Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ".
6.2. Биохимические свойства
Биохимическую активность холерного вибриона изучают, используя
коммерческие среды и тест-наборы (Приложение 5) или среды
лабораторного приготовления, рецептура которых изложена в разделе 7.
Определение индофенолоксидазы.
Реактивы: 1-процентные водные растворы
диметил-пара-фенилендиамина, тетраметил-пара-фенилендиамина
(гидрохлорида), этилоксиэтил-пара-фенилендиамина сернокислого (из
набора для обработки бумаги "фотоцвет") и пара-аминодиметиланилина
(гидрохлорида или оксалата) в сочетании с 1-процентным спиртовым
раствором альфа-нафтола или без него.
Реактивы должны быть бесцветными, их следует хранить во флаконах
из темно-коричневого стекла со стеклянной пробкой без доступа света в
холодильнике. В случае помещения реактива во флаконы из светлого
стекла их следует обернуть алюминиевой фольгой или темной бумагой.
Постановка пробы:
- на поверхность 18-часовой агаровой культуры, подозрительной
колонии или полусливного роста на щелочном агаре наносят 1 каплю
1-процентного водного раствора одного из указанных реактивов.
Положительная реакция на индофенолоксидазу - ярко-красная окраска
культуры через 20 - 30 с.
При использовании двухкомпонентной реакции (в сочетании с
альфа-нафтолом) в положительных случаях - синее окрашивание культуры;
- для постановки пробы на оксидазу можно использовать специальные
бумажки из набора СИБ, MTC-V или пропитать помещенную в чашку Петри
полоску фильтровальной бумаги 2 - 3 каплями 1-процентного водного
раствора одного из реактивов. Культуру наносят на полоску смоченной
реактивом бумаги платиновой петлей (но не хромникелевой), стеклянной
или деревянной палочкой и размазывают в виде небольшого пятнышка.
Через 10 - 30 с появляется пурпурно-красное окрашивание,
свидетельствующее о положительной реакции.
Из грамотрицательных бактерий положительную пробу на
индофенолоксидазу дают вибрионы, аэромонады, псевдомонады,
плезиомонады, а отрицательную - все энтеробактерии.
Не следует ставить пробу на оксидазу с культурами на
полиуглеводных средах, а также с колониями на элективных средах (СЭДХ
и TCBS).
Учитывая возможную нестойкость реактивов и различную способность
вибрионов к образованию оксидазы на различных питательных средах,
пробу обязательно сопровождают положительными и отрицательными
контролями соответственно с культурами вибрионов или псевдомонад и
энтеробактерий, выращенными на используемом в лаборатории питательном
агаре.
Проба тяжа (String test).
На чашку Петри наносят каплю 0,5-процентного водного раствора
дезоксихолата натрия или 2,5-процентного водного раствора моющего
средства "Прогресс" и в ней суспендируют 18-часовую агаровую культуру
исследуемого штамма. При положительной реакции суспензия немедленно
теряет мутность, становится слизистой и вязкой - тянется за петлей,
что характерно для вибрионов.
Проба позволяет дифференцировать вибрионы не только от
энтеробактерий, но и от других родственных грамотрицательных
микроорганизмов, которые не образуют "тяжа". Исключение составляют
лишь некоторые штаммы аэромонад, которые в течение примерно 60 с
образуют слабо тянущуюся нить.
Определение типа расщепления глюкозы (тест Хью - Лейфсона).
В две пробирки со средой Хью - Лейфсона засевают уколом в столбик
изучаемую культуру. Поверхность среды в одной из пробирок покрывают
0,5 - 1 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют от 1 до 4
суток при температуре (37,0 +/- 0,5) ёC. Окисление определяют по
желтой окраске среды только в аэробных, ферментацию - в аэробных и
анаэробных условиях роста. Вибрионы расщепляют глюкозу по
ферментативному типу.
Определение декарбоксилазной активности.
В пробирки со средами, содержащими лизин, орнитин, аргинин и
контрольную среду без аминокислот, засевают по полной петле 18-часовой
культуры и заливают 0,5 - 1 мл стерильного вазелинового масла.
Инкубируют посевы при температуре (37,0 +/- 0,5) ёC. Учет результатов
- ежедневно, при сомнительном результате - наблюдение до 4 суток. В
результате ферментации глюкозы вначале происходит сдвиг рН в кислую
сторону, а в дальнейшем при декарбоксилировании аминокислот
накапливаются амины и происходит защелачивание среды.
Ферментацию углеводов и многоатомных спиртов (глюкоза, лактоза,
манноза, сахароза, арабиноза, маннит, салицин, дульцит, инозит,
крахмал и др.) определяют в жидких или полужидких средах Гисса с
индикатором бромтимоловым синим, Андреде, ВР.
Для посева используют культуру, выращенную в течение 12 - 20 ч на
плотной питательной среде или в течение 3 - 4 ч - в жидкой питательной
среде. Посевы на средах с углеводами и спиртами инкубируют при (37,0
+/- 0,5) ёC и учитывают через 6 - 18 ч.
Для определения диастатической активности кроме среды Гисса с
крахмалом может быть использована и среда Кодама. Культуру засевают в
среду и также инкубируют при (37,0 +/- 0,5) ёC. Через 18 ч в пробирку
со средой Кодама добавляют 2 - 3 капли раствора Люголя. При разложении
крахмала среда не окрашивается.
Определение протеолитических свойств.
В столбик желатины уколом засевают 18-часовую культуру и
инкубируют в течение 2 - 3 суток при температуре (22 +/- 0,5) ёC или
при (37,0 +/- 0,5) ёC в течение 18 ч. Перед учетом результатов
пробирки помещают в холодильник на 20 мин. При положительном
результате желатина остается жидкой, а при отрицательном (и в
контрольной пробирке) - затвердевает.
Определение образования индола.
Холерные вибрионы при выращивании в средах, содержащих триптофан
(пептонная вода, мясопептонный бульон, бульон Хоттингера и др.),
расщепляют его с образованием индола, что выявляется с помощью
индикаторных бумажек или реактива Эрлиха после инкубирования при
температуре (37,0 +/- 0,5) ёC в течение 18 ч.
Определение образования сероводорода.
Холерные вибрионы не продуцируют фермент тиосульфатредуктазу,
т.е. не способны расщеплять неорганические серосодержащие соединения,
присутствующие в среде Клиглера и маннозосахарозной среде, - это
является дифференциальным признаком. Однако они, так же как некоторые
другие энтеробактерии, продуцируют фермент цистиндесульфогидролазу, за
счет которого способны образовывать сероводород из серосодержащих
аминокислот, присутствующих в достаточном количестве в бульоне
Хоттингера, мясопептонном бульоне, но отсутствующие или содержащиеся в
незначительном количестве в 1-процентной пептонной воде. Поэтому для
постановки этого теста культуры выращивают в 1-процентной пептонной
воде при температуре (37,0 +/- 0,5) ёC в течение 18 - 20 часов.
Образование сероводорода регистрируют с помощью индикаторных бумажек.
Использование микротест-систем и СИБ.
Для определения оксидазы, образования индола и сероводорода,
декарбоксилаз лизина, орнитина, дигидролазы аргинина, ферментации
углеводов и многоатомных спиртов при идентификации вибрионов можно
также использовать Систему индикаторную бумажную (СИБ) и
микротест-системы для биохимической идентификации вибрионов.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ".