Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".
5.1.3. Методы оценки экспрессии целевого гена
Оценка экспрессии встроенного целевого гена осуществляется на
двух уровнях. Первый уровень - транскрипционный. В этом случае
определяется наличие в клетке ГММ иРНК, синтезируемой под контролем
целевого гена. Второй уровень - трансляционный. В этом случае
определяется наличие белкового продукта определенной молекулярной
массы и/или определенной иммуноспецифичности.
Определение иРНК, транскрибируемых с целевого гена методом
обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)
1 мкг РНК, выделенной из клеток культуры ГММ, предварительно
обработанной ДНКазой, отжигали с 10 пмоль одноцепочечного
олигонуклеотида: 20 мин. - 65 град. С и 10 мин. при комнатной
температуре. Затем проводили реакцию обратной транскрипции в общем
объеме 20 мкл. Состав реакционной смеси: 1 мкг РНК с отожженным
праймером; 50 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 50 мМ КСl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ ДТТ;
1 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата, 0,5 мМ спермидина, 1 Ед
AMV ревертазы. Реакцию проводили 30 мин. при 42 град. С. Далее эту
смесь анализировали с помощью полимеразной цепной реакции (методика
проведения ПЦР описана в разделе 5.1.1).
Электрофорез белка, экспрессируемого целевым геном ГММ, в ПААГ в
присутствии ДСН (PAGE-SDS)
Цель метода - определение молекулярного веса состава белка.
Для проведения анализа используют следующие оборудование и
реактивы.
А. Электрофоретическая камера и источник питания.
Б. Реактивы:
1) раствор 40/0,8 (40% акриламида, 0,8% бис-акриламида);
2) раствор 20/0,3 (20% акриламида, 0,3% бис-акриламида);
3) буфер разделяющего геля (БРГ), рН 8,8 доводить
концентрированной HCl (1,8 мл);
4) буфер фокусирующего геля (БФГ), рН 6,8 доводить
концентрированной HCl (1 мл);
5) электродный буфер, рН 8,3, ДСН (SDS) - 4,0 г;
6) раствор ДСН (SDS) 10%;
7) раствор персульфата аммония 10%;
8) раствор для окраски гелей ERZ Blue.
Проведение электрофореза
I. Приготовление гелевой пластинки:
- вымыть части прибора в детергенте;
- ополоснуть дистиллированной водой;
- смонтировать установку;
- внести разделяющий гель, полимеризация 30 мин.;
- наслоить фокусирующий гель и вставить гребенку.
После полимеризации (10 мин.) одномоментно удалить гребенку.
Гель можно хранить в полиэтилене, целлофане при температуре 4
град. С; использовать в течение 4 дней.
II. Пробоподготовка
К образцу, содержащему ~ 1 мг/мл белка (по поглощению при 280
нм), добавить буфер образца с дитиотрейтолом, инкубировать при 100
град. С 3 минуты.
III. Электрофорез:
- поместить гелевую пластину в камеру;
- заполнить камеры буфером;
- нанести образцы микрошприцем;
- включить источник питания;
- условия: ток - 20 мА на пластину;
- образцы концентрируются на анодном конце, затем разделяются по
молекулярному весу на основе эффекта молекулярного сита.
IV. Окраска
По окончании электрофореза гель вынуть из кассеты, поместить в
камеру для окраски. Окраска согласно протоколу, прилагаемому к
реагенту ERZ Blue.
V. Хранение
Для консервации применяют высушивание геля между целлофановыми
пленками.
Для сохранения данного изображения гель фотографируют в видимом
спектре или сканируют.
Иммуноблоттинг (Western-blotting Immunoassay)
Метод иммуноблоттинга позволяет с помощью специфических
моноклональных антител определять идентичность синтезируемого белка
продукту целевого гена, указанного заявителем.
После электрофоретического разделения в ПААГ-ДСН (PAGE-SDS) белки
переносят из пластин геля на нитроцеллюлозную мембрану методом
электропереноса в "полусухой" буферной системе.
Для этого на нижний угольный электрод (анод) ячейки для переноса
помещают 6 листов фильтровальной бумаги (W N 3), пропитанной раствором
"С" (0,03 М Трис, 20% изопропилового спирта, рН 10,0). Следующим слоем
помещают нитроцеллюлозную мембрану ВА 85, затем накладывают пластину
полиакриламидного геля с разделенными белками и 6 листов бумаги,
пропитанной раствором "А" (0,025 М Трис, 0,04 М
эпсилон-аминокапроновой кислоты, 20% изопропилового спирта, 0,01%
додецилсульфата лития, рН 9,4), накладывают верхний электрод (катод) и
плотно прижимают.
При сборке системы следят, чтобы между слоями не было пузырьков
воздуха. Размер листов фильтровальной бумаги и нитроцеллюлозных
фильтров должен соответствовать размеру геля. Перенос проводят при
постоянном токе 100 мА в течение 1,5 часов при комнатной температуре.
Обработка мембраны.
Для блокирования не связавшихся с белками участков нитроцеллюлозы
мембрану после переноса инкубируют в 0,1% растворе Твин-20 в течение
10 минут при 37 град. С, затем 30 мин. в растворе 3% казеина.
Последующие стадии обработки фильтров включают:
- инкубацию с моноклональными антителами (поликлональными
антителами);
- с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом;
- окрашивание мембраны.
Условия инкубации на каждой стадии: 1 час на шейкере при 37 град.
С. После окончания каждой стадии инкубации фильтр трижды отмывают
проточной водой и трижды 0,1% раствором Твин-20 в течение 10 мин.
Проявление зон осуществляют субстратным раствором пероксидазы
(бета-хлорнафтол, диаминобензидин). Реакцию окрашивания останавливают
промыванием мембраны в воде.
После высушивания окрашенные реплики сканируют.
|
Фрагмент документа "ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04".