазами) с последующим
фракционированием в агарозном геле. Выбор рестриктаз определяется
наличием специфических сайтов рестрикции в синтезированных ампликонах.
1. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами
Для гидролиза ДНК рестриктазами используют буферные смеси с
низкой, средней и высокой ионной силой, согласно рекомендациям фирм -
производителей этих ферментов. Время инкубации составляет от 1 до 4
часов при 37 град. С.
2. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в
агарозном геле
Разделение фрагментов ДНК проводят методом электрофореза в
горизонтальных агарозных гелях с концентрацией агарозы от 0,8 до 3%.
Электрофорез проводят при комнатной температуре в трис-ацетатном
буфере (0,04 М трис-ацетат, рН 8,1, 0,002 М ЭДТА) с содержанием 0,5
мкг/мл бромистого этидия, при напряженности электрического поля 10
В/см, в течение 30 - 60 мин. Гели с разделенными фрагментами
фотографируют в УФ-свете на пленку "Микрат-300" с использованием
оранжевого светофильтра или осуществляют видеодетекцию полученной на
трансиллюминаторе картины. Фотоотпечатки или оттиски, выполненные на
лазерном принтере с разрешением не менее 600 точек на дюйм, должны
быть приложены к протоколу проведения испытаний.
|
Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".